Đặt vấn đề Nhiễm khuẩn bệnh viện (NKBV) là một trong những thách thức và mối tuân tâm hàng đầu tại Việt Nam cũng như trên toàn thế giới. Những nghiên cứu gần đây cho thấy NKBV làm tăng tỷ lệ tử vong, kéo dài thời gian nằm viện, tăng việc sử dụng kháng sinh, tăng đề kháng kháng sinh và tăng chi phí điều trị. Thống kê cho thấy tỷ lNKBV khoảng 5-10% các nước phát triển và ở một số nước đang phát triển tỷ lệ này lên đến 25% [30] và tỷ lệ này còn cao hơn ở các khoa Hồi Sức Tích Cực. NKBV cũng làm gia tăng tỷ lệ tử vong bệnh viện.
Tại Cộng đồng Châu Âu, tỷ lệ tử vong do nhiễm trùng bệnh viện là 37.000 ca/năm [14] , còn tại Mỹ tỷ lệ này lên tới 99. Các bệnh nguyên gây NKBV có mức độ đề kháng kháng sinh cao hơn với các bệnh nguyên gây nhiễm khuẩn cộng đồng, đồng thời các NKBV có thời gian nằm viện trung bình dài hơn, từ 7-14 ngày. Do đó, chi phí cho NKBV thường tăng gấp 2-4 lần so với các trường hợp không NKBV. Chi phí phát sinh do NKBV tại Anh quốc là khoảng 1 tỷ USD còn tại Mỹ là 28-45 tỷ USD[11].
Staphylococcsu aureus và Pseudomonas aeruginosa đang là hai trong 6 tác nhân gây nhiễm trùng bệnh viện phổ biến hiện nay. Ngoài ra việc thực hiện các quy trình phát hiện S. aeruginosa chủ yếu hiện nay bằng phương pháp vi sinh. Phương pháp này thực hiện phức tạp qua nhiều công đoạn nuôi cấy và kiểm tra sản phẩm thu được gặp khó khăn và có khả năng nhầm lẫn các loại vi sinh vật với nhau.
Trong khi đó việc xác định nhanh và chính xác loại vi sinh vật góp phần giảm nguyên nhân lây lan trong cộng đồng. Với trình độ khoa học kỹ thuật ngày càng hiện đại kéo theo đó con người ngày càng am hiểu hơn và giải thích rõ ràng các quan điểm và kỹ thuật về n 2 sinh học phân tử. Qua đây việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử vào các lĩnh vực của đời sống ngày càng rộng rãi, đặc biệt sinh học phân tử đã và đang được ứng dụng mạnh mẽ vào lĩnh vực y khoa mang lại chẩn đoán chính xác và nhanh chóng xác định đúng vi sinh vật gây bệnh. Một số kỹ thuật sinh học phân tử được ứng dụng rộng rãi như : kỹ thuật PCR, kỹ thuật multiplex PCR, ELISA.trong đó kỹ thuật PCR với độ đặc hiệu cao và thời gian cho kết quả nhanh chóng đã được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau.
Xuất phát từ tình hình thực tiễn và dựa trên điều kiện cơ sở vật chất của khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên tôi tiến hành thực hiện đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời Tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) và Trực trùng mủ xanh (Psedomonas aeruginosa). Mục tiêu và yêu cầu đề tài 1. Mục tiêu của đề tài Xây dựng được quy trình phát hiện nhanh và đồng thời Tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) và Trực trùng mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) bằng kỹ thuật multiplex PCR. Yêu cầu của đề tài: - Tách chiết được DNA tổng số của các chủng vi khuẩn S.
- Tối ưu được phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời S. aeruginosa - Thử nghiệm thành công phản ứng multiplex PCR trên các mẫu vi khuẩn phân lập tại Bệnh viện. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu là tiền đề cho việc xây dựng bộ kít phát hiện nhanh và đồng thời tụ cầu vàng (S. aureus) và trực trùng mủ xanh (P.
Ý nghĩa thực tiễn Kết quả nghiên cứu có thể được ứng dụng vào công việc chẩn đoán nhanh sự nhiễm trùng S. aeruginosa trong lĩnh vực y tế. n 4 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Giới thiệu chung về Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa 2.
Giới thiệu chung về Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus lần đầu tiên được Scotland Alexander Ogston đề cập đến tại Hội nghị lần thứ 9 Hội phẫu thuật Đức năm 1881. Staphylococcus aureus lần đầu tiên được phân lập và phát hiện bởi Robert Koch năm 1878 từ mủ ung nhọt. Đến năm 1926, Julius von Daranyi đã hiện ra sự tương quan giữa khả năng gây bệnh của S. aureus với sự có mặt của enzyme coagulase huyết tương của vi khuẩn [1].
Danh pháp, phân loại Staphylococcus aureus thuộc giới Eubacteria, ngành Firmicutes, lớp Bacilli, bộ Bacillales, họ Staphylococcaceae, chi Staphylococcus, loài Staphylococcus aureus tên khoa học là Staphylococcus aureus [36] ưStaphylococcus aureus được phân loại chủ yếu theo hai cách sau: - Dựa vào kháng nguyên: dựa vào hiện tượng ngưng kết với huyết thanh, các nhà khoa học đã chia S. aureus thành 18 kiểu huyết thanh. Ngoài ra, có thể dựa vào phương pháp miễn dịch học để chia S. aureus thành kháng nguyên polysaccharide A ở vách và kháng nguyên protein ở ngoài vách.
- Dựa vào sự xâm nhiễm đặc hiệu của phage, S. aureus được chia thành các nhóm sau: Nhóm I gồm các kiểu huyết thanh 29, 52, 52A, 79 và 80; nhóm II gồm các kiểu huyết thanh 3A, 3B, 3C, 55và 71; Nhóm III: gồm các kiểu huyết thanh 6, 7, 42E, 47, 53, 54, 75, 77, 83A, 84 và 85; và nhóm IV chỉ có 1 kiểu huyết thanh 42D [37]. Hình thái và cấu tạo của Staphylococcus aureus Staphylococcus là những vi khuẩn Gram dương hình cầu và không di động với đường kính khoảng 0,5-1,5μm. Tế bào Staphylococcus xếp hình chùm nho không di động , vi khuẩn này có thành tế bào kháng với lysozyme và khá nhạy với lysotaphin, ngoài ra vi khuẩn này không sinh bào tử và cư trú trên da và màng nhày của con người cũng như động vật máu nóng [37].
Hình ảnh hiển tế bào Staphylococcus aureus (Nguồn: Wikipedia (https://vi.org/wiki/Staphylococcus_aureus)) Ngày nay các nhà khoa học đã thành công trong việc giải trình tự gen của các chủng tụ cầu vàng được ký hiệu như sau: Newman, COL, UMRSA252, MW2, MSSA476, N315, Mu50, RF122. Steven cùng cộng sự đã giải trình tự thành công bộ gen của chủng S.aureus COL với kích thước 2809422 bp, kết quả này đã được đăng ký trên Genbank với mã số : CP000046.1 cho hệ gen và CP000045 cho hệ gen plasmid. Theo kết quả này thì bộ gen của S. aureus có chứa ít các cặp G-C điều này đã làm nảy sinh mối lo ngại về sự chuyển gen giữa tụ cầu vàng và các tác nhân gây bệnh gram dương khác [41] Trong số các chủng S.aureus phân lập từ các mẫu thực phẩm, tỷ lệ chủng có khả năng sản sinh nội độc tố enterotoxin do nhóm gen n 6 SE mã hóa được ước tính chiếm khoảng 25% số chủng, tại Pháp trong số 332 chủng S.aureus được phân lập từ thức ăn có 57% chủng có chứa các gen mã hóa nội độc tố SEG, SEB, SEI, SEJ suất hiện với tần số cao hơn hẳn chủng chứa gen nội độc tố SEA và SEE mà trước đây vốn được xem là chiếm ưu thế [32].
Đặc điểm sinh học của Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus là vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy nghi, có enzyme catalase phân giải hydro peroxid (H2O2), giải phóng oxy và nước theo phản ứng sau: Catalase H2O2 H2O + O2 Ngoài ra, S. aureus cho phản ứng đông huyết tương dương tính do chúng tiết ra enzyme coagulase. Có thể xem việc S. aureus có phản ứng đông huyết tương là tính chất đặc trưng của S.
aureus, cũng là tiêu chuẩn để phân biệt S.aureus với các tụ cầu khác. Có hai dạng coagulase: coagulase “cố định” (“bound” coagulase) gắn vào thành tế bào và coagulase “tự do” (“free” coagulase) được phóng thích ra ngoài thành tế bào. Có hai phương pháp để thực hiện kiểm tra coagulase là thử nghiệm trên lam kính và trong ống nghiệm. Phương pháp lam kính giúp phát hiện những coagulase “cố định” do phản ứng trực tiếp với fibrinogen, phương pháp ống nghiệm phát hiện những coagulase “tự do” do phản ứng dán tiếp với fibrinogen qua cộng hợp với những yếu tố khác trong huyết tương [27].aureus còn phản ứng với DNase, phosphatase dương tính, có thể lên men và sinh axit từ manitol, trehalose, sucrose.
Tất cả các dòng S.aureus đều nhạy với Novobicine(kháng sinh có thành phần là spiramycin), có thể tăng trưởng trong môi trường chứa đến 15% muối NaCl [27].Trên môi trường BP (Baird Parker), khuẩn lạc của S.aureus có mầu đen nhánh, bóng, lồi, đường kính 1-1,5mm, quanh khuẩn lạc có vòng sáng rộng 25mm ( do khả năng khử potassium tellurite (K2TeO3) và khả năng thủy phân lòng đỏ trứng của enzyme lethinase) [27]. Trên môi trường MSA (Manitol salt n 7 agar), khuẩn lạc của S.aureus tròn, bờ đều và lồi, màu vàng nhạt đến vàng đậm và làm vàng môi trường xung quanh khuẩn lạc (do lên men đường manitol) [27].Đặc tính và các yếu tố độc lực Trên lâm sàng việc phân biệt các chủng tụ cầu có khả năng gây bệnh và không gây bệnh thường dựa vào sự hiện diện của enzyme Coagulase, enzyme này gắn với prothrompin trong huyết tương và hoạt tính hóa quá trình sinh fibrin từ tiền chất fibinogen. Enzyme này cùng với yếu tố kết cụm( clumping) một enzyme vách vi khuẩn giúp tụ cầu vàng tạo kết tủa fibrin trên bề mặt của nó. Tính chất này là yếu tố bệnh sinh cực kỳ quan trongjvaf yếu tố cũng đóng vai trò quan trọng trong chẩn đoán.
Tụ cầu vàng còn sản xuất nhiều yếu tố độc tố độc lực khác có liên quan đến cấu tạo của vách vi khuẩn như : Vỏ polysaccharide: một số chủng tụ cầu vàng có thể tạo vỏ polysaccharide vỏ này cùng với protein A có chức năng bảo vệ tế bào vi khuẩn chống lại hiện tượng thực bào. Hầu hết các chủng tụ cầu vàng đều có khả năng tổng hợp một loại protein bề mặt có khả năng gắn với mảnh thụ thể (Fc) của các glubuline miễn dịch, chính nhờ hiện tượng này mà số lượng mảnh Fc giảm xuống. Vì mảnh Fc của các globuline miễn dịch có vai trò trong hiện tượng opsonin hóa chúng là các receptor cho các đại thực bào. Qúa trình gắn trên giúp tụ cầu vàng tránh tránh không bị thực bào Ngoài ra phần lớn các chủng tụ cầu vàng đều có khả năng sản xuất một chất kết dính gian bào , nhờ chất này vi khuẩn tạo được một lớp màng sinh học bao phủ chính nó và vi khuẩn có thể phát triển trong lớp màng nhầy niêm mạc.
Các yếu tố độc lực ngoại bào, tụ cầu vàng còn sản sinh một số enzyme quan trọng góp phần tạo nên độc lực mạnh mẽ của chủng vi khuẩn này như: n 8 Hyaluronidase: enzyme này có khả năng phá hủy chất cơ bản của tổ chức giúp vi khuẩn có thể phát tán trong tổ chức Hemolysine và leukocidine: phá hủy hồng cầu và gây chết các tế bào hạt cũng như tế bào bạch cầu.