Luận án tiến sĩ xác định một số đặc điểm vi sinh của escherichia coli sinh beta lactamase phổ mở rộng ở người khỏe mạnh tại cộng đồng huyện vũ thư tỉnh thái bình

Luận án tiến sĩ nghiên cứu đặc điểm vi sinh của Escherichia coli sinh beta-lactamase phổ mở rộng ở người khỏe mạnh tại huyện Vũ Thư, tỉnh Thái Bình.

• Tác giả: Khổng Thị Điệp
• Người hướng dẫn: PGS.TS Hoàng Thị Thu Hà
• Trường học: Trường Đại học Y Dược Thái Bình
• Chuyên ngành: Vi sinh y học
• Đề tài: Nghiên cứu đặc điểm vi sinh của E. coli sinh beta-lactamase ở người khỏe mạnh tại Vũ Thư, Thái Bình
• Loại tài liệu: luận án
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Thái Bình

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• MỤC LỤC
• DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tình hình nhiễm và kháng kháng sinh của E. coli sinh β-lactamase phổ mở rộng ở người
• 1.1.1. Tình hình nhiễm E. coli sinh β-lactamase phổ mở rộng ở người
• 1.1.1.1. Trên thế giới
• 1.1.1.1.a. Trong bệnh viện
• 1.2. Một số đặc điểm và phương pháp nghiên cứu E. coli sinh ESBL
• 1.2.1. Đặc điểm sinh học
• 1.2.2. Đặc điểm và sự lưu hành các ESBL và các gen mã hóa sinh ESBL
• 1.2.3. Đặc điểm phân nhóm phát sinh loài (phylogenetic group)
• 1.2.4. Đặc điểm gây bệnh của vi khuẩn E. coli trên người
• 1.2.5. Khả năng lan truyền vi khuẩn E. coli sinh ESBL
• 1.2.6. Các phương pháp nghiên cứu E. coli sinh ESBL
• 2. CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 2.1.1. Địa điểm nghiên cứu
• 2.1.2. Thời gian nghiên cứu
• 2.1.3. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu
• 2.2.2. Phương pháp chọn mẫu và tính cỡ mẫu
• 2.2.3. Các biến số và chỉ số nghiên cứu
• 2.3. Vật liệu nghiên cứu
• 2.4. Các kỹ thuật áp dụng trong nghiên cứu
• 2.4.1. Kỹ thuật lấy mẫu phân
• 2.4.2. Kỹ thuật nuôi cấy, phân lập E. coli từ mẫu phân
• 2.4.3. Kỹ thuật định danh vi khuẩn E.
• 2.4.4. Kỹ thuật xác định kiểu hình ESBL của các chủng E.
• 2.4.5. Kỹ thuật xác định đặc điểm kháng kháng sinh của E. coli sinh ESBL
• 2.4.6. Kỹ thuật xác định gen mã hóa sinh ESBL của E. coli sinh ESBL
• 2.4.7. Kỹ thuật xác định gen mcr-1 kháng colistin của E. coli sinh ESBL
• 2.4.8. Kỹ thuật xác định đặc điểm phân nhóm phát sinh loài của các chủng E. coli sinh ESBL
• 2.4.9. Kỹ thuật xác định gen độc lực của vi khuẩn E. coli sinh ESBL
• 2.4.10. Phân tích mối liên hệ kiểu gen bằng kỹ thuật PFGE
• 2.4.11. Kỹ thuật xác định các loại plasmid của các chủng E. coli sinh ESBL
• 2.4.12. Xác định vị trí các gen mã hóa sinh ESBL bằng phương pháp Southern Blot
• 2.4.13. Đánh giá khả năng truyền các gen mã hóa sinh ESBL của các chủng E. coli sinh ESBL trong mô hình phòng thí nghiệm bằng phương pháp tiếp hợp
• 2.5. Phương pháp xử lý số liệu
• 2.6. Biện pháp khống chế sai số
• 2.7. Đạo đức nghiên cứu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Sự lưu hành của vi khuẩn E. coli sinh ESBL trong mẫu phân người khỏe mạnh tại cộng đồng nông thôn tỉnh Thái Bình
• 3.1.1. Đặc điểm của đối tượng xét nghiệm
• 3.1.2. Sự lưu hành của vi khuẩn E. coli sinh ESBL trong mẫu phân người khỏe mạnh
• 3.1.3. Đặc điểm sinh học của các chủng E. coli sinh ESBL
• 3.1.4. Đặc điểm sinh vật, hóa học của các chủng E. coli sinh ESBL
• 3.1.5. Đặc điểm kháng kháng sinh của các chủng E. coli sinh ESBL
• 3.1.6. Đặc điểm các gen mã hóa sinh ESBL ở các chủng E. coli sinh ESBL
• 3.1.7. Đặc điểm phân nhóm phát sinh loài của các chủng E. coli sinh ESBL
• 3.1.8. Đặc điểm các gen độc lực trong các chủng E. coli sinh ESBL
• 3.1.9. Mối liên hệ kiểu gen giữa các chủng E. coli sinh ESBL
• 3.1.10. Phân tích đặc điểm plasmid của các chủng E. coli sinh ESBL
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• 4.1. Sự lưu hành của vi khuẩn E. coli sinh ESBL trong mẫu phân người khỏe mạnh tại cộng đồng nông thôn tỉnh Thái Bình
• 4.1.1. Đặc điểm của đối tượng xét nghiệm
• 4.1.2. Sự lưu hành của E. coli sinh ESBL trong mẫu phân người khỏe mạnh
• 4.1.3. Đặc điểm sinh học của các chủng E. coli sinh ESBL
• 4.1.4. Đặc điểm sinh vật, hóa học của các chủng E. coli sinh ESBL
• 4.1.5. Đặc điểm kháng kháng sinh của các chủng E. coli sinh ESBL
• 4.1.6. Đặc điểm các gen mã hóa sinh ESBL ở các chủng E. coli sinh ESBL
• 4.1.7. Đặc điểm phân nhóm phát sinh loài của các chủng E. coli sinh ESBL
• 4.1.8. Đặc điểm các gen độc lực của các chủng E. coli sinh ESBL
• 4.1.9. Mối liên hệ kiểu gen giữa các chủng E. coli sinh ESBL
• 4.1.10. Phân tích đặc điểm plasmid của các chủng E. coli sinh ESBL
• 4.1.11. Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp theo
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Giới thiệu và mục tiêu nghiên cứu

Nghiên cứu tập trung vào đặc điểm vi sinh của E. coli sinh beta-lactamase (ESBL) ở người khỏe mạnh tại Vũ Thư, Thái Bình. Mục tiêu chính là xác định sự lưu hành và đặc điểm sinh học của các chủng E. coli sinh ESBL trong cộng đồng. Nghiên cứu này nhằm cung cấp cơ sở khoa học cho việc giám sát và phòng ngừa sự lây lan của vi khuẩn kháng kháng sinh.

1.1. Bối cảnh và tầm quan trọng

E. coli là vi khuẩn phổ biến trong đường ruột, nhưng cũng là tác nhân gây bệnh quan trọng. Beta-lactamase là enzyme giúp vi khuẩn kháng lại các kháng sinh nhóm beta-lactam. Sự xuất hiện của E. coli sinh ESBL trong cộng đồng là mối đe dọa lớn đối với sức khỏe cộng đồng, đặc biệt là ở các khu vực nông thôn như Vũ Thư, Thái Bình.

1.2. Mục tiêu cụ thể

Nghiên cứu nhằm xác định tỷ lệ lưu hành của E. coli sinh ESBL và phân tích các đặc điểm sinh học của chúng, bao gồm khả năng kháng kháng sinh, gen mã hóa ESBL, và đặc điểm phân nhóm phát sinh loài.

II. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng phương pháp lấy mẫu phân từ người khỏe mạnh tại Vũ Thư, Thái Bình. Các mẫu được nuôi cấy, phân lập và xác định E. coli sinh ESBL thông qua các kỹ thuật vi sinh và phân tử. Các đặc điểm kháng kháng sinh và gen mã hóa ESBL được phân tích chi tiết.

2.1. Đối tượng và địa điểm nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện trên người khỏe mạnh tại Vũ Thư, Thái Bình. Đây là khu vực nông thôn, nơi có nguy cơ cao về sự lây lan của vi khuẩn kháng kháng sinh do điều kiện vệ sinh và sử dụng kháng sinh không hợp lý.

2.2. Kỹ thuật phân tích

Các kỹ thuật bao gồm nuôi cấy, phân lập E. coli, xác định kiểu hình ESBL, và phân tích gen mã hóa ESBL bằng PCR. Ngoài ra, nghiên cứu còn sử dụng kỹ thuật PFGE để phân tích mối liên hệ kiểu gen giữa các chủng vi khuẩn.

III. Kết quả nghiên cứu

Kết quả cho thấy tỷ lệ lưu hành của E. coli sinh ESBL trong cộng đồng là đáng kể. Các chủng vi khuẩn này có khả năng kháng đa kháng sinh và mang nhiều gen mã hóa ESBL. Đặc điểm phân nhóm phát sinh loài cho thấy sự đa dạng di truyền của các chủng E. coli.

3.1. Tỷ lệ lưu hành

Tỷ lệ E. coli sinh ESBL trong mẫu phân của người khỏe mạnh tại Vũ Thư, Thái Bình là cao, phản ánh sự phổ biến của vi khuẩn kháng kháng sinh trong cộng đồng.

3.2. Đặc điểm kháng kháng sinh

Các chủng E. coli sinh ESBL kháng lại nhiều loại kháng sinh, bao gồm cephalosporin thế hệ ba và các kháng sinh phổ rộng khác. Điều này làm tăng nguy cơ điều trị thất bại trong các bệnh nhiễm khuẩn.

3.3. Đặc điểm gen mã hóa ESBL

Các gen mã hóa ESBL như blaCTX-M, blaTEM, và blaSHV được phát hiện phổ biến trong các chủng E. coli. Điều này cho thấy sự lan truyền rộng rãi của các gen kháng kháng sinh trong cộng đồng.

IV. Bàn luận và kết luận

Nghiên cứu này cung cấp cái nhìn toàn diện về sự lưu hành và đặc điểm của E. coli sinh ESBL trong cộng đồng Vũ Thư, Thái Bình. Kết quả nhấn mạnh sự cần thiết của việc giám sát và kiểm soát vi khuẩn kháng kháng sinh tại cộng đồng, đặc biệt là ở các khu vực nông thôn.

4.1. Ý nghĩa thực tiễn

Nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong việc thiết lập các chính sách giám sát và phòng ngừa sự lây lan của vi khuẩn kháng kháng sinh. Đồng thời, nó cung cấp dữ liệu quan trọng cho các nghiên cứu tiếp theo về vi sinh lâm sàng và kháng sinh.

4.2. Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp theo

Nghiên cứu này chỉ tập trung vào một khu vực cụ thể, do đó cần mở rộng phạm vi nghiên cứu để có cái nhìn tổng thể hơn. Các nghiên cứu tiếp theo nên tập trung vào cơ chế lan truyền gen kháng kháng sinh và các biện pháp can thiệp hiệu quả.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Sự gia tăng và lan truyền của các chủng vi khuẩn Gram âm kháng kháng sinh đang tạo nên thách thức y tế công cộng toàn cầu ở mức báo động. Trong đó, cơ chế bất hoạt kháng sinh thông qua việc tiết enzyme $\beta$-lactamase phổ mở rộng (Extended-Spectrum $\beta$-Lactamase - ESBL) ở trực khuẩn đường ruột Escherichia coli phá hủy liên kết amide của vòng $\beta$-lactam, khiến các kháng sinh thế hệ mới bị vô hiệu hóa hoàn toàn. Đề tài luận án tiến sĩ vi sinh y học: "Xác định một số đặc điểm vi sinh của Escherichia coli sinh beta lactamase phổ mở rộng ở người khỏe mạnh tại cộng đồng huyện Vũ Thư, tỉnh Thái Bình, năm 2016" do Nghiên cứu sinh Khổng Thị Điệp thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Hoàng Thị Thu Hà và PGS. Phạm Ngọc Khái (Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương phối hợp Trường Đại học Y Dược Thái Bình và Viện Y tế Công cộng Osaka, Nhật Bản) là công trình tiên phong giải quyết khoảng trống dịch tễ học phân tử tại cộng đồng nông thôn Việt Nam.

                  +---------------------------------------------------------+
                  |  Quan điểm truyền thống: ESBL khu trú trong bệnh viện   |
                  +---------------------------------------------------------+
                                               |
                                               v (Sự dịch chuyển dịch tễ)
                  +---------------------------------------------------------+
                  | Reservoir cộng đồng: Người khỏe mạnh mang vi khuẩn MDR   |
                  | (Ổ chứa tiềm ẩn gen kháng: blaCTX-M, blaTEM, mcr-1)      |
                  +---------------------------------------------------------+
                                               |
                     +-------------------------+-------------------------+
                     |                                                   |
                     v                                                   v
+------------------------------------------+  +------------------------------------------+
|      Lan truyền ngang qua Plasmid        |  |     Đồng tích hợp Gen độc lực & Kháng    |
| (Tiếp hợp In Vitro: Incompatibility Inc) |  | (Nhóm sinh loài A, B1, B2, D x EAEC/ETEC)|
+------------------------------------------+  +------------------------------------------+

Trước đây, phần lớn các công bố khoa học chỉ tập trung khảo sát chủng E. coli sinh ESBL phân lập từ bệnh nhân nội trú tại các bệnh viện tuyến trung ương (như Bệnh viện Chợ Rẫy 51,6%, Bệnh viện Bạch Mai 42,2%, Bệnh viện Việt Đức 34,2% theo số liệu ASTS). Nghiên cứu này định vị một research gap then chốt: Sự thiếu hụt dữ liệu vi sinh y học và sinh học phân tử toàn diện về mức độ lưu hành, cấu trúc gen kháng thuốc, đặc tính plasmid tiếp hợp và gen độc lực của E. coli sinh ESBL ở quần thể người hoàn toàn khỏe mạnh tại nông thôn.

Luận án thiết lập 2 câu hỏi nghiên cứu và giả thuyết tương ứng:

• Câu hỏi nghiên cứu 1 (RQ1): Tỷ lệ người khỏe mạnh mang vi khuẩn E. coli sinh ESBL tại cộng đồng nông thôn xã Nguyên Xá, huyện Vũ Thư, tỉnh Thái Bình là bao nhiêu và chịu tác động bởi các đặc điểm nhân khẩu học nào?
  • Giả thuyết 1 (H1): Tỷ lệ mang E. coli sinh ESBL ở cộng đồng nông thôn khỏe mạnh đạt mức cao tương đương các quốc gia đang phát triển trong khu vực do sức ép chọn lọc kháng sinh và chuỗi thực phẩm - môi trường.
• Câu hỏi nghiên cứu 2 (RQ2): Các chủng E. coli sinh ESBL cộng sinh này mang những đặc điểm phân tử gì về kiểu gen đề kháng ($bla_{CTX-M}$, $bla_{TEM}$, $bla_{SHV}$, $mcr-1$), phân nhóm phát sinh loài, gen độc lực, và cơ chế phát tán ngang qua plasmid?
  • Giả thuyết 2 (H2): Các chủng E. coli cộng sinh không chỉ mang đa gen kháng thuốc nằm trên các plasmid có khả năng tiếp hợp cao mà còn đồng tích lũy các gen độc lực đường ruột nguy cơ cao.

Khung lý thuyết của luận án tích hợp Thuyết Di truyền liên kết ngang (Horizontal Gene Transfer Theory), Thuyết Sức ép chọn lọc vi sinh vật (Antimicrobial Selection Pressure Paradigm) và Khung phân loại phát sinh loài Clermont. Phạm vi nghiên cứu được thực hiện tại xã Nguyên Xá (huyện Vũ Thư, tỉnh Thái Bình) – một địa bàn đại diện điển hình cho mô hình nông thôn đồng bằng Bắc Bộ với các hoạt động chăn nuôi gia trại xen kẽ khu dân cư và mạng lưới quầy thuốc tư nhân dày đặc.

---

Literature Review và Positioning

Phân tích tổng quan tài liệu quốc tế và trong nước cho thấy sự chuyển dịch dịch tễ rõ rệt của vi khuẩn sinh ESBL qua ba dòng nghiên cứu chính:

[Dòng 1: Vi sinh lâm sàng Bệnh viện]  ---> Khảo sát áp lực chọn lọc & tỷ lệ đề kháng nội trú (SMART, ASTS)
[Dòng 2: Sinh học phân tử Gen kháng]    ---> Tiến hóa từ blaTEM/blaSHV sang ưu thế toàn cầu blaCTX-M
[Dòng 3: Dịch tễ học Cộng đồng]        ---> Ổ chứa vi khuẩn kháng thuốc ở người khỏe mạnh (One Health)

1. Dòng nghiên cứu dịch tễ học lâm sàng nội viện: Các chương trình giám sát quốc tế như SMART (Study for Monitoring Antimicrobial Resistance Trends) giai đoạn 2002–2011 trên 179 bệnh viện toàn cầu chỉ ra E. coli là căn nguyên hàng đầu gây nhiễm khuẩn ổ bụng (47,8%) và tiết niệu (44,3%), với tỷ lệ sinh ESBL tại châu Á đạt 20–50% (Hawser et al., 2009; Badal et al., 2013). Tại Việt Nam, các nghiên cứu của Cao Minh Nga (2013) tại Bệnh viện 175 và Phan Thị Thu Hồng (2012) tại Bệnh viện Bình Dân ghi nhận tỷ lệ E. coli sinh ESBL kháng cephalosporin thế hệ 3 lên đến 82,6% - 100%.
2. Dòng nghiên cứu tiến hóa phân tử của gen kháng thuốc: Các công trình kinh điển ghi nhận sự dịch chuyển hệ gen từ nhóm enzyme $bla_{TEM}$ và $bla_{SHV}$ (thập niên 1980–1990) sang sự thống trị của các biến thể $bla_{CTX-M}$ thuộc nhóm 1 và nhóm 9 gắn liền với yếu tố chèn đoạn $ISEcp1$ trên plasmid loại IncF (Cantón & Coque, 2006; Livermore et al., 2007).
3. Dòng nghiên cứu cộng đồng và sự phân hóa quan điểm: Tồn tại hai luồng quan điểm trái ngược nhau trong y văn:
   • Quan điểm 1 (Bảo thủ lâm sàng): Cho rằng vi khuẩn sinh ESBL chỉ cư trú và phát tán chủ yếu trong môi trường bệnh viện do tiếp xúc kháng sinh liều cao và can thiệp y khoa xâm lấn.
   • Quan điểm 2 (Y tế công cộng hiện đại): Khẳng định người khỏe mạnh trong cộng đồng chính là "ổ chứa" (reservoir) khổng lồ phát tán vi khuẩn kháng thuốc ra toàn xã hội.

Nghiên cứu	Bối cảnh / Quốc gia	Cỡ mẫu	Tỷ lệ mang E. coli sinh ESBL	Nhóm gen/Đặc tính chủ đạo
Sasaki et al. (2008)	Nông thôn Thái Lan	$n = 160$	61,7%	$bla_{CTX-M}$ chiếm ưu thế tuyệt đối (85,1%)
Li B. et al. (2009)	Cộng đồng Trung Quốc	$n = 312$	50,5%	Đa gen ($bla_{TEM}$ 77,8%, $bla_{CTX-M}$ 50,0%)
Geser et al. (2013)	Thụy Sĩ	$n = 586$	5,8%	Tỷ lệ thấp, chủ yếu lây lan từ du lịch
Valenza et al. (2014)	Đức	$n = 3344$	6,3%	Khu trú hẹp, nhóm phân tử B2 thấp
Luận án (Khổng Thị Điệp)	Nông thôn Thái Bình, VN	Cộng đồng nông thôn	Tỷ lệ lưu hành thực tế cao	Ưu thế $bla_{CTX-M-1}$, $bla_{CTX-M-9}$, hiện diện $mcr-1$

Luận án khẳng định vị thế khoa học độc lập khi chứng minh bối cảnh nông thôn Việt Nam có sự tương đồng dịch tễ với các điểm nóng Nam Á và Đông Nam Á (Thái Lan 61,7%), hoàn toàn khác biệt với tỷ lệ đơn con số tại các nước Tây Âu (Đức 6,3%, Thụy Sĩ 5,8%). Nghiên cứu đóng góp bằng chứng thực nghiệm trực tiếp về sự hiện diện của gen kháng colistin trung gian qua plasmid ($mcr-1$) ngay tại cộng đồng dân cư không nằm viện.

---

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Luận án mở rộng và bổ sung căn bản cho 3 lý thuyết nền tảng trong vi sinh học và di truyền học phân tử:

• Thuyết Tiến hóa chọn lọc kháng thuốc (Darwinian Selection in AMR): Luận án chứng minh sức ép chọn lọc không chỉ diễn ra dưới tác động của phác đồ điều trị lâm sàng liều cao, mà diễn ra âm thầm, liên tục tại môi trường sống nông thôn do việc lạm dụng kháng sinh không kiểm soát trong chăn nuôi gia đình và tự mua thuốc tại các hiệu thuốc tư nhân.
• Thuyết Di truyền liên kết ngang (Horizontal Gene Transfer - HGT Theory): Củng cố mô hình tiếp hợp (conjugation) qua trung gian plasmid liên kết. Kết quả chứng minh các plasmid mang cụm gen đề kháng $bla_{CTX-M-1}$, $bla_{CTX-M-9}$ có thể chuyển giao chéo sang chủng nhận E. coli chuẩn phòng thí nghiệm với hiệu suất cao, xác nhận cơ chế lan truyền ngang độc lập với sự phân chia tế bào theo chiều dọc.
• Mô hình Tương tác Độc lực - Đề kháng (Virulence-Resistance Trade-off Framework): Thách thức quan điểm truyền thống của González et al. (2013) và Mashayekhi et al. (2014) cho rằng vi khuẩn có sự đánh đổi sinh học (tính kháng thuốc cao thì độc lực giảm). Luận án cung cấp bằng chứng cho thấy các chủng E. coli đa kháng (MDR) cộng sinh vẫn đồng thời mang các gen độc lực nguy hiểm ($EAST1$, gen của các nhóm EAEC, EPEC, ETEC), tạo nên hiện tượng tích hợp kép: vừa kháng kháng sinh phổ rộng vừa tiềm tàng khả năng gây bệnh bùng phát.

              +----------------------------------------------------------------+
              |           KHUNG PHÂN TÍCH TÍCH HỢP 3 CẤP ĐỘ PHÂN TỬ             |
              +----------------------------------------------------------------+
                                              |
      +---------------------------------------+---------------------------------------+
      |                                       |                                       |
      v                                       v                                       v
[CẤP ĐỘ 1: KIỂU HÌNH & GEN KHÁNG]    [CẤP ĐỘ 2: TIẾN HÓA & ĐỘC LỰC]         [CẤP ĐỘ 3: PHÁT TÁN DI TRUYỀN]
- Kháng sinh đồ 16 đĩa (CLSI)       - Clermont PCR: Nhóm A, B1, B2, D      - Plasmid PCR-Replicon Typing
- Double-disk synergy test (CAZ/CTX)- Multiplex PCR xác định Gen độc lực   - Southern Blotting (Enzyme S1)
- Multiplex PCR: CTX-M, TEM, SHV      (EAEC, ETEC, EPEC, EIEC, EHEC)       - Conjugation Assay (Tiếp hợp)
- Real-time PCR: Gen mcr-1          - Điện di xung trường (PFGE)           - Xác định tần số chuyển gen

Khung phân tích độc đáo

Nghiên cứu xây dựng khung phân tích vi sinh học phân tử đa tầng, tích hợp đồng thời:

1. Định danh kiểu hình và kháng sinh đồ: Áp dụng tiêu chuẩn nghiêm ngặt của Viện Tiêu chuẩn Lâm sàng và Phòng thí nghiệm Hoa Kỳ (CLSI) kết hợp đĩa phối hợp Acid Clavulanic (CAZ-C, CTX-C).
2. Định nhóm sinh học - phân tử: Sử dụng hệ thống phân nhóm phát sinh loài Clermont (chuA, yjaA, đoạn DNA TspE4.C2) để định vị sinh thái học của chủng (nhóm cộng sinh A, B1 đối chiếu với nhóm gây bệnh ngoài đường ruột B2, D).
3. Phân tích plasmid và di truyền động: Kết hợp kỹ thuật PCR Replicon Typing phân loại 18 nhóm plasmid không tương thích (Incompatibility groups - Inc) theo quy trình Carattoli (2005), kỹ thuật lai phân tử Southern Blot với đầu dò đánh dấu đặc hiệu và thử nghiệm tiếp hợp in vitro.

Boundary conditions (điều kiện biên) của khung phân tích được xác định rõ: áp dụng cho các chủng E. coli phân lập từ mẫu phân người khỏe mạnh không có triệu chứng tiêu hóa cấp tính trong vòng 3 tháng và không sử dụng kháng sinh nhập viện trong thời gian lấy mẫu.

---

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

+----------------------------------------------------------------------------------------------------+
|                                    QUY TRÌNH PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU                                |
+----------------------------------------------------------------------------------------------------+
| [1. Thu thập mẫu]   ---> Chọn mẫu ngẫu nhiên đại diện tại 4 thôn (xã Nguyên Xá, Thái Bình)         |
|                                                                                                    |
| [2. Nuôi cấy chọn lọc]--> Cấy phân trên thạch MacConkey chứa Cefotaxime (1 µg/ml)                 |
|                                                                                                    |
| [3. Định danh vi sinh]-> Sinh hóa cổ điển (TSI, CLIG, LIM, Indol, Citrate Simmons)                 |
|                                                                                                    |
| [4. Xác nhận ESBL]  ---> Double Disk Synergy Test (CAZ/CAZ-C, CTX/CTX-C) theo chuẩn CLSI           |
|                                                                                                    |
| [5. Phân tích phân tử]-> Multiplex PCR (blaCTX-M, blaTEM, blaSHV), Real-time PCR (mcr-1)          |
|                                                                                                    |
| [6. Sinh thái & Độc lực]-> Clermont Triplex PCR (chuA, yjaA, TspE4C2) + PCR Virulence Genes        |
|                                                                                                    |
| [7. Động thái Di truyền]-> PFGE với enzym XbaI + S1-Southern Blot + In Vitro Conjugation           |
+----------------------------------------------------------------------------------------------------+

Thiết kế nghiên cứu

• Triết lý nghiên cứu (Research Philosophy): Nghiên cứu theo trường phái Thực chứng (Positivism) và Hiện thực phê phán (Critical Realism), vận dụng các chỉ số sinh học định lượng chính xác, khả năng tái lập nghiệm ngặt và đối chứng chuẩn mực quốc tế.
• Thiết kế dịch tễ học: Nghiên cứu mô tả cắt ngang có phân tích dịch tễ học phân tử (Cross-sectional molecular epidemiological design).
• Cỡ mẫu và địa bàn: Điều tra toàn diện tại xã Nguyên Xá (huyện Vũ Thư, tỉnh Thái Bình) – khu vực dân số 7.730 người, 2.008 hộ gia đình phân bổ trên 4 thôn: Ngô Xá, Kiến Xá, Thôn Thái và Hoàng Xá.

Quy trình nghiên cứu thực nghiệm

1. Sàng lọc và phân lập vi sinh:
   • Mẫu phân tươi từ người tình nguyện khỏe mạnh được thu thập vô trùng, bảo quản lạnh và vận chuyển ngay về phòng xét nghiệm.
   • Nuôi cấy chọn lọc trên môi trường thạch MacConkey có bổ sung Cefotaxime nồng độ $1,\mu\text{g/ml}$ để chọn lọc vi khuẩn kháng cephalosporin.
   • Định danh tính chất sinh vật hóa học đặc trưng của E. coli: lên men đường lactose/glucose sinh hơi trên thạch ba đường sắt (TSI), indole dương tính, methyl red dương tính, citrate Simmons âm tính, không sinh $H_2S$ trên môi trường LIM và CLIG.
2. Xác định kiểu hình ESBL:
   • Phương pháp khoanh giấy kết hợp theo hướng dẫn CLSI: đĩa Ceftazidime ($30,\mu\text{g}$) so với Ceftazidime/Clavulanic acid ($30/10,\mu\text{g}$), Cefotaxime ($30,\mu\text{g}$) so với Cefotaxime/Clavulanic acid ($30/10,\mu\text{g}$).
   • Tiêu chuẩn xác nhận: Đường kính vòng ức chế của đĩa kháng sinh kết hợp acid clavulanic tăng $\ge 5,\text{mm}$ so với đĩa kháng sinh đơn độc.
3. Phân tích sinh học phân tử:
   • Hệ thống PCR đa mồi (Multiplex PCR): Khuếch đại đặc hiệu các họ gen $bla_{CTX-M}$ (nhóm 1, 2, 8, 9, 25), $bla_{TEM}$, $bla_{SHV}$.
   • Real-time PCR: Sử dụng cặp mồi và mẫu dò huỳnh quang TaqMan chuyên biệt để phát hiện gen kháng colistin $mcr-1$.
   • Phân nhóm phát sinh loài (Phylogenetic typing): Phản ứng triplex PCR xác định tổ hợp 3 đoạn gen chuẩn: gen $chuA$ (vận chuyển hemin), gen $yjaA$ (chức năng chưa rõ ở chủng chuẩn K12), và đoạn DNA phân đoạn $TspE4.C2$.
   • Điện di xung trường (PFGE): Sử dụng enzyme cắt giới hạn $XbaI$, chạy điện di trong gel agarose với hệ thống điện trường đa hướng để thiết lập cây phả hệ phân tích tính tương đồng di truyền (genetic relatedness).
   • Southern Blot và Thử nghiệm tiếp hợp (Conjugation): Cắt plasmid bằng endonuclease S1, chuyển màng lai nylon tích điện dương và lai với mẫu dò $bla_{CTX-M}$ đánh dấu digoxigenin. Tiến hành tiếp hợp trên màng lọc với chủng nhận E. coli J53 hoặc C600 để xác định tần số chuyển giao plasmid đề kháng.

---

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

1. Tỷ lệ lưu hành vi khuẩn E. coli sinh ESBL ở người khỏe mạnh nông thôn ở mức rất cao:
   • Nghiên cứu ghi nhận một tỷ lệ đáng kể người dân khỏe mạnh tại cộng đồng nông thôn xã Nguyên Xá mang E. coli sinh ESBL trong đường ruột. Kết quả này phản ánh tình trạng phát tán kháng kháng sinh diện rộng ngoài môi trường bệnh viện, vượt xa mức cảnh báo tại các nước phát triển.
2. Kháng đa thuốc (MDR) chiếm ưu thế áp đảo ở các chủng phân lập:
   • Các chủng E. coli sinh ESBL phân lập được thể hiện mức độ kháng đa thuốc trầm trọng. Tỷ lệ kháng đồng thời từ 3 đến hơn 8 loại kháng sinh thuộc các nhóm khác nhau (cephalosporins thế hệ 1, 2, 3, 4; fluoroquinolones: Ciprofloxacin; aminoglycosides: Gentamicin; co-trimoxazole: SXT; phenicols: Chloramphenicol; tetracyclines) chiếm tỷ lệ áp đảo.
3. Sự thống trị của nhóm gen $bla_{CTX-M}$ ($bla_{CTX-M-1}$ và $bla_{CTX-M-9}$):
   • Phân tích kiểu gen cho thấy họ gen $bla_{CTX-M}$ xuất hiện với tần số cao nhất trong các chủng sinh ESBL, vượt trội hoàn toàn so với $bla_{TEM}$ và $bla_{SHV}$. Đáng chú ý, các chủng thường mang đồng thời nhiều phân nhóm gen kháng phối hợp ($bla_{CTX-M-1} + bla_{CTX-M-9}$ hoặc kết hợp với $bla_{TEM}$), làm gia tăng hoạt tính thủy phân kháng sinh.
4. Phát hiện sự lưu hành của gen kháng colistin $mcr-1$ trong cộng đồng:
   • Luận án cung cấp bằng chứng thực nghiệm quan trọng về việc phát hiện gen $mcr-1$ trên các chủng E. coli sinh ESBL ở người khỏe mạnh tại địa bàn nông thôn qua kỹ thuật Real-time PCR. Đây là phát hiện mang tính cảnh báo khẩn cấp vì colistin là "vũ khí kháng sinh cuối cùng" (last-resort antibiotic) trong điều trị nhiễm khuẩn Gram âm đa kháng.
5. Cơ cấu nhóm phát sinh loài (Phylogenetic groups) và sự tích hợp gen độc lực:
   • Các chủng phân lập phân bố chủ yếu ở nhóm phát sinh loài A và B1 (nhóm vi khuẩn cộng sinh đường ruột truyền thống), nhưng một tỷ lệ đáng kể thuộc nhóm D và B2 (nhóm có tiềm năng độc lực cao). Đồng thời, nhiều chủng cộng sinh vẫn mang các gen độc lực gây tiêu chảy nguy hiểm như $EAST1$ (độc tố của EAEC) và các gen của ETEC/EPEC.
6. Khả năng chuyển gen kháng thuốc in vitro qua tiếp hợp plasmid với hiệu suất cao:
   • Kết quả lai Southern Blot và tiếp hợp in vitro khẳng định các gen $bla_{CTX-M}$ nằm trên các plasmid có kích thước lớn ($50 - 200,\text{kb}$) thuộc các nhóm Inc tự chuyển giao. Các plasmid này dễ dàng truyền sang chủng vi khuẩn nhận, kéo theo sự đồng chuyển giao tính kháng với aminoglycoside, tetracycline và trimethoprim/sulfamethoxazole.

+------------------------------------------------------------------------------------+
|                MÔ HÌNH PHÁT TÁN VÀ HỆ QUẢ DỊCH TỄ HỌC ĐA CHIỀU                     |
+------------------------------------------------------------------------------------+
|                                                                                    |
| [Ổ chứa Cộng đồng: Người khỏe mạnh] ------> Mang vi khuẩn E. coli sinh ESBL/MDR    |
|                  |                                                                 |
|                  +----> Mang gen blaCTX-M, blaTEM và gen siêu kháng mcr-1         |
|                  |                                                                 |
|                  +----> Plasmid IncF/IncI1 tiếp hợp chuyển ngang sang vi khuẩn khác|
|                  |                                                                 |
|                  v                                                                 |
| [Hậu quả Điều trị] ---------> Thất bại phác đồ Cephalosporin thế hệ 3, 4           |
|                               Nguy cơ kháng chéo Carbapenem & Colistin             |
+------------------------------------------------------------------------------------+

Implications đa chiều

• Về mặt lý thuyết: Cung cấp bằng chứng thực địa cho mô hình One Health (Một sức khỏe), chứng minh mối liên kết mật thiết giữa môi trường sống nông thôn, thói quen sử dụng thuốc và sự biến đổi hệ gen vi sinh vật đường ruột.
• Về mặt phương pháp luận: Chuẩn hóa quy trình tích hợp từ nuôi cấy vi sinh cổ điển, sàng lọc kháng sinh đồ chuẩn CLSI đến các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại (PFGE, S1-Southern Blot, PCR Replicon Typing) có thể chuyển giao cho các trung tâm y tế dự phòng.
• Về mặt thực tiễn và chính sách:
  • Cảnh báo ngành y tế về sự suy giảm hiệu lực của các cephalosporin thế hệ 3 trong điều trị ban đầu nhiễm khuẩn cộng đồng.
  • Cung cấp cơ sở khoa học để Cục Quản lý Khám chữa bệnh và Cục Y tế Dự phòng (Bộ Y tế) thắt chặt quy chế bán thuốc kháng sinh theo đơn tại các nhà thuốc tư nhân nông thôn.
  • Ban hành chính sách kiểm soát nghiêm ngặt việc phối trộn colistin và cephalosporin trong thức ăn chăn nuôi gia súc, gia cầm tại các hộ nông dân.

---

Limitations và Future Research

Hạn chế nghiên cứu (Limitations)

1. Giới hạn không gian và địa bàn nghiên cứu: Dữ liệu thu thập tập trung tại xã Nguyên Xá, huyện Vũ Thư, tỉnh Thái Bình. Dù mang tính đại diện cao cho khu vực nông thôn đồng bằng sông Hồng, nghiên cứu cần được mở rộng sang các vùng sinh thái khác (miền núi, ven biển, đô thị hóa nhanh) để có bức tranh toàn cảnh.
2. Thiết kế cắt ngang (Cross-sectional nature): Nghiên cứu chưa theo dõi dọc (longitudinal study) động học thải trừ hoặc tồn lưu vi khuẩn sinh ESBL trong hệ vi sinh đường ruột của từng cá thể theo thời gian.
3. Chưa áp dụng Giải trình tự toàn bộ hệ gen (Whole Genome Sequencing - WGS): Tại thời điểm thực hiện (2016–2020), nghiên cứu sử dụng PFGE, PCR đa mồi và MLST. Việc chưa ứng dụng WGS hạn chế khả năng phân tích chi tiết cấu trúc transposon, integron và các đột biến điểm tinh vi trên toàn bộ plasmid.

Định hướng nghiên cứu tương lai (Future Research Agenda)

[Hướng 1: Ứng dụng WGS & Metagenomics]  ---> Giải trình tự toàn bộ hệ gen vi sinh đường ruột
[Hướng 2: Nghiên cứu Dọc Longitudinal]   ---> Đánh giá thời gian lưu giữ chủng ESBL ở người lành
[Hướng 3: Tiếp cận One Health chuyên sâu]---> Phân tích giải trình tự so sánh Người - Vật nuôi - Đất/Nước
[Hướng 4: Động học Plasmid & Phage]     ---> Nghiên cứu can thiệp ức chế plasmid tiếp hợp và liệu pháp phage

• Hướng nghiên cứu 1: Ứng dụng công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS/WGS) để lập bản đồ cấu trúc toàn bộ plasmid mang gen $bla_{CTX-M}$ và $mcr-1$, xác định chính xác các điểm chèn $ISEcp1$ và integron lớp 1.
• Hướng nghiên cứu 2: Thiết kế nghiên cứu đoàn hệ theo dõi người mang chủng sinh ESBL trong 12–24 tháng nhằm xác định các yếu tố nguy cơ dẫn đến nhiễm khuẩn thứ phát hoặc khả năng tự đào thải của hệ vi khuẩn bản địa.
• Hướng nghiên cứu 3: Triển khai mô hình One Health liên ngành: lấy mẫu đồng thời trên người khỏe mạnh, phân gia súc/gia cầm nuôi tại hộ gia đình và nguồn nước thải sinh hoạt để truy xuất nguồn gốc lây truyền chéo.

---

Tác động và ảnh hưởng

+------------------------------------------------------------------------------------+
|                                MA TRẬN TÁC ĐỘNG VÀ ẢNH HƯỞNG                       |
+------------------------------------------------------------------------------------+
| LĨNH VỰC           | HÀNH ĐỘNG VÀ KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG                               |
+--------------------+---------------------------------------------------------------+
| Học thuật Quốc tế  | Đóng góp dữ liệu dịch tễ Nam Á/Đông Nam Á cho mạng lưới WHO   |
| Y tế Lâm sàng      | Cập nhật hướng dẫn điều trị kháng sinh theo kinh nghiệm       |
| Y tế Dự phòng      | Thiết lập hệ thống chỉ số giám sát vi sinh tại cộng đồng      |
| Nông nghiệp & MT   | Thúc đẩy lộ trình cấm kháng sinh kích thích tăng trưởng       |
+------------------------------------------------------------------------------------+

• Tác động học thuật: Luận án bổ sung dữ liệu thực địa quan trọng từ Việt Nam vào bản đồ giám sát kháng thuốc toàn cầu của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) và Trung tâm Kiểm soát Bệnh tật Quốc tế. Các công bố từ luận án mở ra hướng tham chiếu cho các nghiên cứu dịch tễ phân tử tại các quốc gia có thu nhập trung bình và thấp.
• Chuyển đổi y tế dự phòng và điều trị: Cung cấp cơ sở chứng cứ để các bác sĩ lâm sàng thận trọng khi sử dụng cephalosporin phổ rộng điều trị theo kinh nghiệm cho các bệnh nhân đến từ cộng đồng nông thôn; thúc đẩy việc thực hiện kháng sinh đồ thường quy.
• Tác động chính sách xã hội: Tạo xung lực cho việc thực thi Chiến lược Quốc gia về Phòng chống Kháng thuốc tại Việt Nam, đặc biệt là kiểm soát hành vi bán thuốc không đơn tại nông thôn và ngăn chặn việc lạm dụng kháng sinh nhóm Polymyxin (Colistin) trong thú y.

---

Đối tượng hưởng lợi

+----------------------------------------------------------------------------------+
| Nghiên cứu sinh & Nhà khoa học | Bác sĩ Lâm sàng & Dược sĩ | Cơ quan Quản lý Y tế |
|  - Kế thừa quy trình PFGE/Lai   |  - Cảnh giác vi khuẩn MDR |  - Hoàn thiện chính  |
|  - Khung lý thuyết HGT/Clermont |  - Tránh lạm dụng Ceph-3  |    sách One Health   |
+----------------------------------------------------------------------------------+

1. Nghiên cứu sinh và Giới nghiên cứu Vi sinh - Dịch tễ: Kế thừa bộ công cụ phương pháp luận kết hợp chuẩn xác giữa vi sinh lâm sàng và sinh học phân tử (PFGE, Southern Blot, Replicon Typing).
2. Bác sĩ lâm sàng và Dược sĩ: Nhận thức rõ mức độ lưu hành của vi khuẩn kháng thuốc ở người không nằm viện, từ đó tối ưu hóa phác đồ điều trị kháng sinh ban đầu, hạn chế nguy cơ thất bại điều trị.
3. Cơ quan quản lý Y tế và Nông nghiệp: Sử dụng dữ liệu thực chứng để hoạch định chính sách quản lý nhà thuốc cộng đồng và thanh tra an toàn sinh học trong chăn nuôi nông hộ.

---

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của luận án là gì và đã mở rộng lý thuyết nào?

Luận án mở rộng trực tiếp Thuyết Tiến hóa chọn lọc vi sinh vật (Antimicrobial Selection Pressure Paradigm) và Thuyết Di truyền liên kết ngang (Horizontal Gene Transfer Theory) bằng cách chứng minh rằng: Cộng đồng người khỏe mạnh tại nông thôn đóng vai trò là ổ chứa chủ động (active reservoir) duy trì và khuếch đại các plasmid kháng đa thuốc mang gen $bla_{CTX-M}$ và $mcr-1$, chứ không đơn thuần là đối tượng thụ động tiếp nhận vi khuẩn từ bệnh viện.

2. Điểm cải tiến phương pháp luận so với các nghiên cứu trước đây là gì?

So với các nghiên cứu trước đây tại Việt Nam (thường chỉ dừng lại ở kháng sinh đồ đĩa giấy hoặc PCR phát hiện gen đơn thuần như Van Cao et al., 2001; Võ Thị Chi Mai et al., 2010), luận án này đã:

• Tích hợp chuỗi phương pháp phân tử chuyên sâu: Định nhóm sinh học Clermont, PCR Replicon Typing 18 nhóm plasmid (theo Carattoli), lai phân tử Southern Blot với enzyme S1, và chạy điện di xung trường PFGE với enzyme cắt giới hạn $XbaI$.
• Thực hiện thử nghiệm tiếp hợp in vitro thành công để chứng minh cơ chế truyền ngang độc lập của các plasmid kháng thuốc trên nền chủng nhận chuẩn.

3. Phát hiện bất ngờ và đáng chú ý nhất về mặt dịch tễ học phân tử là gì?

Phát hiện mang tính bước ngoặt là sự hiện diện của gen kháng colistin $mcr-1$ trên các chủng E. coli sinh ESBL phân lập từ người hoàn toàn khỏe mạnh tại nông thôn. Điều này chỉ ra rằng tính kháng các kháng sinh dự trữ tối khẩn cấp đã vượt ra khỏi ranh giới điều trị hồi sức tích cực bệnh viện và đang lưu hành âm thầm trong chuỗi sinh hoạt cộng đồng.

4. Luận án có cung cấp quy trình chuẩn để tái lập nghiên cứu (Replication Protocol) không?

Có. Luận án mô tả chi tiết từng bước: nồng độ chọn lọc trên môi trường thạch MacConkey chứa Cefotaxime ($1,\mu\text{g/ml}$), quy trình kiểm tra kiểu hình ESBL bằng đĩa đôi kết hợp acid clavulanic theo CLSI, trình tự các cặp mồi khuếch đại họ gen $bla_{CTX-M-1}$, $bla_{CTX-M-9}$, $bla_{TEM}$, $bla_{SHV}$, quy trình Real-time PCR cho $mcr-1$, chu trình nhiệt máy luân nhiệt, và điều kiện điện di xung trường PFGE.

5. Chương trình nghiên cứu 10 năm tiếp theo được định hình như thế nào?

Chương trình nghiên cứu dài hạn tập trung vào 3 trụ cột:

• Cột mốc 1-3 năm: Xây dựng bản đồ dịch tễ WGS toàn diện của các chủng E. coli cộng sinh tại đồng bằng sông Hồng.
• Cột mốc 3-5 năm: Ứng dụng Metagenomics theo dõi hệ vi sinh vật (Microbiome) và hệ gen kháng thuốc (Resistome) đường ruột dưới tác động của can thiệp dinh dưỡng và môi trường.
• Cột mốc 5-10 năm: Nghiên cứu phát triển các phân tử ức chế tiếp hợp plasmid (Conjugation inhibitors) và liệu pháp thực khuẩn thể (Bacteriophage therapy) nhằm loại bỏ chọn lọc các chủng vi khuẩn mang gen $bla_{CTX-M}$ và $mcr-1$ trong cộng đồng.

---

Kết luận

1. Khẳng định thực trạng dịch tễ: Luận án chứng minh người khỏe mạnh tại cộng đồng nông thôn xã Nguyên Xá, huyện Vũ Thư, tỉnh Thái Bình đang mang vi khuẩn E. coli sinh ESBL với tỷ lệ đáng báo động, xác lập bằng chứng khoa học vững chắc về sự tồn tại của ổ chứa vi khuẩn kháng thuốc ngoài lâm sàng.
2. Làm rõ đặc tính phân tử: Xác định kiểu gen $bla_{CTX-M}$ (đặc biệt là nhóm $bla_{CTX-M-1}$ và $bla_{CTX-M-9}$) là nguyên nhân phân tử chủ đạo quy định kiểu hình kháng cephalosporin phổ rộng, thường kết hợp với $bla_{TEM}$.
3. Cảnh báo tính kháng Colistin: Phát hiện sự hiện diện của gen siêu kháng thuốc $mcr-1$ trong cộng đồng dân cư khỏe mạnh bằng kỹ thuật Real-time PCR chuẩn xác.
4. Chứng minh cơ chế phát tán ngang: Xác nhận các plasmid kích thước lớn mang gen sinh ESBL có khả năng tiếp hợp truyền ngang sang các chủng E. coli khác với tần suất cao, thúc đẩy hiện tượng kháng đa thuốc (MDR).
5. Mở ra các hướng nghiên cứu mới: Đặt nền móng cho các nghiên cứu giải trình tự toàn bộ hệ gen (WGS), phân tích dịch tễ học liên ngành One Health và tìm kiếm các giải pháp sinh học ngăn chặn sự lan truyền plasmid kháng thuốc trong cộng đồng.
6. Giá trị thực tiễn lâu dài: Cung cấp luận cứ khoa học then chốt giúp các cơ quan hoạch định chính sách y tế và nông nghiệp ban hành các biện pháp kiểm soát sử dụng kháng sinh nghiêm ngặt, bảo vệ sức khỏe cộng đồng bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Thuốc kháng sinh đƣợc coi là một giải pháp cho loài ngƣời trong phòng và điều trị bệnh do nhiễm khuẩn. Tuy nhiên, trong những năm gần đây vi khuẩn kháng lại thuốc kháng sinh ngày càng nghiêm trọng và sự lan truyền các vi khuẩn kháng kháng sinh đang trở thành mối đe dọa lớn cho sức khỏe cộng đồng trên toàn thế giới. Có nhiều cơ chế kháng kháng sinh, trong đó cơ chế ức chế bằng enzyme β-lactamase phổ mở rộng, hay còn đƣợc gọi là ESBL (Extended - Spectrum Beta -Lactamase) là cơ chế thƣờng gặp. ESBL là các enzyme do vi khuẩn sinh ra, chúng có khả năng làm bất hoạt các thuốc nhóm β-lactam bằng cách phá hủy nối amide của vòng β-lactam vì vậy các vi khuẩn có enzyme này kháng lại các kháng sinh nhóm β-lactam rất hiệu quả.

ESBL thƣờng đƣợc tìm thấy trong các nhóm Enterobacteriaceae, thƣờng gặp ở Escherichia coli (E. coli là vi khuẩn sống cộng sinh trong đƣờng tiêu hóa, nhƣng nó cũng là một trong những tác nhân gây bệnh khá phổ biến ở ngƣời. Trên nhiều chủng E. coli sinh ESBL, các plasmid không chỉ mang gen mã hóa sinh ESBL mà còn kèm các gen kháng kháng sinh khác, vì vậy các vi khuẩn này có thể kháng đồng thời nhiều loại kháng sinh [32].

Mặt khác, các chủng E. coli mang gen mã hóa sinh ESBL còn có khả năng truyền các gen kháng kháng sinh cho các vi khuẩn khác trong cùng loài hoặc cho các loài vi khuẩn gây bệnh khác nhƣ: Salmonella, Shigella. làm gia tăng tình trạng kháng kháng sinh trong cộng đồng và gây ra những khó khăn trong điều trị lâm sàng [32, 101]. Trên thế giới, tỷ lệ nhiễm E.

coli sinh ESBL chiếm tỷ lệ từ 5% đến 62%. Tỷ lệ này cao ở khu vực châu Á, đặc biệt là các nƣớc khu vực Nam Á và Trung Quốc (trên 50%) ở cả bệnh viện và cộng đồng [61, 92]. 2 Tại Việt Nam, tỉ lệ nhiễm E. coli sinh ESBL là tƣơng đối cao: 18% đến 57,3 % trong bệnh viện [61, 92].

Hầu hết các nghiên cứu có liên quan đến E. coli sinh ESBL chủ yếu là trên các bệnh phẩm của bệnh nhân tại bệnh viện, rất ít các nghiên cứu đƣợc thực hiện trên ngƣời khỏe mạnh tại cộng đồng. Đặc biệt những thông tin về đặc điểm vi sinh y học của vi khuẩn E. coli sinh ESBL tại cộng đồng hầu nhƣ chƣa đƣợc thông báo.

Vì vậy cần thiết có những nghiên cứu trên ngƣời khỏe mạnh tại cộng đồng nhằm đánh giá thực trạng nhiễm, đặc điểm vi sinh học của vi khuẩn E. coli sinh ESBL tại cộng đồng, góp phần đƣa ra bức tranh tổng thể về dịch tễ học của vi khuẩn E. coli tại cộng đồng, cung cấp cơ sở khoa học cho việc thiết lập hệ thống giám sát, phòng ngừa sự lây nhiễm và lan truyền vi khuẩn kháng kháng sinh tại cộng đồng. Do đó chúng tôi thực hiện đề tài ―Xác định một số đặc điểm vi sinh của Escherichia coli sinh beta lactamase phổ mở rộng ở người khỏe mạnh tại cộng đồng huyện Vũ Thư, tỉnh Thái Bình, năm 2016‖ với các mục tiêu sau: 1.

Xác định sự lưu hành của Escherichia coli sinh beta-lactamase phổ mở rộng ở người khỏe mạnh tại cộng đồng, huyện Vũ Thư, tỉnh Thái Bình, năm 2016. Xác định một số đặc điểm sinh học của các chủng Escherichia coli sinh beta-lactamase phổ mở rộng phân lập được từ người khỏe mạnh tại cộng đồng. 3 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tình hình nhiễm và kháng kháng sinh của E.

coli sinh β-lactamase phổ mở rộng ở ngƣời 1. Tình hình nhiễm E. coli sinh β-lactamase phổ mở rộng ở người 1. Trên thế giới a.

Trong bệnh viện Vi khuẩn sinh ESBL đƣợc phát hiện lần đầu tiên vào năm 1983 tại Tây Âu. Sau đó không lâu, ESBL đƣợc phát hiện ở Mỹ và Châu Á, hiện nay nó đã lan ra toàn cầu và là vấn đề thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới. ESBL xuất hiện ở nhiều vi khuẩn trong đó chủ yếu là ở nhóm trực khuẩn gram âm, thƣờng gặp ở E. Theo chƣơng trình giám sát xu hƣớng kháng kháng sinh trên toàn thế giới (SMART) giai đoạn 2002 – 2011 ở 179 bệnh viện trên thế giới cho thấy: E.

coli là nguyên nhân hàng đầu gây nhiễm khuẩn ổ bụng (47,8%) và nhiễm khuẩn tiết niệu (44,3%). Trong nhiễm khuẩn ổ bụng, vi khuẩn sinh ESBL cao ở châu Á, Mỹ Latinh và Trung Đông (20% - 40%); châu Âu, Bắc Mỹ, Nam Thái Bình Dƣơng và châu Phi có tỷ lệ thấp hơn (5-15%). Trong nhiễm khuẩn tiết niệu tỷ lệ vi khuẩn sinh ESBL cao nhất ở châu Á và Trung Đông (30% - 50%), tiếp đến là Mỹ Latinh và châu Âu (khoảng 20%), tỷ lệ này thấp nhất ở châu Phi, Nam Thái Bình Dƣơng và Bắc Mỹ (khoảng 10%). Tỷ lệ ESBL ở cả bệnh nhân nhiễm khuẩn ở bụng và nhiễm khuẩn tiết niệu tăng theo thời gian ở hầu hết các khu vực, đặc biệt là ở châu Á và Trung Đông [92].

Tỷ lệ ESBL ở E. mirabilis trong nhiễm khuẩn ổ bụng theo các vùng từ SMART từ 2002 – 2011 [92]. Tỷ lệ ESBL ở E. mirabilis trong nhiễm trùng tiết niệu theo các vùng từ SMART từ 2002 - 2011 [92].

Trong báo cáo giám sát hàng năm của Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa bệnh tật châu Âu (ECDC, 2012) cho thấy tỷ lệ sinh ESBL của các chủng E. coli kháng cephalosporin thế hệ ba ở 23 quốc gia thuộc châu Âu rất cao (70,5% đến 100%). Có tới 16 trong 23 quốc gia báo cáo có tỷ lệ sinh ESBL ở các chủng E. coli kháng cephalosporin thế hệ ba là trên 85%, thậm chí ở một số nƣớc nhƣ Hungary, Lithuania và Rumania tỷ lệ này lên đến 100% [115].

Qua các nghiên cứu giám sát về tình hình vi khuẩn kháng kháng sinh ở 5 khu vực châu Á - Thái Bình Dƣơng cho thấy, E. coli sinh ESBL có xu hƣớng ngày càng gia tăng. Nghiên cứu SMART từ năm 2007: Trong tổng số 3004 chủng Gram âm đƣợc phân lập năm 2007 ở khu vực châu Á - Thái Bình Dƣơng tỷ lệ sinh ESBL ở E. Tỷ lệ này cao ở các nƣớc Ấn Độ (79%), Trung Quốc (55%), Thái Lan (50,8%).

Các nƣớc có tỷ lệ E. coli sinh ESBL trung bình là Việt Nam (34,4%), Singapore (33,3%). Các quốc gia có tỉ lệ thấp hơn (3,2 - 22,7%) là Hàn Quốc, Hồng Công, Philipine, Đài Loan, Úc, New Zealand [61]. Tỷ lệ nhiễm các vi khuẩn sinh ESBL ở các nước khu vực châu Á-Thái Bình Dương [61].

Nghiên cứu SMART trên 17.350 chủng vi khuẩn Gram âm phân lập từ bệnh nhân nhiễm khuẩn ổ bụng ở 54 bệnh viện thuộc 13 nƣớc trong vùng châu Á - Thái Bình Dƣơng giai đoạn 2010 - 2013 cho thấy: E. coli là tác nhân chủ yếu (46,1%). Tỷ lệ sinh ESBL ở E. Trong đó tỷ lệ E.

coli sinh ESBL trong các nhiễm khuẩn tại bệnh viện cao nhất ở Ấn Độ (79%), Trung Quốc (55%), Thái Lan (50%) và Việt Nam (34,4%). Ở các nƣớc này tỷ lệ E. coli sinh ESBL trong các nhiễm khuẩn cộng đồng là khoảng 20% [41]. Nhóm nghiên cứu của tác giả Villegas thực hiện trên các chủng vi khuẩn Gram âm đƣợc thu thập từ các bệnh nhân nhiễm khuẩn ổ bụng từ 23 trung tâm thuộc 10 nƣớc Mỹ Latinh cho thấy trong E.

coli là các tác nhân phổ 6 biến nhất, tỷ lệ sinh ESBL ở E. Một nghiên cứu đƣợc thực hiện ở Nam Phi giai đoạn 1998-1999 cho thấy tỷ lệ E. coli sinh ESBL là 5,1 % [28]. Nghiên cứu gần đây của tác giả Sangare và cộng sự tại 2 bệnh viện lớn ở Mali cho thấy: tỷ lệ sinh ESBL của các vi khuẩn đƣờng ruột phân lập từ máu bệnh nhân là 62,3 %.

coli sinh ESBL chiếm 64,5% [108]. Tại cộng đồng Một số nghiên cứu gần đây cho thấy vi khuẩn E. coli sinh ESBL không chỉ xuất hiện trong bệnh viện mà còn đƣợc phát hiện ở cả những ngƣời khỏe mạnh tại cộng đồng ở nhiều nơi trên thế giới. Tại Thụy Sĩ: Theo nghiên cứu của tác giả Geser và cộng sự trên mẫu phân của 586 ngƣời khỏe mạnh tại Thụy Sĩ năm 2013 cho thấy có 5,8 % ngƣời khỏe mạnh nhiễm E.

coli sinh ESBL [51]. Tại Pháp: Tác giả Nicolas - Chanoine thông báo tỷ lệ mang E. coli sinh ESBL ở những ngƣời trƣởng thành khỏe mạnh tại khu vực Pari tăng lên gấp 10 lần sau 5 năm (0,6% vào năm 2006 và 6% vào năm 2011) [98]. Kết quả nghiên cứu của tác giả Valenza (2014) trên 3344 mẫu phân ngƣời khỏe mạnh trong cộng đồng có tiếp xúc gần với bệnh nhân nhiễm khuẩn tiêu hóa tại Đức cho thấy tỷ lệ sinh ESBL là 6,3% trong cộng đồng [119].

Tại Trung Quốc, tác giả Li B (2009) công bố có tới 50,5% mẫu phân của những ngƣời khỏe mạnh tham gia nghiên cứu có chứa vi khuẩn E. coli sinh ESBL [78]. Nghiên cứu trên 160 ngƣời khỏe mạnh ở vùng nông thôn Thái Lan năm 2008 của tác giả Sasaki cho thấy tỷ lệ những ngƣời tham gia nghiên cứu có mang vi khuẩn sinh ESBL trong mẫu phân là 61,7%. coli chiếm ƣu thế với tỷ lệ 85,1% [109].

Theo một kết quả nghiên cứu trên 150 ngƣời tình nguyện khỏe mạnh tại 7 Tunisia năm 2009-2010 cho thấy tỷ lệ mang E. coli sinh ESBL trong đƣờng tiêu hóa tại cộng đồng là 7,3% [29]. Tại Việt Nam a. Trong bệnh viện Hiện nay E.

coli sinh ESBL đã lƣu hành rộng khắp trên các bệnh viện trong cả nƣớc. Vi khuẩn này là một trong các tác nhân gây các bệnh nhiễm khuẩn trong bệnh viện nhƣ nhiễm khuẩn tiết niệu, nhiễm khuẩn tiêu hóa với tỷ lệ kháng kháng sinh cao. Theo số liệu của chƣơng trình quốc gia giám sát độ nhạy cảm với kháng sinh (Antibiotic Susceptibility Testing Surveillance – ASTS) 2002 - 2006 từ 10 đơn vị thành viên ở Bắc, Trung, Nam, và các dữ liệu từ các bệnh viện nhiều nơi gửi về cho thấy: bệnh viện càng lớn bao nhiêu thì tỷ lệ các vi khuẩn sinh ESBL càng tăng cao và tỷ lệ vi khuẩn sinh ESBL cũng tăng dần theo từng năm. Tỷ lệ ở các bệnh viện theo thời gian đƣợc thể hiện ở bảng 1.

coli sinh ESBL ở một số bệnh viện (ASTS) Bệnh viện E. coli sinh ESBL ASTS- Bộ Y tế (2004) 7,7% (n=548) Bệnh viện Chợ Rẫy 51,6% Bệnh viện Việt Đức 34,2% Bệnh viện Bình Định 36,2% Bệnh viện Việt Tiệp 36,1% Bệnh viện Bạch Mai (2005) 18,5% Bệnh viện Bạch Mai (2006) 21,5% Bệnh viện Bạch Mai (2007) 41,2% Bệnh viện Bạch Mai (2008) 42,2% Tác giả Hoàng Thị Phƣơng Dung nghiên cứu 204 chủng vi khuẩn Gram âm phân lập đƣợc tại bệnh viện Đại học Y Dƣợc thành phố Hồ Chí Minh từ 7 - 12/2008 công bố có 32,2% các chủng vi khuẩn sinh ESBL, trong đó 8 E. coli chiếm tỷ lệ cao nhất (71,2%) [6].