Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Nhiễm khuẩn bệnh viện (NKBV) là một trong những thách thức y tế hàng đầu tại Việt Nam và trên thế giới. Theo thống kê được tác giả trích dẫn, tỷ lệ NKBV chiếm khoảng 5–10% tại các nước phát triển và lên tới 25% ở một số nước đang phát triển, đặc biệt tỷ lệ này tăng rất cao tại các khoa Hồi sức tích cực (ICU). Hậu quả của NKBV dẫn tới kéo dài thời gian nằm viện (trung bình 7–14 ngày), làm tăng chi phí điều trị gấp 2–4 lần (tại Anh ước tính khoảng 1 tỷ USD/năm, tại Mỹ từ 28–45 tỷ USD/năm) và gia tăng tỷ lệ tử vong (khoảng 37.000 ca/năm tại Cộng đồng Châu Âu và khoảng 99.000 ca/năm tại Mỹ). Trong các tác nhân vi sinh vật gây NKBV, Tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) và Trực trùng mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) là hai trong sáu tác nhân phổ biến hàng đầu.

Việc chẩn đoán và phát hiện hai loài vi khuẩn này trong thực tế lâm sàng hiện nay chủ yếu dựa vào phương pháp nuôi cấy vi sinh truyền thống. Quy trình này trải qua nhiều công đoạn phức tạp (đồng nhất mẫu, tăng sinh chọn lọc, thử nghiệm hóa sinh), tốn nhiều thời gian và có nguy cơ nhầm lẫn giữa các loài vi sinh vật. Trong khi đó, các kỹ thuật sinh học phân tử như PCR và multiplex PCR có độ nhạy, độ đặc hiệu cao, rút ngắn thời gian chẩn đoán, hỗ trợ kịp thời cho công tác điều trị và kiểm soát nhiễm khuẩn.

Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng được quy trình phát hiện nhanh và đồng thời Tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) và Trực trùng mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) bằng kỹ thuật multiplex PCR.

Nhiệm vụ/Yêu cầu cụ thể của đề tài:

  1. Tách chiết được DNA tổng số của các chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa.
  2. Tối ưu được phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa.
  3. Thử nghiệm thành công phản ứng multiplex PCR trên các mẫu vi khuẩn phân lập tại bệnh viện.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Các chủng vi khuẩn thuần S. aureus và P. aeruginosa lưu giữ tại Phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm; các mẫu vi khuẩn phân lập từ bệnh nhân nhiễm trùng bệnh viện thu thập tại Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên; các chủng vi khuẩn kiểm định đối chứng (Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus capitis, Salmonella typhi, Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae, Hemophilus spp.).
  • Phạm vi không gian: Phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên và Khoa Vi sinh vật, Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên.
  • Phạm vi thời gian: Từ tháng 11 năm 2015 đến tháng 5 năm 2016.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Đề tài dựa trên nguyên lý khuếch đại đồng thời nhiều đoạn gen mục tiêu trong cùng một ống phản ứng nhiệt của kỹ thuật multiplex PCR. Tác giả lựa chọn hai đoạn gen chỉ thị đặc hiệu loài gồm: gen nuc (mã hóa enzyme nuclease chịu nhiệt ở S. aureus) và gen oprL (mã hóa protein màng ngoài peptidoglycan-associated lipoprotein ở P. aeruginosa).

Tên cặp mồi Trình tự nucleotide (5' → 3') Nhiệt độ nóng chảy $T_m$ (°C) Gen mục tiêu Kích thước sản phẩm PCR (bp) Tài liệu tham khảo
NucF
NucR		 TTCAAGTCTAAGTAGCTCAGCA
GCCACGTCCATATTTATCAGTTC		 62
63		 nuc (S. aureus) 439 Nguyễn Văn Duy và cs. (2014)
OPRLF
OPRLR		 ATGGAAATGCTGAAATTCGG
CTTCTTCAGCTCGACGCGAC		 60
66		 oprL (P. aeruginosa) 483 Aghamiri S. và cs.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm đã triển khai:

  • Phương pháp tách chiết DNA: Sử dụng phương pháp hóa chất với chất tẩy rửa cationic Cetyl trimethylammonium bromide (CTAB), có cải tiến dựa trên quy trình của Trần Thị Xuân Mai và cs. (2011). Dịch tế bào vi khuẩn nuôi qua đêm được ly tâm 6.000 vòng/phút trong 30 phút, xử lý với đệm CTAB ở 60°C trong 1 giờ (đảo trộn vortex định kỳ mỗi 10 phút), tách chiết protein và lipid bằng Chloroform : Isoamyl alcohol (CIAA), tủa DNA bằng $CH_3COONa$ 3M (pH 5,5) cùng Isopropanol ở -20°C trong 2 giờ, rửa tủa bằng ethanol 70%, hòa tan trong đệm TE 1X và ủ ở 70°C trong 10 phút.
  • Phương pháp xác định mật độ tế bào: Nuôi cấy tăng sinh trong môi trường lỏng (chứa 2g/100ml peptone, 1g/100ml NaCl) ở 37°C trong 48 giờ, pha loãng dung dịch vi khuẩn đến nồng độ $10^{-7}$, cấy trải 200 µl lên đĩa thạch và đếm số khuẩn lạc (CFU). Mật độ tế bào ban đầu tính theo công thức: $N \text{ (CFU/ml)} = n \times 0,2$ (với $n$ là số khuẩn lạc đếm được ở độ pha loãng $10^{-7}$).
  • Phương pháp tối ưu hóa phản ứng multiplex PCR: Khảo sát các điều kiện phản ứng bao gồm nồng độ muối $MgSO_4$ (1,6 mM; 2,0 mM; 2,4 mM) và nhiệt độ gắn mồi ($53^\circ\text{C}, 55^\circ\text{C}, 57^\circ\text{C}, 59^\circ\text{C}, 61^\circ\text{C}$) trên các phản ứng đơn và phản ứng đa mồi.
  • Phương pháp xác định ngưỡng phát hiện (LOD): Pha loãng DNA tổng số theo bậc 10 (từ $10^{-2}$ đến $10^{-10}$) để tìm nồng độ DNA và mật độ tế bào nhỏ nhất ($CFU/ml$) còn quan sát được vạch điện di rõ ràng trên gel agarose 1,5%.
  • Phương pháp đánh giá độ đặc hiệu: Kiểm tra phản ứng multiplex PCR trên khuôn DNA của các chủng vi khuẩn kiểm định ngoại lai (E. coli, S. epidermidis, S. capitis, S. typhi, S. pneumoniae, K. pneumoniae, Hemophilus spp.).
  • Phương pháp thử nghiệm mẫu lâm sàng: Thực hiện phản ứng multiplex PCR trên các mẫu vi khuẩn phân lập tại Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên và đối chiếu với kết quả nuôi cấy vi sinh truyền thống.

Nội dung chính theo từng chương

Phần 1: Mở đầu

Tác giả trình bày tính cấp thiết của đề tài xuất phát từ thực trạng nhiễm khuẩn bệnh viện gia tăng tỷ lệ tử vong và gánh nặng chi phí y tế tại Việt Nam và toàn cầu. Chương này xác định rõ mục tiêu chế tạo quy trình multiplex PCR nhằm phát hiện đồng thời S. aureus và P. aeruginosa, nêu 3 yêu cầu nghiên cứu, đồng thời khẳng định ý nghĩa khoa học làm tiền đề sản xuất bộ sinh phẩm chẩn đoán (kit) và ý nghĩa thực tiễn phục vụ xét nghiệm lâm sàng nhanh.

Phần 2: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng hợp các tài liệu khoa học về hai đối tượng vi khuẩn và các phương pháp phát hiện:

  • Staphylococcus aureus: Trình bày phân loại sinh học, cấu trúc tế bào Gram dương, độc lực ngoại bào (Coagulase, Hyaluronidase, Hemolysin, Leukocidin, Exfoliatin, 5 loại Enterotoxin từ A đến E, độc tố sốc nhiễm độc TSST-1), cơ chế bám dính và lẩn tránh thực bào thông qua Protein A. Điểm qua các vụ ngộ độc thực phẩm và tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện trong nước và quốc tế.
  • Pseudomonas aeruginosa: Trình bày đặc điểm trực khuẩn Gram âm hiếu khí, khả năng sinh sắc tố Pyocyanin và Pyoverdin, các yếu tố độc lực (Protease Alcaline, Elastase, Hemolysin Phospholipase C, Cytotoxin, Exoenzyme S, Enterotoxin) và tình trạng đa kháng kháng sinh tại các khoa hồi sức tích cực.
  • Các phương pháp phát hiện: Phân tích ưu - nhược điểm của phương pháp vi sinh truyền thống, kỹ thuật miễn dịch (ELISA), kỹ thuật PCR đơn mồi, Realtime PCR và nguyên lý kỹ thuật Multiplex PCR trong việc khuếch đại đồng thời nhiều trình tự đích.

Phần 3: Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết danh mục chủng vi sinh vật, hóa chất sinh học phân tử (Taq DNA polymerase của Biobasic - Canada; thang chuẩn DNA ladder 100bp, dNTPs của Enzynomic - Hàn Quốc; mồi của IDT - Mỹ; CTAB, dung môi hữu cơ của Sigma - Đức) và hệ thống thiết bị (máy PCR Kyratec - Úc, máy điện di Mupid 2 plus - Hàn Quốc). Mô tả chi tiết các bước trong quy trình tách chiết DNA bằng CTAB, công thức thành phần phản ứng multiplex PCR (thể tích 25 µl), chu trình luân nhiệt và các phương pháp đánh giá thực nghiệm.

Phần 4: Kết quả và thảo luận

Chương này công bố toàn bộ dữ liệu thực nghiệm thu được qua các giai đoạn nghiên cứu:

  • Kết quả tách chiết DNA: Điện di 8 chủng S. aureus và 7 chủng P. aeruginosa đều thu được băng DNA tổng số đậm, gọn, không đứt gãy; có xuất hiện vạch mờ RNA do quy trình không dùng enzyme RNase nhưng không ảnh hưởng đến phản ứng PCR tiếp theo.
  • Kết quả kiểm tra mồi và tối ưu hóa phản ứng: Cặp mồi NucF-NucR khuếch đại chính xác phân đoạn 439 bp; cặp mồi OPRLF-OPRLR khuếch đại chính xác phân đoạn 483 bp. Thử nghiệm gradient nhiệt độ và nồng độ ion $Mg^{2+}$ xác định điều kiện tối ưu chung cho cả hai cặp mồi là $MgSO_4$ 2,0 mM và nhiệt độ gắn mồi 59°C.
  • Kết quả phản ứng multiplex PCR: Phản ứng trên hỗn hợp DNA của cả 2 loài tạo ra đồng thời 2 băng kích thước 439 bp và 483 bp rõ nét, tách biệt hoàn toàn, không có sản phẩm phụ.
  • Kết quả độ nhạy (ngưỡng phát hiện): Phản ứng multiplex PCR cho kết quả dương tính rõ ràng đến độ pha loãng $10^{-7}$, tương ứng với ngưỡng phát hiện $2,1 \times 10^2\text{ CFU/ml}$ ($210\text{ CFU/ml}$) đối với S. aureus và $1,3 \times 10^2\text{ CFU/ml}$ ($130\text{ CFU/ml}$) đối với P. aeruginosa.
  • Kết quả độ đặc hiệu: Phản ứng không xuất hiện băng khuếch đại khi thử nghiệm trên 7 chủng vi khuẩn kiểm định đối chứng ngoài mục tiêu.
  • Kết quả thử nghiệm mẫu bệnh viện: Thử nghiệm trên các mẫu phân lập tại Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên ghi nhận khả năng phát hiện chính xác 66,66% (8/12 mẫu) đối với S. aureus và 75,0% (6/8 mẫu) đối với P. aeruginosa.

Phần 5: Kết luận và kiến nghị

Tổng kết 3 kết quả then chốt đạt được theo mục tiêu đề ra và đưa ra 2 kiến nghị về việc áp dụng quy trình cho mẫu thuần cũng như tiếp tục nghiên cứu xử lý trực tiếp trên mẫu bệnh phẩm chưa qua nuôi cấy.

Kết quả và đóng góp

1. Dữ liệu thực nghiệm chính

  • Thành phần phản ứng multiplex PCR tối ưu (tổng thể tích 25 µl):

    • Đệm 10X PCR buffer: 2,5 µl
    • $MgSO_4$ (20 mM): 2,5 µl (nồng độ cuối cùng đạt 2,0 mM)
    • dNTPs (2,5 mM): 2,0 µl
    • Mồi NucF (10 µM): 1,0 µl
    • Mồi NucR (10 µM): 1,0 µl
    • Mồi OPRLF (10 µM): 1,0 µl
    • Mồi OPRLR (10 µM): 1,0 µl
    • Taq DNA polymerase (5 U/µl): 0,2 µl
    • DNA khuôn: 2,5 µl
    • Nước khử ion, không chứa DNase: 11,3 µl

  • Chu trình nhiệt phản ứng multiplex PCR tối ưu:

    • Biến tính ban đầu: 95°C trong 5 phút.
    • Chu kỳ khuếch đại (40 chu kỳ): Biến tính ở 95°C trong 45 giây; Gắn mồi ở 59°C trong 45 giây; Kéo dài mồi ở 72°C trong 45 giây.
    • Kéo dài kết thúc: 72°C trong 5 phút.
    • Bảo quản: 8°C.

  • Ngưỡng phát hiện và độ đặc hiệu:

    • Ngưỡng phát hiện đối với S. aureus: $210\text{ CFU/ml}$.
    • Ngưỡng phát hiện đối với P. aeruginosa: $130\text{ CFU/ml}$.
    • Độ đặc hiệu trên các chủng vi khuẩn chuẩn đạt 100%.

  • Tổng hợp kết quả thử nghiệm trên mẫu lâm sàng tại Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên:

Đối tượng vi khuẩn mục tiêu Số lượng mẫu kiểm tra theo nuôi cấy Số mẫu dương tính bằng Multiplex PCR Tỷ lệ phát hiện chính xác (%) Số mẫu âm tính giả Tỷ lệ âm tính giả (%)
Staphylococcus aureus 12 8 66,66% 4 33,33%
Pseudomonas aeruginosa 8 6 75,00% 2 25,00%
Mẫu vi khuẩn khác (không chứa 2 loài trên) 6 0 (Âm tính) 100,00% 0 0,00%

2. Đóng góp khoa học và ứng dụng thực tiễn

  • Đóng góp khoa học: Thiết lập được hệ thống phản ứng multiplex PCR phối hợp hai cặp mồi đặc hiệu gen nuc và oprL có nhiệt độ $T_m$ tương thích, tạo ra hai phân đoạn khuếch đại có kích thước chênh lệch rõ ràng (439 bp và 483 bp), cho phép phân tách và đọc kết quả thuận lợi trên gel điện di agarose thông thường.
  • Ý nghĩa thực tiễn: Cung cấp quy trình phát hiện nhanh đồng thời hai tác nhân gây nhiễm trùng bệnh viện nguy hiểm với chi phí thấp, rút ngắn đáng kể thời gian xét nghiệm so với phương pháp nuôi cấy vi sinh truyền thống.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế

  • Quy trình tách chiết DNA bằng phương pháp hóa chất sử dụng CTAB chưa bổ sung enzyme RNase nên dịch DNA tách chiết vẫn còn tồn dư RNA tổng số.
  • Tỷ lệ âm tính giả khi thử nghiệm trực tiếp trên các mẫu thu thập tại bệnh viện còn ở mức đáng kể (33,33% đối với S. aureus và 25,0% đối với P. aeruginosa). Tác giả giải thích nguyên nhân là do mật độ tế bào vi khuẩn trong một số mẫu bệnh phẩm chưa đạt ngưỡng phát hiện hoặc trong mẫu có chứa các chất gây ức chế phản ứng enzyme polymerase.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

  • Tiếp tục tối ưu hóa quy trình xử lý mẫu và phản ứng multiplex PCR trực tiếp từ các loại bệnh phẩm lâm sàng khác nhau (mủ, máu, đờm, dịch rửa phế quản) nhằm nâng cao độ nhạy, loại bỏ chất ức chế và giảm tỷ lệ âm tính giả.
  • Hoàn thiện quy trình công nghệ để tiến tới phát triển bộ sinh phẩm (kit) chẩn đoán nhanh phục vụ kiểm soát nhiễm khuẩn tại các cơ sở y tế.

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận có giá trị tham khảo hữu ích cho các nhóm đối tượng sau:

  • Sinh viên, học viên ngành Công nghệ Sinh học, Vi sinh học, Y sinh học: Tham khảo quy trình thiết kế, phối hợp mồi và phương pháp tối ưu hóa phản ứng multiplex PCR đa mục tiêu; phương pháp xác định độ nhạy (LOD) thông qua pha loãng bậc 10 kết hợp đếm khuẩn lạc $CFU/ml$.
  • Kỹ thuật viên xét nghiệm, cán bộ phòng thí nghiệm vi sinh y tế: Tham khảo quy trình tách chiết DNA vi khuẩn bằng phương pháp CTAB cải tiến với chi phí hóa chất thấp, cũng như các thông số chu trình nhiệt để ứng dụng nhận diện nhanh S. aureus và P. aeruginosa.

Câu hỏi thường gặp

1. Khóa luận sử dụng những cặp mồi nào và khuếch đại các đoạn gen mục tiêu có kích thước bao nhiêu? Đề tài sử dụng cặp mồi NucF/NucR đặc hiệu cho gen nuc của Staphylococcus aureus tạo sản phẩm PCR kích thước 439 bp, và cặp mồi OPRLF/OPRLR đặc hiệu cho gen oprL của Pseudomonas aeruginosa tạo sản phẩm PCR kích thước 483 bp.

2. Nồng độ $MgSO_4$ và nhiệt độ gắn mồi tối ưu được xác định trong nghiên cứu là bao nhiêu? Qua khảo sát thực nghiệm các mức nồng độ $MgSO_4$ (1,6 mM; 2,0 mM; 2,4 mM) và dải nhiệt độ gắn mồi (53°C đến 61°C), điều kiện tối ưu được lựa chọn cho phản ứng multiplex PCR là nồng độ $MgSO_4$ đạt 2,0 mM và nhiệt độ gắn mồi là 59°C.

3. Ngưỡng phát hiện thấp nhất (LOD) của phản ứng multiplex PCR trong nghiên cứu đạt mức nào? Phản ứng multiplex PCR phát hiện được DNA ở độ pha loãng tối đa $10^{-7}$, tương ứng với mật độ tế bào vi khuẩn tối thiểu là $210\text{ CFU/ml}$ đối với Staphylococcus aureus và $130\text{ CFU/ml}$ đối với Pseudomonas aeruginosa.

4. Kết quả thử nghiệm trên mẫu lâm sàng tại Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên đạt độ chính xác ra sao? Trên các mẫu vi khuẩn phân lập từ bệnh viện, phản ứng multiplex PCR phát hiện chính xác 8/12 mẫu chứa S. aureus (tỷ lệ 66,66%, có 4 mẫu âm tính giả) và 6/8 mẫu chứa P. aeruginosa (tỷ lệ 75,0%, có 2 mẫu âm tính giả). Toàn bộ các mẫu không chứa hai loài vi khuẩn này đều cho kết quả âm tính chính xác (100%).

5. Tại sao trên ảnh điện di sản phẩm tách chiết DNA tổng số lại xuất hiện các băng mờ ở cuối đường chạy? Các băng mờ ở cuối đường chạy điện di là RNA tổng số của vi khuẩn. Hiện tượng này xuất hiện do trong quy trình tách chiết bằng hóa chất CTAB, tác giả không sử dụng enzyme RNase để thủy phân RNA; tuy nhiên lượng RNA này không gây ảnh hưởng đến hiệu quả khuếch đại của phản ứng PCR.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Nguyễn Khắc Khánh đã xây dựng thành công quy trình multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời hai tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện phổ biến là Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa. Quy trình sử dụng hai cặp mồi đặc hiệu gen nuc (439 bp) và oprL (483 bp) với điều kiện tối ưu tại $MgSO_4$ 2,0 mM và nhiệt độ gắn mồi 59°C, đạt độ đặc hiệu 100% trên chủng thuần và ngưỡng phát hiện lần lượt là $210\text{ CFU/ml}$ và $130\text{ CFU/ml}$. Mặc dù thử nghiệm trên mẫu phân lập lâm sàng tại Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên còn ghi nhận tỷ lệ âm tính giả nhất định, công trình đã hoàn thành toàn diện các mục tiêu đề ra và tạo cơ sở thực nghiệm quan trọng cho việc phát triển các bộ kit chẩn đoán phân tử trong y tế.