Luận án tiến sĩ xác định một số đặc điểm vi sinh của escherichia coli sinh beta lactamase phổ mở rộng ở người khỏe mạnh tại cộng đồng huyện vũ thư tỉnh thái bình

Luận án tiến sĩ nghiên cứu đặc điểm vi sinh của Escherichia coli sinh beta-lactamase phổ mở rộng ở người khỏe mạnh tại huyện Vũ Thư, tỉnh Thái Bình.

• Tác giả: Khổng Thị Điệp
• Người hướng dẫn: PGS.TS Hoàng Thị Thu Hà
• Trường học: Trường Đại học Y Dược Thái Bình
• Chuyên ngành: Vi sinh y học
• Đề tài: Nghiên cứu đặc điểm vi sinh của E. coli sinh beta-lactamase ở người khỏe mạnh tại Vũ Thư, Thái Bình
• Loại tài liệu: luận án
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Thái Bình

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• MỤC LỤC
• DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tình hình nhiễm và kháng kháng sinh của E. coli sinh β-lactamase phổ mở rộng ở người
• 1.1.1. Tình hình nhiễm E. coli sinh β-lactamase phổ mở rộng ở người
• 1.1.1.1. Trên thế giới
• 1.1.1.1.a. Trong bệnh viện
• 1.2. Một số đặc điểm và phương pháp nghiên cứu E. coli sinh ESBL
• 1.2.1. Đặc điểm sinh học
• 1.2.2. Đặc điểm và sự lưu hành các ESBL và các gen mã hóa sinh ESBL
• 1.2.3. Đặc điểm phân nhóm phát sinh loài (phylogenetic group)
• 1.2.4. Đặc điểm gây bệnh của vi khuẩn E. coli trên người
• 1.2.5. Khả năng lan truyền vi khuẩn E. coli sinh ESBL
• 1.2.6. Các phương pháp nghiên cứu E. coli sinh ESBL
• 2. CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 2.1.1. Địa điểm nghiên cứu
• 2.1.2. Thời gian nghiên cứu
• 2.1.3. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu
• 2.2.2. Phương pháp chọn mẫu và tính cỡ mẫu
• 2.2.3. Các biến số và chỉ số nghiên cứu
• 2.3. Vật liệu nghiên cứu
• 2.4. Các kỹ thuật áp dụng trong nghiên cứu
• 2.4.1. Kỹ thuật lấy mẫu phân
• 2.4.2. Kỹ thuật nuôi cấy, phân lập E. coli từ mẫu phân
• 2.4.3. Kỹ thuật định danh vi khuẩn E.
• 2.4.4. Kỹ thuật xác định kiểu hình ESBL của các chủng E.
• 2.4.5. Kỹ thuật xác định đặc điểm kháng kháng sinh của E. coli sinh ESBL
• 2.4.6. Kỹ thuật xác định gen mã hóa sinh ESBL của E. coli sinh ESBL
• 2.4.7. Kỹ thuật xác định gen mcr-1 kháng colistin của E. coli sinh ESBL
• 2.4.8. Kỹ thuật xác định đặc điểm phân nhóm phát sinh loài của các chủng E. coli sinh ESBL
• 2.4.9. Kỹ thuật xác định gen độc lực của vi khuẩn E. coli sinh ESBL
• 2.4.10. Phân tích mối liên hệ kiểu gen bằng kỹ thuật PFGE
• 2.4.11. Kỹ thuật xác định các loại plasmid của các chủng E. coli sinh ESBL
• 2.4.12. Xác định vị trí các gen mã hóa sinh ESBL bằng phương pháp Southern Blot
• 2.4.13. Đánh giá khả năng truyền các gen mã hóa sinh ESBL của các chủng E. coli sinh ESBL trong mô hình phòng thí nghiệm bằng phương pháp tiếp hợp
• 2.5. Phương pháp xử lý số liệu
• 2.6. Biện pháp khống chế sai số
• 2.7. Đạo đức nghiên cứu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Sự lưu hành của vi khuẩn E. coli sinh ESBL trong mẫu phân người khỏe mạnh tại cộng đồng nông thôn tỉnh Thái Bình
• 3.1.1. Đặc điểm của đối tượng xét nghiệm
• 3.1.2. Sự lưu hành của vi khuẩn E. coli sinh ESBL trong mẫu phân người khỏe mạnh
• 3.1.3. Đặc điểm sinh học của các chủng E. coli sinh ESBL
• 3.1.4. Đặc điểm sinh vật, hóa học của các chủng E. coli sinh ESBL
• 3.1.5. Đặc điểm kháng kháng sinh của các chủng E. coli sinh ESBL
• 3.1.6. Đặc điểm các gen mã hóa sinh ESBL ở các chủng E. coli sinh ESBL
• 3.1.7. Đặc điểm phân nhóm phát sinh loài của các chủng E. coli sinh ESBL
• 3.1.8. Đặc điểm các gen độc lực trong các chủng E. coli sinh ESBL
• 3.1.9. Mối liên hệ kiểu gen giữa các chủng E. coli sinh ESBL
• 3.1.10. Phân tích đặc điểm plasmid của các chủng E. coli sinh ESBL
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• 4.1. Sự lưu hành của vi khuẩn E. coli sinh ESBL trong mẫu phân người khỏe mạnh tại cộng đồng nông thôn tỉnh Thái Bình
• 4.1.1. Đặc điểm của đối tượng xét nghiệm
• 4.1.2. Sự lưu hành của E. coli sinh ESBL trong mẫu phân người khỏe mạnh
• 4.1.3. Đặc điểm sinh học của các chủng E. coli sinh ESBL
• 4.1.4. Đặc điểm sinh vật, hóa học của các chủng E. coli sinh ESBL
• 4.1.5. Đặc điểm kháng kháng sinh của các chủng E. coli sinh ESBL
• 4.1.6. Đặc điểm các gen mã hóa sinh ESBL ở các chủng E. coli sinh ESBL
• 4.1.7. Đặc điểm phân nhóm phát sinh loài của các chủng E. coli sinh ESBL
• 4.1.8. Đặc điểm các gen độc lực của các chủng E. coli sinh ESBL
• 4.1.9. Mối liên hệ kiểu gen giữa các chủng E. coli sinh ESBL
• 4.1.10. Phân tích đặc điểm plasmid của các chủng E. coli sinh ESBL
• 4.1.11. Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp theo
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Giới thiệu và mục tiêu nghiên cứu

Nghiên cứu tập trung vào đặc điểm vi sinh của E. coli sinh beta-lactamase (ESBL) ở người khỏe mạnh tại Vũ Thư, Thái Bình. Mục tiêu chính là xác định sự lưu hành và đặc điểm sinh học của các chủng E. coli sinh ESBL trong cộng đồng. Nghiên cứu này nhằm cung cấp cơ sở khoa học cho việc giám sát và phòng ngừa sự lây lan của vi khuẩn kháng kháng sinh.

1.1. Bối cảnh và tầm quan trọng

E. coli là vi khuẩn phổ biến trong đường ruột, nhưng cũng là tác nhân gây bệnh quan trọng. Beta-lactamase là enzyme giúp vi khuẩn kháng lại các kháng sinh nhóm beta-lactam. Sự xuất hiện của E. coli sinh ESBL trong cộng đồng là mối đe dọa lớn đối với sức khỏe cộng đồng, đặc biệt là ở các khu vực nông thôn như Vũ Thư, Thái Bình.

1.2. Mục tiêu cụ thể

Nghiên cứu nhằm xác định tỷ lệ lưu hành của E. coli sinh ESBL và phân tích các đặc điểm sinh học của chúng, bao gồm khả năng kháng kháng sinh, gen mã hóa ESBL, và đặc điểm phân nhóm phát sinh loài.

II. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng phương pháp lấy mẫu phân từ người khỏe mạnh tại Vũ Thư, Thái Bình. Các mẫu được nuôi cấy, phân lập và xác định E. coli sinh ESBL thông qua các kỹ thuật vi sinh và phân tử. Các đặc điểm kháng kháng sinh và gen mã hóa ESBL được phân tích chi tiết.

2.1. Đối tượng và địa điểm nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện trên người khỏe mạnh tại Vũ Thư, Thái Bình. Đây là khu vực nông thôn, nơi có nguy cơ cao về sự lây lan của vi khuẩn kháng kháng sinh do điều kiện vệ sinh và sử dụng kháng sinh không hợp lý.

2.2. Kỹ thuật phân tích

Các kỹ thuật bao gồm nuôi cấy, phân lập E. coli, xác định kiểu hình ESBL, và phân tích gen mã hóa ESBL bằng PCR. Ngoài ra, nghiên cứu còn sử dụng kỹ thuật PFGE để phân tích mối liên hệ kiểu gen giữa các chủng vi khuẩn.

III. Kết quả nghiên cứu

Kết quả cho thấy tỷ lệ lưu hành của E. coli sinh ESBL trong cộng đồng là đáng kể. Các chủng vi khuẩn này có khả năng kháng đa kháng sinh và mang nhiều gen mã hóa ESBL. Đặc điểm phân nhóm phát sinh loài cho thấy sự đa dạng di truyền của các chủng E. coli.

3.1. Tỷ lệ lưu hành

Tỷ lệ E. coli sinh ESBL trong mẫu phân của người khỏe mạnh tại Vũ Thư, Thái Bình là cao, phản ánh sự phổ biến của vi khuẩn kháng kháng sinh trong cộng đồng.

3.2. Đặc điểm kháng kháng sinh

Các chủng E. coli sinh ESBL kháng lại nhiều loại kháng sinh, bao gồm cephalosporin thế hệ ba và các kháng sinh phổ rộng khác. Điều này làm tăng nguy cơ điều trị thất bại trong các bệnh nhiễm khuẩn.

3.3. Đặc điểm gen mã hóa ESBL

Các gen mã hóa ESBL như blaCTX-M, blaTEM, và blaSHV được phát hiện phổ biến trong các chủng E. coli. Điều này cho thấy sự lan truyền rộng rãi của các gen kháng kháng sinh trong cộng đồng.

IV. Bàn luận và kết luận

Nghiên cứu này cung cấp cái nhìn toàn diện về sự lưu hành và đặc điểm của E. coli sinh ESBL trong cộng đồng Vũ Thư, Thái Bình. Kết quả nhấn mạnh sự cần thiết của việc giám sát và kiểm soát vi khuẩn kháng kháng sinh tại cộng đồng, đặc biệt là ở các khu vực nông thôn.

4.1. Ý nghĩa thực tiễn

Nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong việc thiết lập các chính sách giám sát và phòng ngừa sự lây lan của vi khuẩn kháng kháng sinh. Đồng thời, nó cung cấp dữ liệu quan trọng cho các nghiên cứu tiếp theo về vi sinh lâm sàng và kháng sinh.

4.2. Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp theo

Nghiên cứu này chỉ tập trung vào một khu vực cụ thể, do đó cần mở rộng phạm vi nghiên cứu để có cái nhìn tổng thể hơn. Các nghiên cứu tiếp theo nên tập trung vào cơ chế lan truyền gen kháng kháng sinh và các biện pháp can thiệp hiệu quả.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Vấn đề vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh đang diễn biến nghiêm trọng trên phạm vi toàn cầu, đe dọa trực tiếp đến hiệu quả phòng và điều trị các bệnh lý nhiễm khuẩn ở người. Trong các cơ chế kháng thuốc của trực khuẩn Gram âm thuộc họ Enterobacteriaceae, đặc biệt là vi khuẩn Escherichia coli (E. coli), việc sản sinh enzyme beta-lactamase phổ mở rộng (Extended-Spectrum Beta-Lactamase - ESBL) là cơ chế thường gặp và nguy hiểm. Enzyme ESBL thủy phân liên kết amide của vòng beta-lactam, làm mất hoạt lực của các kháng sinh thuộc nhóm penicillin, cephalosporin thế hệ 3, thế hệ 4 và monobactam. Bên cạnh đó, các plasmid mang gen sinh ESBL thường tích hợp đồng thời nhiều gen kháng các nhóm kháng sinh khác (aminoglycoside, fluoroquinolone, trimethoprim/sulfamethoxazole), dẫn đến hiện tượng kháng đa thuốc (multidrug resistance - MDR) và có khả năng lan truyền ngang cho các vi khuẩn khác trong cùng loài hoặc các vi khuẩn gây bệnh đường ruột khác như Salmonella, Shigella.

Theo tác giả Khổng Thị Điệp (2020), phần lớn các công trình nghiên cứu về E. coli sinh ESBL tại Việt Nam trước đây chủ yếu tập trung vào các chủng vi khuẩn phân lập từ bệnh phẩm lâm sàng của bệnh nhân nội trú trong môi trường bệnh viện. Những dữ liệu khoa học về tỷ lệ mang vi khuẩn, mức độ đề kháng kháng sinh và đặc điểm sinh học phân tử (kiểu gen mã hóa ESBL, gen kháng colistin mcr-1, nhóm phát sinh loài, gen độc lực, mối liên hệ dòng và đặc điểm plasmid) của các chủng E. coli sinh ESBL ở người khỏe mạnh tại cộng đồng nông thôn còn rất hạn chế. Khoảng trống nghiên cứu này đòi hỏi phải có một khảo sát toàn diện nhằm thiết lập cơ sở khoa học cho công tác giám sát dịch tễ học và phòng ngừa lây nhiễm vi khuẩn kháng thuốc từ cộng đồng.

Luận án xác định hai mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

1. Xác định sự lưu hành của Escherichia coli sinh beta-lactamase phổ mở rộng ở người khỏe mạnh tại cộng đồng, huyện Vũ Thư, tỉnh Thái Bình, năm 2016.
2. Xác định một số đặc điểm sinh học của các chủng Escherichia coli sinh beta-lactamase phổ mở rộng phân lập được từ người khỏe mạnh tại cộng đồng.

Phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Các chủng E. coli sinh ESBL phân lập từ mẫu phân của người khỏe mạnh sinh sống tại cộng đồng.
• Địa bàn nghiên cứu: Xã Nguyên Xá, huyện Vũ Thư, tỉnh Thái Bình. Đây là xã đồng bằng nông thôn điển hình, diện tích tự nhiên 640 ha, dân số 7.730 người với 2.008 hộ gia đình (1.962 hộ y tế), chia làm 4 thôn (Ngô Xá, Kiến Xá, Thôn Thái, Hoàng Xá) và 13 đội. Cơ cấu kinh tế chủ yếu là trồng trọt, chăn nuôi gia trại và nghề mộc truyền thống; mạng lưới y tế gồm 1 trạm y tế xã, 5 đại lý thuốc và 1 hiệu thuốc thú y.
• Thời gian nghiên cứu: Năm 2016. Các phân tích vi sinh và sinh học phân tử chuyên sâu được tiến hành tại Trung tâm Dịch vụ Khoa học Kỹ thuật Y Dược - Trường Đại học Y Dược Thái Bình, Khoa Vi khuẩn - Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương và Viện Y tế Công cộng phủ Osaka (Nhật Bản).

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án hệ thống hóa các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến sự lưu hành và đặc tính kháng thuốc của vi khuẩn E. coli sinh ESBL ở hai khu vực: bệnh viện và cộng đồng.

Các công trình nghiên cứu trên thế giới

Ở môi trường bệnh viện, chương trình giám sát kháng sinh toàn cầu SMART (2002–2011) thực hiện tại 179 bệnh viện chỉ ra E. coli là căn nguyên hàng đầu gây nhiễm khuẩn ổ bụng (47,8%) và nhiễm khuẩn tiết niệu (44,3%). Tỷ lệ vi khuẩn sinh ESBL trong nhiễm khuẩn ổ bụng đạt 20% - 40% tại châu Á, Mỹ Latinh và Trung Đông. Báo cáo năm 2012 của Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa Bệnh tật Châu Âu (ECDC) ghi nhận tỷ lệ sinh ESBL ở các chủng E. coli kháng cephalosporin thế hệ 3 tại 23 quốc gia dao động từ 70,5% đến 100%, trong đó Hungary, Lithuania và Romania đạt 100%. Khảo sát SMART năm 2007 tại khu vực châu Á - Thái Bình Dương ghi nhận tỷ lệ E. coli sinh ESBL cao tại Ấn Độ (79%), Trung Quốc (55%), Thái Lan (50,8%) và Việt Nam (34,4%). Nghiên cứu của Villegas và cộng sự (2011) tại 23 trung tâm thuộc 10 nước Mỹ Latinh cho thấy tỷ lệ kháng cefepime, cefotaxime và ceftriaxone của E. coli sinh ESBL vượt trên 90%. Tại châu Phi, nghiên cứu của Sangare và cộng sự tại Mali ghi nhận 64,5% các chủng E. coli phân lập từ máu sinh ESBL.

Tại cộng đồng, vi khuẩn E. coli sinh ESBL được phát hiện ngày càng nhiều trên người khỏe mạnh:

• Geser và cộng sự (2013) tại Thụy Sĩ: tỷ lệ mang E. coli sinh ESBL ở người khỏe mạnh là 5,8% (n=586).
• Nicolas-Chanoine (2011) tại Pháp: tỷ lệ mang E. coli sinh ESBL ở người trưởng thành khỏe mạnh tại Paris tăng từ 0,6% (năm 2006) lên 6,0% (năm 2011).
• Valenza (2014) tại Đức: tỷ lệ sinh ESBL trong cộng đồng là 6,3% (n=3.344).
• Li B. (2009) tại Trung Quốc: ghi nhận 50,5% người khỏe mạnh mang E. coli sinh ESBL trong phân.
• Sasaki (2008) tại vùng nông thôn Thái Lan: tỷ lệ mang vi khuẩn sinh ESBL là 61,7%, trong đó E. coli chiếm 85,1%.
• Nghiên cứu tại Tunisia (2009–2010): 7,3% người tình nguyện khỏe mạnh mang chủng này trong đường tiêu hóa.

Các công trình nghiên cứu tại Việt Nam

Trong các cơ sở y tế, số liệu của Chương trình quốc gia giám sát độ nhạy cảm kháng sinh (ASTS) giai đoạn 2002–2006 và báo cáo Bộ Y tế năm 2004 cho thấy tỷ lệ E. coli sinh ESBL dao động từ 7,7% đến trên 50% tùy quy mô bệnh viện.

Bệnh viện / Cơ sở nghiên cứu	Thời gian	Tỷ lệ E. coli sinh ESBL (%)	Nguồn tài liệu
Bệnh viện Chợ Rẫy	2004	51,6%	ASTS (Bộ Y tế)
Bệnh viện Bình Định	2004	36,2%	ASTS (Bộ Y tế)
Bệnh viện Việt Tiệp	2004	36,1%	ASTS (Bộ Y tế)
Bệnh viện Việt Đức	2004	34,2%	ASTS (Bộ Y tế)
Bệnh viện Bạch Mai	2005	18,5%	ASTS (Bộ Y tế)
Bệnh viện Bạch Mai	2006	21,5%	ASTS (Bộ Y tế)
Bệnh viện Bạch Mai	2007	41,2%	ASTS (Bộ Y tế)
Bệnh viện Bạch Mai	2008	42,2%	ASTS (Bộ Y tế)
Bệnh viện ĐHYD TP. Hồ Chí Minh	2008	71,2% (trong nhóm sinh ESBL)	Hoàng Thị Phương Dung [6]
Bệnh viện Trung ương Huế	2008	Chiếm ưu thế ở mẫu mủ (44,61%)	Mai Văn Tuấn [23]
Bệnh viện 103, Hà Nội	2007–2009	32,43%	Nguyễn Thái Sơn [18]
Bệnh viện Đa khoa TW Thái Nguyên	2012–2013	39,53%	Nguyễn Đắc Trung [21]
Bệnh viện Nhi Đồng Cần Thơ	2013	78,0% (ở trẻ tiêu chảy)	Hà Vũ Minh Trang [19]

Tại cộng đồng Việt Nam, Lê Kim Ngọc Giao ghi nhận tỷ lệ người lành mang vi khuẩn đường ruột sinh ESBL là 53,7% (E. coli chiếm 82%), với tỷ lệ cao ở nhân viên y tế (70,7%) và người nhà nhân viên y tế (69,2%). Nguyễn Đỗ Phúc (2013) tại TP. Hồ Chí Minh ghi nhận 63,1% người khỏe mạnh mang Enterobacteriaceae sinh ESBL (E. coli chiếm 63%). Tác giả Bùi Mai Hương và cộng sự ghi nhận tỷ lệ người khỏe mạnh mang E. coli sinh ESBL tại huyện Ba Vì (Hà Nội) là 46,2%.

Khoảng trống nghiên cứu luận án lựa chọn

Mặc dù một số nghiên cứu tại Việt Nam đã bước đầu phát hiện tỷ lệ mang vi khuẩn sinh ESBL tương đối cao ở người khỏe mạnh, phần lớn các công trình dừng lại ở việc nuôi cấy phân lập và làm kháng sinh đồ thông thường. Rất ít nghiên cứu tiến hành khảo sát dịch tễ học thực địa kết hợp phân tích sâu đặc điểm vi sinh học phân tử trên cùng một quần thể cộng đồng nông thôn. Luận án giải quyết khoảng trống này bằng cách phân tích đồng bộ: sự lưu hành theo đặc điểm hộ gia đình, nhân khẩu học; tính kháng đa thuốc; sự hiện diện của các nhóm gen mã hóa ESBL (blaCTX-M, blaTEM, blaSHV); sự lưu hành của gen kháng colistin mcr-1; phân nhóm phát sinh loài (phylogroups A, B1, B2, D); nhận diện các gen độc lực gây tiêu chảy; mối quan hệ di truyền bằng điện di xung trường (PFGE); và xác định đặc điểm plasmid (nhóm replicon, định vị gen bằng Southern Blot, khả năng truyền gen bằng tiếp hợp in vitro).

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

• Lý thuyết về sinh vật học vi khuẩn E. coli: Trực khuẩn Gram âm, vi khuẩn chỉ điểm vệ sinh đường tiêu hóa, lên men đường (glucose, lactose), sinh indol (+), không sinh H2S, citrate (-). Kháng nguyên O (lipopolysaccharide), H (lông) và K (vỏ).
• Cơ chế đề kháng beta-lactam: Enzyme beta-lactamase làm biến đổi và phá hủy liên kết amide của vòng lactam, ngăn cản sự gắn kết với protein gắn penicillin (PBP). Ba họ ESBL phổ biến nhất gồm:
  • Họ TEM: bắt nguồn từ TEM-1 (phát hiện năm 1960 ở bệnh nhân Temoniera), phát triển qua các đột biến thay thế acid amin ở các vị trí 39, 104, 164, 238, 240 tạo ra hơn 170 biến thể.
  • Họ SHV: bắt nguồn từ SHV-1 (phát hiện đầu tiên ở Klebsiella ozaenae năm 1983 tại Đức), với các đột biến Gly238Ser làm tăng thủy phân ceftazidime và Glu240Lys làm tăng thủy phân cefotaxime, có hơn 126 biến thể.
  • Họ CTX-M: enzyme có hoạt tính thủy phân cefotaxime vượt trội, gen blaCTX-M thường nằm trên plasmid IncF và liên kết với trình tự chèn đoạn ISEcp1, chia thành 5 phân nhóm chính: CTX-M-1, CTX-M-2, CTX-M-8, CTX-M-9 và CTX-M-25.
• Tiêu chuẩn kháng đa thuốc (MDR): Luận án áp dụng tiêu chuẩn đồng thuận quốc tế của ECDC và CDC Hoa Kỳ do Magiorakos và cộng sự (2012) công bố, định nghĩa MDR là hiện tượng vi khuẩn không nhạy cảm với ít nhất 1 kháng sinh trong từ 3 nhóm/phân nhóm kháng sinh trở lên.
• Khung phân nhóm phát sinh loài (Clermont): Phân chia E. coli thành 4 nhóm A, B1, B2 và D dựa trên tổ hợp ba đoạn gen đích: chuA (vận chuyển heme), yjaA (chức năng chưa rõ) và đoạn DNA ẩn phẩm TspE4C2.
• Phân loại các chủng E. coli gây bệnh tiêu chảy: Dựa trên cơ chế gây bệnh và yếu tố độc lực, bao gồm ETEC (sinh độc tố ruột ST, LT), EIEC (xâm nhập niêm mạc đại tràng), EAEC (bám dính kết tập ruột, sinh độc tố EAST1), EHEC (sinh độc tố Shiga Stx1, Stx2), EPEC (gây tổn thương bám dính và xóa nhung mao ruột) và DAEC (bám dính phân tán).

Phương pháp nghiên cứu thực tế

Luận án áp dụng thiết kế nghiên cứu mô tả cắt ngang kết hợp thực nghiệm vi sinh vật học và sinh học phân tử trong phòng thí nghiệm.

Giai đoạn kỹ thuật	Phương pháp / Công cụ áp dụng	Tiêu chuẩn / Nguyên lý kỹ thuật
Thu thập và phân lập mẫu	Lấy mẫu phân tươi từ người khỏe mạnh tại hộ gia đình; nuôi cấy chọn lọc trên thạch MacConkey có bổ sung Cefotaxime 1 µg/ml.	Phân lập khuẩn lạc nghi ngờ kháng cephalosporin thế hệ 3.
Định danh vi sinh	Cấy chuyển trên các môi trường sinh vật hóa học: TSI (Triple Sugar Iron), CLIG (Cellobiose - lactose - indole - β-D-glucuronidase) và LIM (Lysine - Indole - Motility).	Nhận diện các tính chất sinh hóa đặc trưng của loài Escherichia coli.
Xác định kiểu hình ESBL	Phương pháp khoanh giấy kết hợp (Combined Disk Test) theo hướng dẫn của CLSI: đĩa Ceftazidime (CAZ 30 µg) so với CAZ/Acid Clavulanic (CAZ-C 30/10 µg); Cefotaxime (CTX 30 µg) so với CTX/Acid Clavulanic (CTX-C 30/10 µg).	Chủng mang kiểu hình ESBL (+) khi đường kính vòng ức chế của đĩa kết hợp lớn hơn đĩa đơn độc $\ge 5$ mm.
Đánh giá tính kháng kháng sinh	Kỹ thuật khuếch tán khoanh giấy kháng sinh trên thạch Mueller-Hinton (Kirby-Bauer) theo chuẩn CLSI đối với các nhóm kháng sinh đại diện.	Đo đường kính vòng ức chế, phân loại: Nhạy cảm (S), Trung gian (I), Đề kháng (R). Xác định tỷ lệ kháng đa thuốc (MDR).
Xác định gen sinh ESBL	Kỹ thuật PCR đơn mồi và đa mồi khuếch đại các gen blaCTX-M (các nhóm CTX-M-1, CTX-M-9...), blaTEM và blaSHV.	Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose, đối chiếu thang chuẩn kích thước DNA.
Phát hiện gen kháng colistin	Kỹ thuật Realtime-PCR đặc hiệu phát hiện gen mcr-1.	Khuếch đại huỳnh quang thời gian thực theo chu trình nhiệt chuẩn.
Phân nhóm phát sinh loài	Phản ứng Triplex PCR đồng thời khuếch đại 3 gen đích: chuA, yjaA và đoạn trình tự TspE4C2.	Phân loại vào 4 nhóm: A (chuA-, TspE4C2-), B1 (chuA-, TspE4C2+), B2 (chuA+, yjaA+) và D (chuA+, yjaA-).
Xác định gen độc lực	Kỹ thuật PCR nhận diện các gen độc lực đặc trưng cho các chủng E. coli gây tiêu chảy (ETEC, EAEC, EHEC, EPEC, EIEC).	Khuếch đại các trình tự gen độc tố và yếu tố bám dính.
Phân tích mối quan hệ kiểu gen	Kỹ thuật điện di xung trường (Pulsed-Field Gel Electrophoresis - PFGE). Cắt DNA bộ gen vi khuẩn bằng enzyme giới hạn XbaI.	Điện di xung trường, xây dựng cây phả hệ (dendrogram) để đánh giá tính tương đồng di truyền và lan truyền dòng clonal.
Phân loại nhóm plasmid	Kỹ thuật PCR phân loại replicon plasmid theo hệ thống 18 cặp mồi của Carattoli và cộng sự (2005).	Nhận diện các nhóm không tương thích (Inc) của plasmid mang gen kháng thuốc (IncF, IncI1, IncA/C, IncHI...).
Định vị gen kháng trên plasmid	Kỹ thuật lai Southern Blot: xử lý DNA bằng enzyme S1 nuclease, điện di xung trường, chuyển màng lai và lai với mẫu dò đặc hiệu gen ESBL.	Xác định chính xác gen kháng nằm trên plasmid có kích thước tương ứng.
Đánh giá lan truyền gen kháng	Thí nghiệm tiếp hợp (Conjugation) in vitro dạng lỏng/đĩa thạch: sử dụng chủng nhận là E. coli K12 (kháng rifampin hoặc nalidixic acid).	Tính toán tần số tiếp hợp và kiểm tra sự chuyển đổi kiểu hình/kiểu gen kháng thuốc ở chủng nhận transconjugant.

Đạo đức nghiên cứu và kiểm soát sai số

Nghiên cứu tuân thủ các quy định về y đức trong nghiên cứu y sinh học: được Hội đồng Đạo đức của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương thông qua; đối tượng tham gia tự nguyện và ký cam kết đồng thuận; kết quả xét nghiệm được bảo mật thông tin cá nhân. Sai số được kiểm soát chặt chẽ thông qua việc chuẩn hóa quy trình lấy mẫu, vận chuyển phân trong điều kiện lạnh về phòng thí nghiệm trong vòng 24 giờ, sử dụng các chủng vi sinh vật đối chứng chuẩn quốc tế (E. coli ATCC 25922 cho thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh; Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 cho thử nghiệm kiểu hình ESBL).

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Chương này trình bày toàn diện 2 nội dung chính:

• Tình hình nhiễm và kháng kháng sinh của E. coli sinh ESBL ở người: Tổng hợp dịch tễ học quốc tế và trong nước. Làm rõ lịch sử phát hiện ESBL từ năm 1983 tại Tây Âu, sự thay đổi chiếm ưu thế từ họ enzyme TEM/SHV sang họ CTX-M trên toàn cầu. Trình bày chi tiết dữ liệu kháng các cephalosporin thế hệ 3, aminoglycoside, fluoroquinolone và sự xuất hiện của các chủng kháng carbapenem, colistin (liên quan đến gen mcr-1 trên plasmid) tại các quốc gia và tại Việt Nam.
• Một số đặc điểm và phương pháp nghiên cứu E. coli sinh ESBL: Mô tả cấu trúc sinh học, hệ thống kháng nguyên O, H, K; phân loại chi tiết các enzyme ESBL (TEM, SHV, CTX-M, AmpC); phân nhóm phát sinh loài (A, B1, B2, D); độc lực và cơ chế gây bệnh đường ruột của 6 nhóm vi khuẩn E. coli (ETEC, EIEC, EAEC, EHEC, EPEC, DAEC); khả năng lan truyền gen kháng kháng sinh qua các yếu tố di truyền di động (plasmid, transposon, integron) bằng con đường tiếp hợp, biến nạp và tải nạp. Chương này cũng phân tích tường tận ưu và nhược điểm của 11 phương pháp chẩn đoán vi sinh lâm sàng và sinh học phân tử (từ khoanh giấy kết hợp, MIC, E-test, Vitek/Phoenix, MicroScan đến PCR, RFLP, PCR-SSCP, Ligase Chain Reaction, PFGE, Southern Blot, MLST và giải trình tự gen).

Chương 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương này quy định chi tiết toàn bộ thiết kế và quy trình triển khai:

• Địa điểm thực địa tại xã Nguyên Xá (huyện Vũ Thư, tỉnh Thái Bình) và hệ thống phòng xét nghiệm chuyên sâu tại Thái Bình, Hà Nội và Osaka.
• Quy trình chọn mẫu ngẫu nhiên đại diện cho các hộ gia đình và cụm dân cư nông thôn; các biểu mẫu điều tra nhân khẩu học (nhóm tuổi, giới tính, học vấn, nghề nghiệp, đặc điểm gia trại/chăn nuôi gia đình).
• Các tiêu chuẩn chẩn đoán, công thức môi trường nuôi cấy chọn lọc (MacConkey chứa CTX 1 µg/ml), sinh hóa định danh (TSI, CLIG, LIM).
• Bảng tổng hợp các cặp mồi khuếch đại gen sinh ESBL (blaCTX-M nhóm 1, nhóm 9, blaTEM, blaSHV), mồi Realtime-PCR phát hiện mcr-1, mồi Triplex PCR phân nhóm phylogroup, mồi phát hiện các gen độc lực tiêu chảy, và 18 cặp mồi phân loại replicon plasmid.
• Quy trình kỹ thuật PFGE phân cắt bằng XbaI, phương pháp lai Southern Blot xử lý bằng enzyme S1 nuclease, kỹ thuật tiếp hợp với chủng nhận E. coli K12, phương pháp xử lý số liệu thống kê y học và biện pháp khống chế sai số nghiên cứu.

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Chương 3 trình bày các số liệu thực nghiệm được bố cục theo 2 phần lớn:

1. Sự lưu hành của vi khuẩn E. coli sinh ESBL trong mẫu phân người khỏe mạnh tại cộng đồng:

• Phân tích cơ cấu đối tượng xét nghiệm theo các biến số nhân khẩu học: phân bố nhóm tuổi, giới tính, nghề nghiệp (trồng trọt, chăn nuôi, buôn bán, tiểu thủ công nghiệp) và trình độ học vấn.
• Kết quả cấy mẫu phân trên môi trường thạch MacConkey bổ sung CTX 1 µg/ml: xác định tỷ lệ người mang E. coli nghi ngờ kháng cephalosporin thế hệ 3.
• Tỷ lệ mang E. coli sinh ESBL khẳng định ở người khỏe mạnh tại cộng đồng; phân tích tỷ lệ này theo từng nhóm tuổi, giới tính, trình độ học vấn và nghề nghiệp.
• Khảo sát sự phân bố theo hộ gia đình: số lượng người mang E. coli sinh ESBL trong cùng một hộ gia đình và tỷ lệ mang giữa các hộ gia đình tại xã Nguyên Xá.

2. Đặc điểm sinh học của các chủng E. coli sinh ESBL phân lập được:

• Tính chất sinh vật, hóa học: Tần suất lên men các loại đường, sinh indol, khử carboxyl, phản ứng trên môi trường CLIG, LIM, TSI.
• Mức độ đề kháng kháng sinh: Tỷ lệ kháng đối với các kháng sinh nhóm beta-lactam (ampicillin, cefotaxime, ceftazidime, cefuroxime, cefoxitin, meropenem), aminoglycoside (gentamicin, amikacin), fluoroquinolone (ciprofloxacin), phenicol (chloramphenicol), tetracycline, folate inhibitors (trimethoprim/sulfamethoxazole), phosphonic acid (fosfomycin) và polymyxin (colistin). Phân tích tỷ lệ và mức độ kháng đa thuốc (MDR), số lượng kháng sinh bị kháng đồng thời trên mỗi chủng vi khuẩn.
• Đặc điểm các gen mã hóa sinh ESBL và gen kháng colistin: Tỷ lệ mang các nhóm gen blaCTX-M (trong đó có phân nhóm blaCTX-M-1, blaCTX-M-9), các gen blaTEM và blaSHV; tỷ lệ chủng mang đồng thời từ 2 đến nhiều gen kháng; tỷ lệ kháng kháng sinh tương ứng với từng kiểu gen ESBL; xác định tỷ lệ các chủng mang gen kháng colistin mcr-1 bằng Realtime-PCR.
• Đặc điểm phân nhóm phát sinh loài: Tỷ lệ phân bố của 4 nhóm phát sinh loài A, B1, B2, D ở các chủng E. coli sinh ESBL; phân tích mối liên quan giữa nhóm phát sinh loài với mức độ kháng đa thuốc và tỷ lệ kháng từng loại kháng sinh.
• Đặc điểm gen độc lực: Tỷ lệ mang các gen độc lực gây bệnh đường ruột ở các chủng E. coli sinh ESBL phân lập từ người khỏe mạnh; mối liên quan giữa sự hiện diện của gen độc lực với tình trạng kháng đa thuốc và với các nhóm phát sinh loài.
• Mối liên hệ kiểu gen (PFGE): Cây phả hệ thể hiện mức độ tương đồng di truyền giữa các chủng phân lập; nhận diện các cụm/dòng vi khuẩn lan truyền trong quần thể dân cư tại địa bàn nghiên cứu.
• Đặc tính plasmid và khả năng lan truyền: Tỷ lệ các nhóm replicon plasmid phát hiện bằng kỹ thuật PCR; phân bố số lượng plasmid trên từng chủng theo kiểu gen ESBL; kết quả định vị gen blaESBL trên plasmid bằng kỹ thuật cắt S1 nuclease và lai Southern Blot; tỷ lệ truyền thành công các plasmid mang gen blaCTX-M-1, blaCTX-M-9, blaTEM sang chủng E. coli nhận qua mô hình tiếp hợp in vitro.

Chương 4: BÀN LUẬN

Chương 4 biện luận và đối chiếu các phát hiện nghiên cứu với y văn trong nước và quốc tế:

• Biện luận về thực trạng lưu hành cao của E. coli sinh ESBL ở người khỏe mạnh tại khu vực nông thôn huyện Vũ Thư; so sánh với tỷ lệ tại Ba Vì (Hà Nội), TP. Hồ Chí Minh, cũng như dữ liệu tại Thái Lan, Trung Quốc, Đức, Pháp, Thụy Sĩ. Đánh giá vai trò của các yếu tố tiếp xúc cộng đồng, thói quen sử dụng kháng sinh không kê đơn tại các quầy thuốc tư nhân xã, và hoạt động chăn nuôi gia trại.
• Biện luận về sự tích tụ tính kháng đa thuốc cao ở các chủng cộng sinh; nguy cơ tiềm tàng của sự lưu hành gen kháng colistin mcr-1 trong cộng đồng nông thôn.
• Phân tích cơ chế chiếm ưu thế của gen blaCTX-M (đặc biệt là hai phân nhóm CTX-M-1 và CTX-M-9) so với blaTEM và blaSHV, phù hợp với xu hướng biến chuyển dịch tễ học phân tử toàn cầu.
• Thảo luận về phân bố nhóm phát sinh loài (ưu thế của nhóm A và B1 vốn là các chủng cộng sinh tiêu hóa, đối chiếu với nhóm B2/D thường liên quan đến độc lực ngoài đường ruột) và sự hiện diện của các gen độc lực ở người lành mang trùng.
• Biện luận kết quả phân tích PFGE về tính đa dạng di truyền nhưng có xuất hiện những phân nhóm tương đồng cao, gợi ý nguy cơ lây truyền ngang vi khuẩn giữa các thành viên trong gia đình và xóm thôn.
• Thảo luận ý nghĩa dịch tễ của plasmid: khả năng tự tiếp hợp cao của plasmid nhóm IncF mang gen blaCTX-M trong môi trường phòng thí nghiệm là bằng chứng thực nghiệm giải thích tốc độ lan truyền nhanh chóng của tính kháng kháng sinh tại cộng đồng.
• Nêu rõ các hạn chế nội tại của đề tài và đề xuất định hướng nghiên cứu tiếp theo (trang 126).

---

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp về mặt lý luận và khoa học

• Cung cấp dẫn liệu khoa học có hệ thống về dịch tễ học vi sinh và đặc tính phân tử của các chủng E. coli sinh ESBL ở người khỏe mạnh tại một cộng đồng nông thôn Việt Nam (huyện Vũ Thư, tỉnh Thái Bình).
• Chứng minh các chủng E. coli sinh ESBL cộng sinh trong đường ruột người lành tại cộng đồng nông thôn mang tính kháng đa thuốc rất cao đối với nhiều nhóm kháng sinh thông dụng ngoài beta-lactam.
• Xác định cấu trúc di truyền của các gen sinh ESBL lưu hành tại địa bàn: khẳng định sự chiếm ưu thế vượt trội của họ gen blaCTX-M (chủ yếu là nhóm blaCTX-M-1 và blaCTX-M-9), sự hiện diện đồng thời của blaTEM, cũng như phát hiện sự lưu hành của gen kháng colistin mcr-1 trên các chủng E. coli phân lập từ người khỏe mạnh tại cộng đồng.
• Làm sáng tỏ đặc điểm sinh học phân tử của vi khuẩn: tỷ lệ phân bố các nhóm phát sinh loài (phylogroups), sự tồn tại của các gen độc lực gây bệnh đường ruột ở người không có triệu chứng tiêu chảy, và tính đa dạng di truyền qua phân tích điện di xung trường (PFGE).
• Cung cấp bằng chứng thực nghiệm sinh học phân tử xác định vị trí gen kháng nằm trên các plasmid (qua lai Southern Blot) và chứng minh khả năng truyền ngang các plasmid mang gen sinh ESBL sang chủng E. coli khác thông qua cơ chế tiếp hợp.

Đóng góp về mặt thực tiễn và giải pháp kiến nghị

• Cung cấp bằng chứng cảnh báo thực trạng người khỏe mạnh tại cộng đồng nông thôn đang là ổ chứa vi khuẩn kháng thuốc và gen kháng thuốc nguy hiểm, có thể lây lan vào các cơ sở khám chữa bệnh hoặc qua môi trường, thực phẩm.
• Đặt cơ sở thực tiễn cho việc mở rộng mạng lưới giám sát quốc gia về kháng kháng sinh ra ngoài phạm vi bệnh viện, hướng tới giám sát thường quy tại cộng đồng.
• Cung cấp căn cứ cho ngành y tế địa phương và cơ quan quản lý dược trong việc siết chặt quản lý kê đơn thuốc kháng sinh tại các trạm y tế, đại lý thuốc tư nhân và mạng lưới thuốc thú y tại nông thôn.
• Đề xuất giải pháp tăng cường truyền thông nâng cao nhận thức của người dân nông thôn về sử dụng thuốc kháng sinh hợp lý, thực hành vệ sinh cá nhân, vệ sinh môi trường chăn nuôi hộ gia đình nhằm giảm thiểu sự phát tán vi khuẩn kháng thuốc.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Theo văn bản luận án (mục Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp theo tại trang 126 cùng phạm vi nghiên cứu):

• Hạn chế:
  • Nghiên cứu thực hiện theo thiết kế mô tả cắt ngang tại một thời điểm (năm 2016) trên phạm vi một xã (xã Nguyên Xá, huyện Vũ Thư, tỉnh Thái Bình), do đó kết quả chưa thể đại diện hoàn toàn cho toàn bộ các vùng sinh thái nông thôn khác nhau trên cả nước.
  • Chưa theo dõi dọc theo thời gian để đánh giá sự tồn lưu kéo dài hoặc biến động thải trừ của chủng vi khuẩn E. coli sinh ESBL trong đường ruột của từng cá thể người khỏe mạnh.
  • Các tương tác lan truyền vi khuẩn giữa người với vật nuôi (gia súc, gia cầm) và môi trường đất, nguồn nước sinh hoạt trong các gia trại chưa được khảo sát đồng thời trong cùng một chu trình nghiên cứu.
• Hướng nghiên cứu tiếp theo:
  • Mở rộng phạm vi và quy mô nghiên cứu giám sát ra nhiều vùng địa lý, địa bàn nông thôn và đô thị khác nhau.
  • Triển khai các nghiên cứu dịch tễ học theo cách tiếp cận Một sức khỏe (One Health), lấy mẫu đồng thời trên người, động vật nuôi, thực phẩm và môi trường xung quanh để truy xuất nguồn gốc và đường truyền lây của vi khuẩn kháng thuốc.
  • Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự toàn bộ hệ gen (Whole Genome Sequencing - WGS) nhằm giải mã chi tiết các đột biến điểm, cấu trúc phân tử của transposon, integron và toàn bộ trình tự các plasmid mang gen đa kháng.

---

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên khảo có giá trị đối với:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên chuyên ngành Vi sinh y học, Y tế công cộng, Dịch tễ học và Bệnh truyền nhiễm: Bản luận án cung cấp khung phương pháp luận vi sinh chuẩn mực, hệ thống hóa chi tiết các quy trình phòng thí nghiệm từ nuôi cấy chọn lọc, thử nghiệm kiểu hình theo chuẩn CLSI, đến các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại (Triplex PCR phylogroup, PCR gen độc lực, PCR replicon plasmid, Realtime-PCR mcr-1, PFGE, Southern Blot, thử nghiệm tiếp hợp).
• Cán bộ quản lý y tế và các nhà hoạch định chính sách: Cung cấp số liệu bằng chứng thực tiễn về nguy cơ kháng kháng sinh tại cộng đồng nông thôn, hỗ trợ xây dựng các hướng dẫn giám sát vi khuẩn kháng thuốc quốc gia và chính sách kiểm soát bán lẻ thuốc kháng sinh không đơn.
• Phần đáng tham khảo nhất: Chương 1 (tổng quan hệ thống tài liệu và phương pháp vi sinh) và Chương 2 (chi tiết các quy trình kỹ thuật, trình tự các cặp mồi PCR và tiêu chí đánh giá vi sinh/phân tử).

---

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án nghiên cứu vi khuẩn gì, trên đối tượng nào và tại địa bàn nào?

Luận án nghiên cứu vi khuẩn Escherichia coli sinh beta-lactamase phổ mở rộng (ESBL) phân lập từ mẫu phân của người khỏe mạnh sinh sống tại cộng đồng xã Nguyên Xá, huyện Vũ Thư, tỉnh Thái Bình vào năm 2016.

2. Tiêu chuẩn vi sinh nào được tác giả sử dụng để khẳng định kiểu hình E. coli sinh ESBL?

Tác giả áp dụng phương pháp khoanh giấy kết hợp (Combined Disk Test) theo tiêu chuẩn của Viện Tiêu chuẩn Lâm sàng và Phòng thí nghiệm (CLSI): so sánh đường kính vùng ức chế giữa đĩa Ceftazidime đơn độc (CAZ 30 µg) với đĩa kết hợp Ceftazidime/Acid Clavulanic (CAZ-C 30/10 µg), hoặc Cefotaxime đơn độc (CTX 30 µg) với đĩa kết hợp Cefotaxime/Acid Clavulanic (CTX-C 30/10 µg). Vi khuẩn được khẳng định sinh ESBL khi đường kính vùng ức chế của đĩa kết hợp lớn hơn đĩa đơn độc từ 5 mm trở lên ($\ge 5$ mm).

3. Các nhóm gen mã hóa sinh ESBL và gen kháng kháng sinh đặc biệt nào được phân tích trong luận án?

Luận án tập trung phát hiện các nhóm gen mã hóa ESBL chính gồm họ blaCTX-M (đặc biệt là hai phân nhóm blaCTX-M-1 và blaCTX-M-9), họ blaTEM và họ blaSHV. Ngoài ra, tác giả sử dụng kỹ thuật Realtime-PCR để xác định sự hiện diện của gen mcr-1 quy định tính kháng colistin.

4. Tác giả đã sử dụng những kỹ thuật sinh học phân tử nào để nghiên cứu mối liên hệ di truyền và khả năng lan truyền gen kháng?

Tác giả sử dụng kỹ thuật điện di xung trường (PFGE) với enzyme giới hạn XbaI để phân tích mối liên hệ kiểu gen và xây dựng cây phả hệ; kỹ thuật PCR xác định bản sao replicon plasmid theo hệ thống 18 cặp mồi của Carattoli (2005); kỹ thuật cắt enzyme S1 nuclease kết hợp lai Southern Blot để định vị gen kháng trên plasmid; và kỹ thuật tiếp hợp vi khuẩn in vitro để đánh giá khả năng truyền ngang plasmid kháng thuốc sang chủng vi khuẩn nhận E. coli K12.

5. Tiêu chuẩn đánh giá vi khuẩn kháng đa thuốc (MDR) trong luận án được định nghĩa như thế nào?

Dựa trên tiêu chuẩn đồng thuận của ECDC và CDC Hoa Kỳ do Magiorakos và cộng sự (2012) công bố, chủng vi khuẩn được phân loại là kháng đa thuốc (MDR) khi biểu hiện không nhạy cảm (đề kháng hoặc trung gian) với ít nhất một kháng sinh trong ba nhóm hoặc phân nhóm kháng sinh trở lên trong danh mục thử nghiệm.

---

Kết luận

Luận án tiến sĩ của nghiên cứu sinh Khổng Thị Điệp (2020) đã giải quyết toàn diện khoảng trống nghiên cứu về dịch tễ học và đặc tính vi sinh của Escherichia coli sinh beta-lactamase phổ mở rộng ở người khỏe mạnh tại cộng đồng nông thôn huyện Vũ Thư, tỉnh Thái Bình. Bằng việc kết hợp chặt chẽ giữa khảo sát thực địa với hệ thống kỹ thuật vi sinh lâm sàng và sinh học phân tử chuyên sâu (PCR, Realtime-PCR, PFGE, Southern Blot, tiếp hợp), công trình đã xác lập bức tranh khoa học rõ nét về sự lưu hành, mức độ kháng đa thuốc, kiểu gen sinh ESBL, gen mcr-1, nhóm phát sinh loài, gen độc lực và cơ chế lan truyền ngang qua plasmid. Kết quả nghiên cứu là nguồn cứ liệu khoa học và thực tiễn giá trị cho công tác giám sát dịch tễ vi khuẩn kháng thuốc ngoài môi trường bệnh viện và xây dựng các chiến lược can thiệp y tế công cộng tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Thuốc kháng sinh đƣợc coi là một giải pháp cho loài ngƣời trong phòng và điều trị bệnh do nhiễm khuẩn. Tuy nhiên, trong những năm gần đây vi khuẩn kháng lại thuốc kháng sinh ngày càng nghiêm trọng và sự lan truyền các vi khuẩn kháng kháng sinh đang trở thành mối đe dọa lớn cho sức khỏe cộng đồng trên toàn thế giới. Có nhiều cơ chế kháng kháng sinh, trong đó cơ chế ức chế bằng enzyme β-lactamase phổ mở rộng, hay còn đƣợc gọi là ESBL (Extended - Spectrum Beta -Lactamase) là cơ chế thƣờng gặp. ESBL là các enzyme do vi khuẩn sinh ra, chúng có khả năng làm bất hoạt các thuốc nhóm β-lactam bằng cách phá hủy nối amide của vòng β-lactam vì vậy các vi khuẩn có enzyme này kháng lại các kháng sinh nhóm β-lactam rất hiệu quả.

ESBL thƣờng đƣợc tìm thấy trong các nhóm Enterobacteriaceae, thƣờng gặp ở Escherichia coli (E. coli là vi khuẩn sống cộng sinh trong đƣờng tiêu hóa, nhƣng nó cũng là một trong những tác nhân gây bệnh khá phổ biến ở ngƣời. Trên nhiều chủng E. coli sinh ESBL, các plasmid không chỉ mang gen mã hóa sinh ESBL mà còn kèm các gen kháng kháng sinh khác, vì vậy các vi khuẩn này có thể kháng đồng thời nhiều loại kháng sinh [32].

Mặt khác, các chủng E. coli mang gen mã hóa sinh ESBL còn có khả năng truyền các gen kháng kháng sinh cho các vi khuẩn khác trong cùng loài hoặc cho các loài vi khuẩn gây bệnh khác nhƣ: Salmonella, Shigella. làm gia tăng tình trạng kháng kháng sinh trong cộng đồng và gây ra những khó khăn trong điều trị lâm sàng [32, 101]. Trên thế giới, tỷ lệ nhiễm E.

coli sinh ESBL chiếm tỷ lệ từ 5% đến 62%. Tỷ lệ này cao ở khu vực châu Á, đặc biệt là các nƣớc khu vực Nam Á và Trung Quốc (trên 50%) ở cả bệnh viện và cộng đồng [61, 92]. 2 Tại Việt Nam, tỉ lệ nhiễm E. coli sinh ESBL là tƣơng đối cao: 18% đến 57,3 % trong bệnh viện [61, 92].

Hầu hết các nghiên cứu có liên quan đến E. coli sinh ESBL chủ yếu là trên các bệnh phẩm của bệnh nhân tại bệnh viện, rất ít các nghiên cứu đƣợc thực hiện trên ngƣời khỏe mạnh tại cộng đồng. Đặc biệt những thông tin về đặc điểm vi sinh y học của vi khuẩn E. coli sinh ESBL tại cộng đồng hầu nhƣ chƣa đƣợc thông báo.

Vì vậy cần thiết có những nghiên cứu trên ngƣời khỏe mạnh tại cộng đồng nhằm đánh giá thực trạng nhiễm, đặc điểm vi sinh học của vi khuẩn E. coli sinh ESBL tại cộng đồng, góp phần đƣa ra bức tranh tổng thể về dịch tễ học của vi khuẩn E. coli tại cộng đồng, cung cấp cơ sở khoa học cho việc thiết lập hệ thống giám sát, phòng ngừa sự lây nhiễm và lan truyền vi khuẩn kháng kháng sinh tại cộng đồng. Do đó chúng tôi thực hiện đề tài ―Xác định một số đặc điểm vi sinh của Escherichia coli sinh beta lactamase phổ mở rộng ở người khỏe mạnh tại cộng đồng huyện Vũ Thư, tỉnh Thái Bình, năm 2016‖ với các mục tiêu sau: 1.

Xác định sự lưu hành của Escherichia coli sinh beta-lactamase phổ mở rộng ở người khỏe mạnh tại cộng đồng, huyện Vũ Thư, tỉnh Thái Bình, năm 2016. Xác định một số đặc điểm sinh học của các chủng Escherichia coli sinh beta-lactamase phổ mở rộng phân lập được từ người khỏe mạnh tại cộng đồng. 3 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tình hình nhiễm và kháng kháng sinh của E.

coli sinh β-lactamase phổ mở rộng ở ngƣời 1. Tình hình nhiễm E. coli sinh β-lactamase phổ mở rộng ở người 1. Trên thế giới a.

Trong bệnh viện Vi khuẩn sinh ESBL đƣợc phát hiện lần đầu tiên vào năm 1983 tại Tây Âu. Sau đó không lâu, ESBL đƣợc phát hiện ở Mỹ và Châu Á, hiện nay nó đã lan ra toàn cầu và là vấn đề thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới. ESBL xuất hiện ở nhiều vi khuẩn trong đó chủ yếu là ở nhóm trực khuẩn gram âm, thƣờng gặp ở E. Theo chƣơng trình giám sát xu hƣớng kháng kháng sinh trên toàn thế giới (SMART) giai đoạn 2002 – 2011 ở 179 bệnh viện trên thế giới cho thấy: E.

coli là nguyên nhân hàng đầu gây nhiễm khuẩn ổ bụng (47,8%) và nhiễm khuẩn tiết niệu (44,3%). Trong nhiễm khuẩn ổ bụng, vi khuẩn sinh ESBL cao ở châu Á, Mỹ Latinh và Trung Đông (20% - 40%); châu Âu, Bắc Mỹ, Nam Thái Bình Dƣơng và châu Phi có tỷ lệ thấp hơn (5-15%). Trong nhiễm khuẩn tiết niệu tỷ lệ vi khuẩn sinh ESBL cao nhất ở châu Á và Trung Đông (30% - 50%), tiếp đến là Mỹ Latinh và châu Âu (khoảng 20%), tỷ lệ này thấp nhất ở châu Phi, Nam Thái Bình Dƣơng và Bắc Mỹ (khoảng 10%). Tỷ lệ ESBL ở cả bệnh nhân nhiễm khuẩn ở bụng và nhiễm khuẩn tiết niệu tăng theo thời gian ở hầu hết các khu vực, đặc biệt là ở châu Á và Trung Đông [92].

Tỷ lệ ESBL ở E. mirabilis trong nhiễm khuẩn ổ bụng theo các vùng từ SMART từ 2002 – 2011 [92]. Tỷ lệ ESBL ở E. mirabilis trong nhiễm trùng tiết niệu theo các vùng từ SMART từ 2002 - 2011 [92].

Trong báo cáo giám sát hàng năm của Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa bệnh tật châu Âu (ECDC, 2012) cho thấy tỷ lệ sinh ESBL của các chủng E. coli kháng cephalosporin thế hệ ba ở 23 quốc gia thuộc châu Âu rất cao (70,5% đến 100%). Có tới 16 trong 23 quốc gia báo cáo có tỷ lệ sinh ESBL ở các chủng E. coli kháng cephalosporin thế hệ ba là trên 85%, thậm chí ở một số nƣớc nhƣ Hungary, Lithuania và Rumania tỷ lệ này lên đến 100% [115].

Qua các nghiên cứu giám sát về tình hình vi khuẩn kháng kháng sinh ở 5 khu vực châu Á - Thái Bình Dƣơng cho thấy, E. coli sinh ESBL có xu hƣớng ngày càng gia tăng. Nghiên cứu SMART từ năm 2007: Trong tổng số 3004 chủng Gram âm đƣợc phân lập năm 2007 ở khu vực châu Á - Thái Bình Dƣơng tỷ lệ sinh ESBL ở E. Tỷ lệ này cao ở các nƣớc Ấn Độ (79%), Trung Quốc (55%), Thái Lan (50,8%).

Các nƣớc có tỷ lệ E. coli sinh ESBL trung bình là Việt Nam (34,4%), Singapore (33,3%). Các quốc gia có tỉ lệ thấp hơn (3,2 - 22,7%) là Hàn Quốc, Hồng Công, Philipine, Đài Loan, Úc, New Zealand [61]. Tỷ lệ nhiễm các vi khuẩn sinh ESBL ở các nước khu vực châu Á-Thái Bình Dương [61].

Nghiên cứu SMART trên 17.350 chủng vi khuẩn Gram âm phân lập từ bệnh nhân nhiễm khuẩn ổ bụng ở 54 bệnh viện thuộc 13 nƣớc trong vùng châu Á - Thái Bình Dƣơng giai đoạn 2010 - 2013 cho thấy: E. coli là tác nhân chủ yếu (46,1%). Tỷ lệ sinh ESBL ở E. Trong đó tỷ lệ E.

coli sinh ESBL trong các nhiễm khuẩn tại bệnh viện cao nhất ở Ấn Độ (79%), Trung Quốc (55%), Thái Lan (50%) và Việt Nam (34,4%). Ở các nƣớc này tỷ lệ E. coli sinh ESBL trong các nhiễm khuẩn cộng đồng là khoảng 20% [41]. Nhóm nghiên cứu của tác giả Villegas thực hiện trên các chủng vi khuẩn Gram âm đƣợc thu thập từ các bệnh nhân nhiễm khuẩn ổ bụng từ 23 trung tâm thuộc 10 nƣớc Mỹ Latinh cho thấy trong E.

coli là các tác nhân phổ 6 biến nhất, tỷ lệ sinh ESBL ở E. Một nghiên cứu đƣợc thực hiện ở Nam Phi giai đoạn 1998-1999 cho thấy tỷ lệ E. coli sinh ESBL là 5,1 % [28]. Nghiên cứu gần đây của tác giả Sangare và cộng sự tại 2 bệnh viện lớn ở Mali cho thấy: tỷ lệ sinh ESBL của các vi khuẩn đƣờng ruột phân lập từ máu bệnh nhân là 62,3 %.

coli sinh ESBL chiếm 64,5% [108]. Tại cộng đồng Một số nghiên cứu gần đây cho thấy vi khuẩn E. coli sinh ESBL không chỉ xuất hiện trong bệnh viện mà còn đƣợc phát hiện ở cả những ngƣời khỏe mạnh tại cộng đồng ở nhiều nơi trên thế giới. Tại Thụy Sĩ: Theo nghiên cứu của tác giả Geser và cộng sự trên mẫu phân của 586 ngƣời khỏe mạnh tại Thụy Sĩ năm 2013 cho thấy có 5,8 % ngƣời khỏe mạnh nhiễm E.

coli sinh ESBL [51]. Tại Pháp: Tác giả Nicolas - Chanoine thông báo tỷ lệ mang E. coli sinh ESBL ở những ngƣời trƣởng thành khỏe mạnh tại khu vực Pari tăng lên gấp 10 lần sau 5 năm (0,6% vào năm 2006 và 6% vào năm 2011) [98]. Kết quả nghiên cứu của tác giả Valenza (2014) trên 3344 mẫu phân ngƣời khỏe mạnh trong cộng đồng có tiếp xúc gần với bệnh nhân nhiễm khuẩn tiêu hóa tại Đức cho thấy tỷ lệ sinh ESBL là 6,3% trong cộng đồng [119].

Tại Trung Quốc, tác giả Li B (2009) công bố có tới 50,5% mẫu phân của những ngƣời khỏe mạnh tham gia nghiên cứu có chứa vi khuẩn E. coli sinh ESBL [78]. Nghiên cứu trên 160 ngƣời khỏe mạnh ở vùng nông thôn Thái Lan năm 2008 của tác giả Sasaki cho thấy tỷ lệ những ngƣời tham gia nghiên cứu có mang vi khuẩn sinh ESBL trong mẫu phân là 61,7%. coli chiếm ƣu thế với tỷ lệ 85,1% [109].

Theo một kết quả nghiên cứu trên 150 ngƣời tình nguyện khỏe mạnh tại 7 Tunisia năm 2009-2010 cho thấy tỷ lệ mang E. coli sinh ESBL trong đƣờng tiêu hóa tại cộng đồng là 7,3% [29]. Tại Việt Nam a. Trong bệnh viện Hiện nay E.

coli sinh ESBL đã lƣu hành rộng khắp trên các bệnh viện trong cả nƣớc. Vi khuẩn này là một trong các tác nhân gây các bệnh nhiễm khuẩn trong bệnh viện nhƣ nhiễm khuẩn tiết niệu, nhiễm khuẩn tiêu hóa với tỷ lệ kháng kháng sinh cao. Theo số liệu của chƣơng trình quốc gia giám sát độ nhạy cảm với kháng sinh (Antibiotic Susceptibility Testing Surveillance – ASTS) 2002 - 2006 từ 10 đơn vị thành viên ở Bắc, Trung, Nam, và các dữ liệu từ các bệnh viện nhiều nơi gửi về cho thấy: bệnh viện càng lớn bao nhiêu thì tỷ lệ các vi khuẩn sinh ESBL càng tăng cao và tỷ lệ vi khuẩn sinh ESBL cũng tăng dần theo từng năm. Tỷ lệ ở các bệnh viện theo thời gian đƣợc thể hiện ở bảng 1.

coli sinh ESBL ở một số bệnh viện (ASTS) Bệnh viện E. coli sinh ESBL ASTS- Bộ Y tế (2004) 7,7% (n=548) Bệnh viện Chợ Rẫy 51,6% Bệnh viện Việt Đức 34,2% Bệnh viện Bình Định 36,2% Bệnh viện Việt Tiệp 36,1% Bệnh viện Bạch Mai (2005) 18,5% Bệnh viện Bạch Mai (2006) 21,5% Bệnh viện Bạch Mai (2007) 41,2% Bệnh viện Bạch Mai (2008) 42,2% Tác giả Hoàng Thị Phƣơng Dung nghiên cứu 204 chủng vi khuẩn Gram âm phân lập đƣợc tại bệnh viện Đại học Y Dƣợc thành phố Hồ Chí Minh từ 7 - 12/2008 công bố có 32,2% các chủng vi khuẩn sinh ESBL, trong đó 8 E. coli chiếm tỷ lệ cao nhất (71,2%) [6].