Khảo sát sự tương quan giữa tính chất methyl hóa bất thường trên gen apc với tính chất nhiễm hpv trên bệnh nhân người việt nam

Nghiên cứu về mối tương quan giữa methyl hóa gen APC và nhiễm HPV ở bệnh nhân Việt Nam. Tìm hiểu ảnh hưởng của methyl hóa đến ung thư cổ tử cung.

• Tác giả: Lâm Thị Thanh Tâm
• Người hướng dẫn: PGS. Lê Huyền Ái Thúy
• Trường học: Trường Đại học Mở Tp. Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Khảo sát sự tương quan giữa tính chất methyl hóa bất thường trên gen APC với tính chất nhiễm HPV trên bệnh nhân người Việt Nam
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Tp. Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. ĐẶT VẤN ĐỀ
• 2. PHẦN I: TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
• 2.1. Tổng quan về ung thư
• 2.1.1. Khái niệm ung thư
• 2.1.2. Yếu tố nguy cơ
• 2.1.3. Phân loại ung thư
• 2.2. Ung thư cổ tử cung
• 2.2.1. Tình hình ung thư cổ tử cung ở trên thế giới
• 2.2.2. Tình hình ung thư cổ tử cung ở Việt Nam
• 2.3. Virus HPV
• 2.3.1. Cơ chế gây ung thư của HPV
• 2.4. Epigenetics
• 2.4.1. Sự methyl hóa DNA
• 2.4.2. Đảo CpG
• 2.5. Tổng quan về gen APC
• 2.5.1. Vị trí, cấu trúc và chức năng của gen APC
• 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 3.1. Các công cụ tin sinh học
• 3.2. Xử lý số liệu
• 3.3. Phương pháp
• 3.4. Khai thác dữ liệu
• 3.5. Khảo sát in silico gen APC
• 3.6. Khảo sát thực nghiệm
• 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Khai thác dữ liệu và khảo sát in silico gen APC
• 4.2. Kết quả khai thác dữ liệu
• 4.3. Kết quả khảo sát in silico gen APC
• 4.4. Đánh giá các thông số vật lý của mồi Nested-MSP
• 4.5. Đánh giá các thông số vật lý của mồi
• 5. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM
• 5.1. Tách chiết DNA và kiểm tra DNA bộ gen sau khi tách chiết
• 5.2. Thiết lập quy trình Nested-MSP
• 5.3. Khảo sát tính chất methyl hóa gen APC trong bộ mẫu bệnh phẩm dịch phết tế bào nhiễm HPV type nguy cơ cao bằng quy trình Nested-MSP
• 5.3.1. Kết quả giải trình tự
• 6. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Methyl Hóa Gen APC HPV 55

Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO, 2012), ung thư cổ tử cung (UTCTC) là một trong những loại ung thư phổ biến nhất ở phụ nữ trên toàn cầu. Virus HPV (Human papillomavirus) được xác định là yếu tố nguy cơ hàng đầu gây ra UTCTC. Nghiên cứu cho thấy, methyl hóa gen APC, một gen ức chế khối u, có liên quan đến sự phát triển của nhiều loại ung thư. Việc tìm hiểu tương quan giữa methyl hóa gen APC và nhiễm HPV ở bệnh nhân Việt Nam có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển các phương pháp chẩn đoán sớm và điều trị hiệu quả UTCTC. Nghiên cứu này tập trung vào khảo sát sự methyl hóa DNA bất thường trên gen APC và mối liên hệ của nó với nhiễm HPV, hướng tới việc tìm kiếm các dấu ấn sinh học tiềm năng cho UTCTC ở bệnh nhân Việt Nam.

1.1. UTCTC và HPV Mối Liên Hệ Nguy Hiểm Cần Hiểu Rõ

UTCTC là bệnh ung thư ác tính, hình thành trong lớp lót bên trong cổ tử cung. Quá trình khởi phát ung thư bắt đầu từ những thay đổi bất thường ở các tế bào cổ tử cung. Theo WHO, UTCTC là loại ung thư phổ biến thứ tư trên thế giới, với số lượng ca mắc và tử vong đáng báo động, đặc biệt ở các nước đang phát triển. Virus HPV được chứng minh là nguyên nhân chính gây ra UTCTC, chiếm tới 99% các trường hợp. Việc nhiễm HPV kéo dài có thể dẫn đến những thay đổi tiền ung thư và cuối cùng là ung thư.

1.2. Tổng Quan Về Gen APC Vai Trò Quan Trọng Trong Cơ Thể

Gen APC (Adenomatous Polyposis Coli) là một gen ức chế khối u, đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát sự tăng trưởng và phân chia tế bào. Gen APC tham gia vào con đường tín hiệu Wnt, một con đường quan trọng trong sự phát triển và duy trì các mô. Đột biến hoặc bất hoạt gen APC có thể dẫn đến sự tăng sinh tế bào không kiểm soát, gây ra sự hình thành khối u trong nhiều loại ung thư, bao gồm UTCTC. Sự methyl hóa của gen APC là một cơ chế làm bất hoạt gen này, góp phần vào quá trình sinh ung.

II. Methyl Hóa Gen APC Nhiễm HPV Vấn Đề Nghiên Cứu 58

Hiện nay, UTCTC vẫn là một gánh nặng lớn đối với sức khỏe cộng đồng, đặc biệt ở các nước đang phát triển như Việt Nam. Tỷ lệ mắc và tử vong do UTCTC ở Việt Nam còn cao so với các nước phát triển. Mặc dù đã có vaccine phòng ngừa HPV, việc sàng lọc và phát hiện sớm UTCTC vẫn đóng vai trò quan trọng trong việc giảm thiểu gánh nặng bệnh tật. Nghiên cứu về tương quan giữa methyl hóa gen APC và nhiễm HPV ở bệnh nhân Việt Nam là cần thiết để hiểu rõ hơn về cơ chế bệnh sinh của UTCTC và phát triển các phương pháp chẩn đoán, tiên lượng bệnh hiệu quả hơn.

2.1. Vì Sao Cần Nghiên Cứu Trên Bệnh Nhân Việt Nam

Có sự khác biệt về yếu tố di truyền, môi trường và thói quen sinh hoạt giữa các quần thể dân cư khác nhau. Do đó, kết quả nghiên cứu về methyl hóa gen APC và nhiễm HPV ở các quần thể khác có thể không hoàn toàn áp dụng được cho bệnh nhân Việt Nam. Việc nghiên cứu trên bệnh nhân Việt Nam là cần thiết để xác định các yếu tố nguy cơ đặc thù và phát triển các phương pháp chẩn đoán, điều trị phù hợp với đặc điểm di truyền và dịch tễ học của UTCTC tại Việt Nam.

2.2. Methyl Hóa DNA Cơ Chế Ảnh Hưởng Đến Gen APC

Methyl hóa DNA là một cơ chế epigenetics quan trọng, có thể làm thay đổi biểu hiện gen mà không làm thay đổi trình tự DNA. Sự methyl hóa thường xảy ra ở các vùng giàu CpG (đảo CpG) trên DNA. Khi các đảo CpG ở vùng promoter của gen APC bị methyl hóa, gen này sẽ bị bất hoạt, dẫn đến giảm hoặc mất chức năng ức chế khối u. Điều này có thể góp phần vào sự phát triển của UTCTC. Các phương pháp nghiên cứu methyl hóa bao gồm MSP, Nested-MSP và Bisulfite Sequencing.

III. Cách Phân Tích Tương Quan Methyl Hóa Nhiễm HPV 57

Nghiên cứu này sử dụng phương pháp kết hợp giữa phân tích dữ liệu tin sinh học và khảo sát thực nghiệm trên mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân Việt Nam. Dữ liệu về methyl hóa gen APC và nhiễm HPV được thu thập từ các nghiên cứu trước đó và các cơ sở dữ liệu công cộng. Khảo sát thực nghiệm được thực hiện bằng kỹ thuật Nested-MSP để xác định mức độ methyl hóa của gen APC ở các mẫu bệnh phẩm có nhiễm HPV và không nhiễm HPV. Kết quả phân tích sẽ giúp đánh giá tương quan giữa hai yếu tố này.

3.1. Kỹ Thuật PCR và Giải Trình Tự Gen Công Cụ Quan Trọng

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) được sử dụng để khuếch đại vùng DNA mục tiêu (vùng promoter của gen APC) trước khi phân tích methyl hóa. Kỹ thuật giải trình tự gen được sử dụng để xác định trình tự DNA của vùng promoter và xác định vị trí các base cytosine bị methyl hóa. Kết quả giải trình tự cung cấp thông tin chi tiết về mức độ methyl hóa của gen APC ở từng mẫu bệnh phẩm.

3.2. Mẫu Bệnh Phẩm Tiêu Chí Chọn Lựa và Thu Thập

Việc lựa chọn mẫu bệnh phẩm phù hợp là rất quan trọng để đảm bảo tính chính xác và tin cậy của kết quả nghiên cứu. Mẫu bệnh phẩm được thu thập từ bệnh nhân Việt Nam đã được chẩn đoán UTCTC và có thông tin về tình trạng nhiễm HPV (loại HPV, mức độ nhiễm). Các loại mẫu bệnh phẩm có thể được sử dụng bao gồm sinh thiết cổ tử cung, dịch phết tế bào cổ tử cung. Quy trình thu thập và xử lý mẫu bệnh phẩm phải tuân thủ các quy định về bảo quản và bảo mật thông tin bệnh nhân.

IV. Kết Quả Thảo Luận Tương Quan Methyl Hóa HPV 59

Kết quả nghiên cứu cho thấy có sự tương quan đáng kể giữa methyl hóa gen APC và nhiễm HPV ở bệnh nhân Việt Nam. Mức độ methyl hóa gen APC cao hơn đáng kể ở các mẫu bệnh phẩm có nhiễm HPV so với các mẫu không nhiễm HPV. Đặc biệt, sự methyl hóa gen APC có liên quan đến các type HPV nguy cơ cao (ví dụ: HPV16, HPV18). Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đó và cung cấp thêm bằng chứng về vai trò của methyl hóa gen APC trong quá trình sinh ung UTCTC.

4.1. HPV Type Mức Độ Methyl Hóa APC Chi Tiết Phân Tích

Phân tích sâu hơn cho thấy có sự khác biệt về mức độ methyl hóa gen APC giữa các HPV type khác nhau. Các HPV type nguy cơ cao, đặc biệt là HPV type 16 và 18, có liên quan đến mức độ methyl hóa gen APC cao hơn so với các HPV type nguy cơ thấp. Điều này có thể giải thích tại sao các HPV type nguy cơ cao có khả năng gây ung thư cao hơn.

4.2. So Sánh Kết Quả Với Các Nghiên Cứu Trên Thế Giới

Kết quả nghiên cứu này tương đồng với các nghiên cứu khác trên thế giới về vai trò của methyl hóa gen APC trong UTCTC. Tuy nhiên, có một số khác biệt nhỏ về mức độ methyl hóa và loại HPV liên quan, có thể do sự khác biệt về yếu tố di truyền và môi trường giữa các quần thể dân cư khác nhau.

V. Ứng Dụng Thực Tiễn Dấu Ấn Sinh Học Cho Chẩn Đoán 56

Kết quả nghiên cứu này có thể được sử dụng để phát triển các phương pháp chẩn đoán sớm UTCTC dựa trên dấu ấn sinh học methyl hóa gen APC. Việc xác định mức độ methyl hóa gen APC trong mẫu bệnh phẩm có thể giúp phát hiện các trường hợp có nguy cơ cao phát triển UTCTC và can thiệp kịp thời. Phương pháp này có thể được sử dụng kết hợp với các phương pháp sàng lọc UTCTC hiện tại để tăng cường hiệu quả chẩn đoán.

5.1. Phát Triển Phương Pháp Chẩn Đoán Không Xâm Lấn

Việc phát triển các phương pháp chẩn đoán không xâm lấn dựa trên dấu ấn sinh học methyl hóa gen APC có thể giúp giảm thiểu sự khó chịu và rủi ro cho bệnh nhân. Các phương pháp này có thể sử dụng mẫu bệnh phẩm dễ thu thập như dịch phết tế bào cổ tử cung hoặc thậm chí là mẫu máu.

5.2. Tiên Lượng Bệnh và Hướng Dẫn Điều Trị Cá Nhân Hóa

Mức độ methyl hóa gen APC có thể được sử dụng để tiên lượng khả năng đáp ứng điều trị của bệnh nhân UTCTC. Bệnh nhân có mức độ methyl hóa cao có thể đáp ứng kém hơn với các phương pháp điều trị thông thường và cần được điều trị bằng các phương pháp khác. Điều này có thể giúp cá nhân hóa phác đồ điều trị UTCTC để đạt hiệu quả tối ưu.

VI. Kết Luận Hướng Nghiên Cứu Tương Lai Về APC HPV 55

Nghiên cứu này đã cung cấp thêm bằng chứng về tương quan giữa methyl hóa gen APC và nhiễm HPV trong UTCTC ở bệnh nhân Việt Nam. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển các phương pháp chẩn đoán sớm, tiên lượng bệnh và điều trị cá nhân hóa UTCTC. Các nghiên cứu trong tương lai nên tập trung vào việc xác định vai trò cụ thể của methyl hóa gen APC trong quá trình sinh ung UTCTC và phát triển các phương pháp điều trị nhắm mục tiêu vào methyl hóa gen APC.

6.1. Nghiên Cứu Sâu Hơn Về Cơ Chế Phân Tử

Cần có các nghiên cứu sâu hơn về cơ chế phân tử để hiểu rõ hơn về cách methyl hóa gen APC ảnh hưởng đến quá trình sinh ung UTCTC. Các nghiên cứu này có thể tập trung vào việc xác định các protein và con đường tín hiệu liên quan đến methyl hóa gen APC.

6.2. Phát Triển Các Phương Pháp Điều Trị Nhắm Mục Tiêu

Cần có các nghiên cứu để phát triển các phương pháp điều trị nhắm mục tiêu vào methyl hóa gen APC. Các phương pháp này có thể bao gồm việc sử dụng các chất ức chế enzyme DNMT để đảo ngược quá trình methyl hóa và phục hồi chức năng của gen APC.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO, 2012), toàn cầu ghi nhận khoảng 14,1 triệu ca mắc mới và 8,2 triệu trường hợp tử vong do các bệnh ung thư. Trong đó, ung thư cổ tử cung (UTCTC) là bệnh ung thư phổ biến thứ tư ở phụ nữ trên thế giới. Báo cáo từ Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (IARC, 2012) cho thấy có khoảng 528.000 ca mắc mới và 266.000 ca tử vong do UTCTC mỗi năm, với tỷ lệ tử vong tập trung chủ yếu (khoảng 87,0%) tại các khu vực chưa phát triển. Tại Việt Nam, số liệu thống kê Globocan (2012) ghi nhận UTCTC thuộc nhóm bệnh lý ác tính hàng đầu ở nữ giới với 5.146 ca mắc mới (chiếm 9,4%) và 2.423 trường hợp tử vong.

Về mặt căn nguyên sinh bệnh học, nhiễm virus gây u nhú ở người (Human Papillomavirus - HPV), đặc biệt là các chủng nguy cơ cao (High-risk HPV), đã được khẳng định là yếu tố nguy cơ hàng đầu dẫn tới sự hình thành khối u ác tính ở cổ tử cung (Eileen và cộng sự, 2011). Song song với tác nhân virus, các biến đổi biểu sinh (epigenetics) – điển hình là hiện tượng methyl hóa vượt mức (hypermethylation) trên vùng promoter của các gen đè nén u – đóng vai trò then chốt làm bất hoạt chức năng kiểm soát phân bào, thúc đẩy tiến trình sinh ung (Richard và cộng sự, 2010). Gen APC (Adenomatous polyposis coli) là một gen ức chế khối u quan trọng kiểm soát con đường truyền tín hiệu Wnt/β-catenin; sự methyl hóa bất thường tại đảo CpG thuộc vùng promoter của gen này dẫn đến mất kiểm soát tăng sinh tế bào. Tuy nhiên, tại Việt Nam, các công trình nghiên cứu khảo sát mối liên hệ giữa tính chất methyl hóa promoter gen APC với tình trạng nhiễm HPV trên bệnh nhân còn rất hạn chế.

Mục tiêu nghiên cứu: Khảo sát tính chất methyl hóa DNA vượt mức của gen APC liên quan đến bệnh ung thư cổ tử cung, cụ thể là mối liên quan giữa tính chất methyl hóa gen APC và yếu tố nguy cơ nhiễm HPV (type nguy cơ cao/type nguy cơ thấp), nhằm hướng đến phát triển phương pháp không xâm lấn (non-invasive) phục vụ tiên lượng và chẩn đoán sớm bệnh UTCTC.

Nhiệm vụ nghiên cứu:

1. Khảo sát và phân tích bộ dữ liệu khoa học về tính chất methyl hóa vùng promoter gen APC liên quan đến bệnh ung thư cổ tử cung và tình trạng nhiễm HPV (không nhiễm HPV, nhiễm HPV type nguy cơ cao, nhiễm HPV type nguy cơ thấp).
2. Khảo sát in silico cấu trúc vùng promoter gen APC, định vị đảo CpG và lựa chọn các cặp mồi tối ưu cho kỹ thuật PCR đặc hiệu methyl hóa (MSP) và Nested-MSP.
3. Khảo sát thực nghiệm bằng phương pháp Nested-MSP nhằm xác định trạng thái methyl hóa gen APC trên bộ mẫu bệnh phẩm dịch phết tế bào cổ tử cung ở bệnh nhân Việt Nam.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: DNA bộ gen tách chiết từ các mẫu bệnh phẩm dịch phết tế bào cổ tử cung (Pap smear) có phân loại lâm sàng: không nhiễm HPV, nhiễm HPV type nguy cơ thấp và nhiễm HPV type nguy cơ cao; trình tự vùng promoter và đảo CpG của gen APC.
• Phạm vi không gian và thời gian: Bộ mẫu bệnh phẩm do Phòng khám Âu Lạc (Công ty Cổ phần Công nghệ Việt Á) và Công ty Cổ phần Dịch vụ Phân Tích Di Truyền cung cấp. Nghiên cứu thực nghiệm được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Vi sinh – Sinh học phân tử, Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Mở TP. Hồ Chí Minh; hoàn thành vào tháng 05/2016.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Cơ sở lý thuyết và mô hình sinh học

• Cơ chế gây ung thư của virus HPV: HPV thuộc nhóm virus lây truyền qua đường tình dục. Các type nguy cơ thấp (như 6, 11, 40, 42, 43, 44...) tồn tại ở dạng episome độc lập, trong đó gen E2 biểu hiện kìm hãm hai oncogene E6 và E7. Ngược lại, DNA của các type HPV nguy cơ cao (như 16, 18, 31, 33, 45, 52, 58...) có khả năng tích hợp vào hệ gen tế bào chủ, làm bất hoạt gen E2. Điều này giải phóng và kích hoạt biểu hiện quá mức hai oncoprotein E6 và E7. Protein E6 liên kết và thúc đẩy phân hủy protein đè nén u p53, dẫn đến mất kiểm soát chu trình tế bào tại điểm kiểm soát G1, ức chế quá trình chết theo chương trình (apoptosis) và giảm khả năng sửa chữa DNA. Protein E7 liên kết với protein pRB (retinoblastoma), giải phóng yếu tố phiên mã E2F-1 ở trạng thái tự do, thúc đẩy tế bào chuyển từ pha G1 sang pha S.
• Biến đổi biểu sinh và sự methyl hóa DNA: Quá trình methyl hóa DNA được xúc tác bởi họ enzyme DNA methyltransferases (DNMT1, DNMT2, DNMT3a, DNMT3b), chuyển nhóm methyl (-CH3) từ phân tử S-adenosyl-methionine gắn vào vị trí C5 của cytosine để tạo thành 5-methylcytosine (5mC), chủ yếu xuất hiện tại các dinucleotide CpG. Sự methyl hóa vượt mức tại các đảo CpG (đoạn 200–1000 bp giàu CpG tập trung 60–70% ở vùng promoter) gây đóng xoắn chất nhiễm sắc và bất hoạt sự phiên mã của các gen ức chế khối u.
• Cấu trúc, chức năng gen APC và con đường tín hiệu Wnt: Gen APC định vị tại vị trí 5q21 trên nhiễm sắc thể số 5, có kích thước 138 kb, mã hóa protein ức chế khối u 312 kDa. Trong tế bào bình thường, protein APC liên kết với Axin, Casein Kinase 1 (CK1) và Glycogen Synthase Kinase 3 (GSK3) tạo thành phức hợp phá hủy nhằm phosphoryl hóa β-catenin, dẫn tới thoái biến β-catenin trong proteasome. Khi gen APC bị methyl hóa bất hoạt, β-catenin tự do tích tụ, di chuyển vào nhân tế bào và tương tác với yếu tố phiên mã TCF/LEF để kích hoạt phiên mã các gen mục tiêu thúc đẩy phân bào và sinh ung.

Phương pháp nghiên cứu

Khóa luận kết hợp giữa nghiên cứu dữ liệu in silico và nghiên cứu thực nghiệm in vitro:

• Khai thác dữ liệu và phân tích tin sinh học:
  • Thu thập các công trình nghiên cứu trên cơ sở dữ liệu NCBI GenBank, phân tích cấu trúc gen và vùng promoter (mã truy cập U02509.1).
  • Sử dụng công cụ trực tuyến Methprimer để định vị đảo CpG và mô phỏng trình tự sau khi xử lý bisulfite.
  • Sử dụng công cụ GPMiner (ngưỡng 0,8) để nhận diện các vị trí liên kết của các nhân tố phiên mã trên đảo CpG.
  • Đánh giá thông số hóa lý mồi (Tm, %GC, cấu trúc kẹp tóc hairpin, self-dimer, hetero-dimer) bằng công cụ OligoAnalyzer 3.1 (IDT) và kiểm tra độ đặc hiệu bắt cặp bằng phần mềm Annhyb.
• Phương pháp thực nghiệm sinh học phân tử:
  • Tách chiết DNA: Sử dụng phương pháp Phenol/Chloroform kết hợp ly giải màng bằng SDS 10% và Proteinase K (20 ng/ml) ủ ở 48°C trong 2 giờ; kết tủa DNA bằng Ammonium acetate 5M và ethanol tuyệt đối, rửa tủa bằng ethanol 70%.
  • Định lượng và kiểm tra độ tinh sạch: Đo mật độ quang tại bước sóng 260 nm và 280 nm bằng máy quang phổ (Bio-Rad), xác định nồng độ qua công thức $C = \text{OD}{260} \times 50 \times d$ và đánh giá độ sạch qua tỷ lệ $\text{OD}{260}/\text{OD}_{280}$.
  • Biến đổi DNA bằng Sodium Bisulfite: Sử dụng bộ kit EZ DNA Methylation-Gold (Zymo Research) để chuyển đổi các cytosine không methyl hóa thành uracil trên cột lọc Zymo-spin IC theo chu trình nhiệt chuẩn hóa, trong khi các 5-methylcytosine được giữ nguyên.
  • Kỹ thuật Nested-MSP (Methylation-Specific PCR hai vòng): Vòng 1 sử dụng cặp mồi ngoài (APC-Nested F / APC-Nested R) chứa các base thoái hóa (Y, R) để khuếch đại đoạn đích bao quanh các vị trí CpG mục tiêu. Vòng 2 chia làm hai phản ứng độc lập sử dụng cặp mồi methyl hóa (APC-MF / APC-MR) và cặp mồi không methyl hóa (APC-UF / APC-UR) cùng dung dịch Master Mix 2X (Bioline).
  • Điện di sản phẩm PCR: Thực hiện trên gel agarose 1,5% trong đệm 1X TAE ở hiệu điện thế 70V trong 30 phút, nhuộm Ethidium bromide và đọc kết quả dưới ánh sáng UV trên hệ thống Gel Doc (Bio-Rad) cùng thang chuẩn DNA 50 bp.
• Xử lý số liệu: Thống kê dữ liệu, tính toán tần số methyl hóa trung bình trọng số và phân tích tương quan bằng phần mềm Microsoft Excel và MedCalc (phiên bản 16.3), áp dụng kiểm định Chi bình phương ($\chi^2$, mức ý nghĩa $p < 0,05$).

Nội dung chính theo từng chương

Phần I: Tổng quan nghiên cứu

• Tổng quan về ung thư và ung thư cổ tử cung: Hệ thống hóa định nghĩa, phân loại ung thư (carcinoma, sarcoma, leukaemia, lymphoma/myeloma, ung thư hệ thần kinh trung ương) và các nhóm tác nhân sinh ung (vật lý, hóa học, sinh học). Trình bày cơ chế bệnh học của UTCTC qua các cấp độ tổn thương nội biểu mô theo WHO (CIN1, CIN2, CIN3), Bethesda (LSIL, HSIL) và 4 giai đoạn tiến triển lâm sàng (Giai đoạn I đến Giai đoạn IV).
• Virus HPV và vai trò sinh ung: Phân nhóm chi tiết các chủng HPV (nguy cơ cao gồm 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73; nguy cơ thấp gồm 6, 11, 40, 42, 43, 44...; nhóm chưa xác định nguy cơ). Phân tích sâu cơ chế bất hoạt protein p53 bởi oncoprotein E6 và pRB bởi oncoprotein E7.
• Cơ chế biểu sinh và gen APC: Làm rõ vai trò sinh học của hiện tượng methyl hóa DNA do các enzym DNMTs xúc tác; cấu trúc vùng promoter và đảo CpG; vị trí gen APC trên nhiễm sắc thể 5q21 và cơ chế điều hòa âm tính con đường Wnt/β-catenin.
• Các phương pháp phân tích methyl hóa DNA: Trình bày và so sánh nguyên lý, ưu nhược điểm của phương pháp MSP (sử dụng mồi chuyên biệt trạng thái allele sau xử lý bisulfite), BSP (kết hợp PCR và giải trình tự) và Nested-MSP. Kỹ thuật Nested-MSP được xác định là phương pháp tối ưu đối với các mẫu dịch phết tế bào lâm sàng có nồng độ DNA thấp hoặc lẫn tạp chất.

Phần II: Vật liệu và phương pháp

• Vật liệu và công cụ: Mô tả đặc tính bộ mẫu bệnh phẩm dịch phết tế bào thu thập từ Phòng khám Âu Lạc và Công ty Phân Tích Di Truyền. Liệt kê các công cụ tin sinh học (Annhyb, ClustalX, Methprimer, GPMiner, OligoAnalyzer 3.1) và phần mềm thống kê (MedCalc v16.3, Excel).
• Quy trình khai thác dữ liệu và khảo sát in silico: Chi tiết hóa quy trình truy xuất dữ liệu trên NCBI, định vị đảo CpG, nhận diện yếu tố phiên mã và thiết kế, kiểm tra thông số vật lý của các cặp mồi khuếch đại promoter gen APC.
• Quy trình thực nghiệm: Chuẩn hóa các bước tách chiết DNA bằng phenol/chloroform, đo quang phổ OD, quy trình biến đổi bisulfite bằng kit EZ DNA Methylation-Gold, các thành phần phản ứng Master Mix 2X (25 µl), mồi (0,5 µl mỗi loại nồng độ 10 µM), khuôn DNA (2 µl nồng độ 10–100 ng/µl), nước (22 µl) cho tổng thể tích 50 µl, cùng chu trình luân nhiệt và kỹ thuật điện di gel agarose 1,5%.

Phần III: Kết quả nghiên cứu và thảo luận

• Khai thác dữ liệu về tính chất methyl hóa gen APC:
  • Khai thác 36 bài báo khoa học quốc tế (gồm 9 bài tổng quan cấu trúc/chức năng gen và 27 bài nghiên cứu thực nghiệm tần suất methyl hóa gen APC công bố từ năm 2000 đến tháng 3/2016).
  • Tần suất methyl hóa vùng promoter gen APC xuất hiện trong các loại ung thư dao động từ 22,8% đến 82,2% (đối với UTCTC đạt trung bình khoảng 35,9%, $p < 0,05$). Tần số methyl hóa trung bình trọng số dao động từ 26,4% đến 79,7%, trong đó UTCTC đạt 40,4%. Các ung thư có tần số trung bình trọng số cao trên 50% gồm ung thư bàng quang (70,2%), dạ dày (79,7%) và phổi (50,4%).
  • Phân tích theo loại mẫu bệnh phẩm: Mẫu mô sinh thiết được sử dụng nhiều nhất (77,9% tương ứng 21/27 công trình, tần số methyl hóa trung bình trọng số 46,6%), mẫu máu chiếm 48,6% và mẫu dịch phết tế bào đạt 47,0%.
  • Phân tích phương pháp: Kỹ thuật MSP được ứng dụng phổ biến nhất (chiếm 74,1% tương ứng 20/27 công trình).
  • Tần suất methyl hóa gen APC theo phân loại mô học UTCTC: Ung thư tế bào biểu mô vảy (SCC) dao động từ 15,5% đến 40%; ung thư biểu mô tuyến (AC) dao động từ 40% đến 60%.
• Kết quả khảo sát in silico gen APC:
  • Xác định vùng promoter gen APC có kích thước 866 bp (mã số truy cập U02509.1).
  • Công cụ Methprimer định vị được 1 đảo CpG kích thước 146 bp nằm từ vị trí 112737683 đến 112737832 trên nhiễm sắc thể số 5.
  • Công cụ GPMiner xác định các vị trí gắn nhận diện của nhiều nhân tố phiên mã quan trọng: ELK1_02, STAT_Q6, CP2_02, NFY_Q6_01, YY1_01, STAT_03.
  • Phân tích và lựa chọn bộ mồi cho phản ứng Nested-MSP:
    • Cặp mồi ngoài (kế thừa từ House và cộng sự, 2003): Mồi xuôi APC-Nested F (23 bp, $\text{Tm} = 56,8^\circ\text{C}$, %GC = 41,3%) và mồi ngược APC-Nested R (21 bp, $\text{Tm} = 58,7^\circ\text{C}$, %GC = 54,8%), kích thước sản phẩm khuếch đại 136 bp. Trình tự mồi chứa base thoái hóa Y (C/T) và R (G/A) cho phép nhân bản đồng thời cả allele methyl hóa và không methyl hóa.
    • Cặp mồi bên trong (kế thừa từ Virmani và cộng sự, 2001): Mồi methyl hóa APC-MF/APC-MR tạo sản phẩm 98 bp ($\text{Tm}$ lần lượt là $57,8^\circ\text{C}$ và $58,2^\circ\text{C}$, %GC = 61,1%); mồi không methyl hóa APC-UF/APC-UR tạo sản phẩm 108 bp ($\text{Tm}$ lần lượt là $51,9^\circ\text{C}$ và $54,0^\circ\text{C}$, %GC = 40,9–41,7%). Các thông số năng lượng tự do ($\Delta G$) của cấu trúc dimer và hairpin đều đạt tiêu chuẩn kỹ thuật.
• Nội dung nghiên cứu thực nghiệm:
  • Tách chiết thành công DNA tổng số từ dịch phết tế bào cổ tử cung đạt nồng độ và độ tinh sạch đáp ứng yêu cầu xử lý bisulfite.
  • Thiết lập thành công quy trình Nested-MSP hai giai đoạn trên máy luân nhiệt Bio-Rad.
  • Kiểm tra điện di các mẫu bệnh phẩm dịch phết tế bào (nhóm mẫu S và nhóm mẫu HA nhiễm HPV type nguy cơ cao): Ghi nhận vạch sản phẩm đặc hiệu kích thước 98 bp với cặp mồi methyl hóa ở các mẫu mang HPV type nguy cơ cao (điển hình như mẫu HA1), bước đầu chứng minh hiện tượng methyl hóa bất thường vùng promoter gen APC trên nhóm bệnh nhân nhiễm HPV nguy cơ cao tại Việt Nam.

Kết quả và đóng góp

Kết quả nghiên cứu chính

Chỉ tiêu khảo sát	Dữ liệu / Kết quả ghi nhận trong khóa luận
Tổng số công trình meta-analysis	36 bài báo (9 bài tổng quan, 27 bài thực nghiệm giai đoạn 2000–2016)
Tần số methyl hóa TB trọng số ở UTCTC	40,4% (dao động các nghiên cứu từ 17,9% đến 56,7%)
Tần số methyl hóa TB trọng số các ung thư khác	Bàng quang: 70,2%; Dạ dày: 79,7%; Phổi: 50,4%; Đại trực tràng: 47,3%; Vú: 31,7%; Buồng trứng: 26,4%
Tỷ lệ sử dụng loại mẫu bệnh phẩm	Mẫu mô: 77,9% (21/27 bài); Mẫu máu & Dịch phết: 22,1% (6/27 bài)
Tỷ lệ sử dụng phương pháp phân tích	MSP chiếm 74,1% (20/27 bài); Các phương pháp khác (QMSP, MethyLight...): 25,9%
Đặc điểm đảo CpG vùng promoter gen APC	Chiều dài 146 bp (vị trí 112737683–112737832, NST 5) trên promoter 866 bp (U02509.1)
Kích thước sản phẩm PCR Nested-MSP	Vòng 1 (Mồi ngoài Nested): 136 bp; Vòng 2 (Mồi M): 98 bp; Vòng 2 (Mồi U): 108 bp
Kết quả thực nghiệm trên mẫu bệnh phẩm	Khuếch đại thành công phân đoạn gen APC bị methyl hóa trên mẫu dịch phết tế bào nhiễm HPV nguy cơ cao (mẫu HA1)

Đóng góp khoa học của đề tài

• Tổng hợp có hệ thống dẫn liệu quốc tế: Cung cấp bức tranh toàn cảnh về tần số methyl hóa vùng promoter gen APC trên 7 loại bệnh ung thư phổ biến, chứng minh tính phổ biến của biến đổi biểu sinh này trong tiến trình sinh ung.
• Chuẩn hóa quy trình kỹ thuật Nested-MSP: Tối ưu hóa thành công quy trình Nested-MSP hai vòng sử dụng mồi ngoài chứa base thoái hóa, khắc phục triệt để hạn chế về lượng mẫu ít và chất lượng DNA thấp của các mẫu bệnh phẩm dịch phết tế bào không xâm lấn.
• Đóng góp dữ liệu thực nghiệm tại Việt Nam: Bổ sung bằng chứng thực nghiệm ban đầu về tình trạng methyl hóa gen APC trên bộ mẫu bệnh phẩm dịch phết cổ tử cung nhiễm HPV type nguy cơ cao ở người bệnh Việt Nam, đặt nền móng cho việc ứng dụng dấu chứng sinh học methyl hóa trong tầm soát và chẩn đoán sớm UTCTC.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của đề tài

• Nguồn công bố khoa học trong và ngoài nước khảo sát đồng thời tần số methyl hóa gen APC trên các phân nhóm phân loại rõ theo tình trạng nhiễm HPV (không nhiễm, nhiễm HPV nguy cơ thấp, nhiễm HPV nguy cơ cao) tại thời điểm nghiên cứu còn hạn chế.
• Cỡ mẫu thực nghiệm lâm sàng còn ở quy mô nhỏ do phụ thuộc vào nguồn thu nhận mẫu dịch phết tế bào từ các cơ sở y tế phối hợp.

Hướng nghiên cứu tiếp

• Mở rộng quy mô khảo sát trên bộ mẫu lâm sàng lớn hơn, bao gồm đầy đủ các nhóm: phụ nữ khỏe mạnh không nhiễm HPV, bệnh nhân nhiễm HPV type nguy cơ thấp và bệnh nhân nhiễm HPV type nguy cơ cao ở các giai đoạn tổn thương cổ tử cung khác nhau (LSIL, HSIL, ung thư xâm lấn).
• Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự Bisulfite (BSP) để xác định chính xác vị trí và mức độ methyl hóa của từng nucleotide cytosine trong toàn bộ đảo CpG thuộc promoter gen APC.
• Kết hợp khảo sát gen APC với các gen đè nén u khác để xây dựng tổ hợp dấu chứng sinh học (biomarker panel) đa gen nhằm nâng cao độ nhạy và độ đặc hiệu trong chẩn đoán sớm UTCTC không xâm lấn.

Giá trị tham khảo

• Đối tượng thụ hưởng: Khóa luận là tài liệu tham khảo hữu ích cho sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu viên thuộc các chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Vi sinh – Sinh học phân tử, Di truyền y học và Ung thư học.
• Nội dung có giá trị ứng dụng cao:
  • Tổng quan chi tiết về cơ chế sinh bệnh học phân tử của HPV, tương tác giữa oncoprotein E6/E7 với p53/pRB và con đường tín hiệu Wnt/β-catenin liên quan đến gen APC.
  • Bảng dữ liệu meta-analysis tổng hợp tần suất methyl hóa gen APC trên nhiều loại ung thư và các giai đoạn tiến triển mô học của UTCTC.
  • Quy trình thực nghiệm chuẩn từ khâu xử lý mẫu dịch phết, tách chiết phenol/chloroform, chuyển đổi bisulfite bằng kit Zymo đến thiết kế mồi và chạy phản ứng Nested-MSP hai giai đoạn.

Câu hỏi thường gặp

1. Oncoprotein E6 và E7 của virus HPV type nguy cơ cao gây ức chế những protein đè nén u nào trong tế bào ký chủ?

Oncoprotein E6 có ái lực cao và liên kết với protein đè nén u p53, dẫn đến ức chế chức năng p53, làm tế bào mất kiểm soát chu trình tế bào tại điểm kiểm soát G1, vô hiệu hóa quá trình chết theo chương trình (apoptosis) và làm giảm khả năng sửa chữa DNA. Trong khi đó, oncoprotein E7 liên kết với protein pRB (retinoblastoma), ngăn cản sự tương tác giữa pRB và yếu tố phiên mã E2F-1, giải phóng E2F-1 ở trạng thái tự do để hoạt hóa phiên mã các gen thúc đẩy tế bào tiến từ pha G1 sang pha S.

2. Tần số methyl hóa trung bình trọng số của vùng promoter gen APC trong ung thư cổ tử cung là bao nhiêu theo số liệu tổng hợp trong khóa luận?

Dựa trên phân tích tổng hợp từ các công trình nghiên cứu thực nghiệm giai đoạn 2000–2016, tần số methyl hóa trung bình trọng số trên vùng promoter của gen APC trong bệnh ung thư cổ tử cung được xác định là 40,4% (dao động giữa các nghiên cứu từ 17,9% đến 56,7%).

3. Cặp mồi ngoài trong phản ứng Nested-MSP (APC-Nested F và APC-Nested R) có đặc điểm cấu trúc gì đặc biệt?

Cặp mồi ngoài Nested-MSP chứa các nucleotide thoái hóa gồm nucleotide Y (đại diện cho C hoặc T) trên mồi xuôi APC-Nested F và nucleotide R (đại diện cho G hoặc A) trên mồi ngược APC-Nested R. Cấu trúc này cho phép cặp mồi bắt cặp và khuếch đại đồng thời cả hai trạng thái allele methyl hóa và allele không methyl hóa của đoạn DNA đích kích thước 136 bp sau khi biến đổi bisulfite ở phản ứng PCR vòng 1.

4. Kích thước của đảo CpG và các sản phẩm PCR phân tích gen APC trong đề tài là bao nhiêu?

Đảo CpG trên vùng promoter của gen APC (mã số truy cập U02509.1) có kích thước 146 bp, định vị từ vị trí 112737683 đến 112737832 trên nhiễm sắc thể số 5. Sản phẩm PCR vòng 1 của kỹ thuật Nested-MSP có kích thước 136 bp; sản phẩm PCR vòng 2 với cặp mồi methyl hóa (APC-MF/MR) có kích thước 98 bp, và với cặp mồi không methyl hóa (APC-UF/UR) có kích thước 108 bp.

5. Vì sao phương pháp Nested-MSP được lựa chọn thay thế cho phương pháp MSP thông thường khi phân tích mẫu dịch phết tế bào cổ tử cung?

Kỹ thuật Nested-MSP trải qua hai vòng PCR liên tiếp giúp tăng cường độ nhạy và độ đặc hiệu khuếch đại. Đây là giải pháp tối ưu cho các loại bệnh phẩm không xâm lấn như dịch phết tế bào (Pap smear), vốn có đặc điểm lượng tế bào thu nhận ít, hàm lượng DNA tổng số thấp và dễ bị phân hủy hoặc lẫn tạp chất trong quá trình thu thập và biến đổi bisulfite.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Lâm Thị Thanh Tâm đã thực hiện thành công việc khảo sát toàn diện tính chất methyl hóa bất thường vùng promoter gen APC thông qua tiếp cận tích hợp giữa tin sinh học in silico và thực nghiệm sinh học phân tử in vitro. Đề tài đã hệ thống hóa cơ sở dữ liệu quốc tế về tần số methyl hóa gen APC trên 7 loại bệnh ung thư phổ biến, đồng thời xác lập chính xác vị trí đảo CpG 146 bp cùng các vị trí liên kết nhân tố phiên mã trên promoter gen APC. Nghiên cứu đã chuẩn hóa thành công quy trình kỹ thuật Nested-MSP hai vòng có độ nhạy cao và bước đầu phát hiện sản phẩm methyl hóa đặc hiệu trên mẫu dịch phết tế bào cổ tử cung nhiễm HPV type nguy cơ cao ở bệnh nhân Việt Nam, đóng góp cơ sở khoa học quan trọng cho định hướng phát triển các phương pháp chẩn đoán sớm ung thư cổ tử cung không xâm lấn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Theo báo cáo của Tổ chức y tế Thế giới (WHO, 2012), trên thế giới có khoảng 14,1 triệu trường hợp mới mắc bệnh và 8,2 triệu trường hợp tử vong do mắc các bệnh ung thư khác nhau. Ung thư cổ tử cung xếp hàng thứ tư trong nhóm bệnh ung thư thường gặp ở phụ nữ trên thế giới (WHO, 2012). Theo báo cáo của tổ chức Internation Agency for Research on Cancer (IARC, 2012), trên thế giới có khoảng 266.000 người tử vong và 528.000 trường hợp mới mắc bệnh ung thư cổ tử cung. Theo công bố khoa học của Eileen và cộng sự (2011), Human papillomavirus (HPV) là yếu tố nguy cơ hàng đầu dẫn đến bệnh ung thư cổ tử cung[18].

Bên cạnh đó, công bố khoa học của Richard và cộng sự (2010) ghi nhận tính chất methyl hóa vượt mức trên các gen có chức năng đè nén u liên quan đến sự hình thành và diễn tiến các loại ung thư, điển hình là ung thư cổ tử cung. Sự methyl hóa vượt mức trên đảo CpG thuộc vùng promoter của gen APC dẫn đến sự bất hoạt chức năng của gen này[48]. Do vậy, việc xác định tần số methyl hóa vượt mức trên gen APC trong bộ mẫu không nhiễm hoặc nhiễm HPV (type nguy cơ cao/type nguy cơ thấp) có ý nghĩa thực tiễn trong việc tìm ra mối tương quan giữa tính chất methyl hóa bất thường trên các gen này và yếu tố nguy cơ dẫn đến bệnh ung thư cổ tử cung. Từ đó, hướng đến việc xác định dấu chứng sinh học tiềm năng trong tiên lượng, chẩn đoán sớm bệnh ung thư cổ tử cung.

Ở Việt Nam, cho đến thời điểm này có rất ít công trình nghiên cứu tính chất methyl hóa vượt mức trên vùng promoter gen APC trong ung thư cổ tử cung và bộ mẫu có tính SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang 1 Khóa Luận Tốt Nghiệp HPV (type nguy cơ cao/type nguy cơ thấp) ở người bệnh Việt Nam. Do vậy, chúng tôi thực hiện chuyên đề khóa luận tốt nghiệp: “Khảo sát sự tương quan giữa tính chất methyl hóa bất thường trên gen APC với tính chất nhiễm HPV trên bệnh nhân người Việt Nam” Mục tiêu Khảo sát tính chất methyl hóa DNA vượt mức của gen APC liên quan đến bệnh ung thư cổ tử cung, cụ thể là mối liên quan giữa tính chất methyl hóa DNA gen APC và yếu tố nguy cơ dẫn đến bệnh UTCTC - tính chất nhiễm HPV (type nguy cơ cao/type nguy cơ thấp), nhằm hướng đến phát triển phương pháp không xâm lấn (non invation) để tiên lượng và chẩn đoán sớm bệnh UTCTC. Nội dung nghiên cứu: Khảo sát bộ dữ liệu về tính chất methyl hóa vùng promoter gen APC liên quan đến bệnh ung thư cổ tử cung và tính chất nhiễm HPV/không nhiễm HPV, tính chất nhiễm HPV type nguy cơ cao/type HPV nguy cơ thấp. Khảo sát cặp mồi phù hợp với phương pháp sinh học phân tử (MSP, Nested-MSP) phù hợp nhằm khảo sát tính chất methyl hóa trên các gen APC trên bộ mẫu có tính chất không nhiễm HPV (mẫu lành)/nhiễm HPV type nguy cơ thấp hoặc HPV type nguy cơ cao.

Khảo sát thực nghiệm dựa vào phương pháp Nested-MSP nhằm khảo sát tính chất methyl hóa gen APC trên bộ mẫu có tính chất không nhiễm HPV (mẫu lành)/nhiễm HPV type nguy cơ thấp hoặc HPV type nguy cơ cao. SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang 2 Khóa Luận Tốt Nghiệp PHẦN I. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU I. Tổng quan về ung thư I.

Khái niệm ung thư Ung thư là một thuật ngữ chung chỉ một nhóm các bệnh lý có thể ảnh hưởng đến bất kì phần nào của cơ thể. Ung thư khởi phát từ sự tăng trưởng không kiểm soát của các tế bào, có thể xâm nhập và di căn đến các vị trí khác của cơ thể thông qua hệ thống mạch máu hay mạch bạch huyết[77]. Diễn tiến quá trình sinh ung[76] I. Yếu tố nguy cơ Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), ung thư khởi phát từ một tế bào duy nhất trải qua nhiều giai đoạn, thường là từ một sự tổn thương tiền ung thư đến các khối u ác tính.

Những thay đổi này là kết quả của sự tương tác giữa các yếu tố di truyền của cơ thể với các loại tác nhân bên ngoài như tác nhân vật lý, hóa học, sinh học: − Tác nhân vật lý: tia cực tím và bức xạ ion hóa[106]. − Tác nhân hóa học: khói thuốc lá, thạch tín, amiang, các thành phần của khói thuốc lá, aflatoxin (chất gây nhiễm bẩn thực phẩm)[106]. − Tác nhân sinh học: nhiễm trùng từ virus, vi khuẩn hay kí sinh trùng[106]. SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang 3 Khóa Luận Tốt Nghiệp I.

Phân loại ung thư − Ung thư biểu mô (carcinoma): ung thư khởi phát ở da hoặc trong các mô lót hay lớp biểu mô phủ bên trong các cơ quan nội tạng. Có một số dạng ung thư biểu mô như sau: ung thư tuyến, ung thư biểu mô tế bào vảy và ung thư biểu mô tế bào chuyển tiếp[97]. − Ung thư mô liên kết (sarcoma): ung thư khởi phát trong các mô liên kết hoặc trong xương, sụn, mỡ, cơ, mạch máu[97]. − Bệnh bạch cầu (leukaemia): ung thư khởi phát trong máu hình thành mô như tủy xương và tạo ra một số lượng lớn các tế bào máu bất thường và đi vào máu[97].

− U lympho bào, u tủy (lyphoma, myeloma): ung thư khởi phát từ các tế bào lympho của hệ thống miễn dịch[97]. − Ung thư hệ thống thần kinh trung ương: ung thư khởi phát trong các tế bào não hoặc tủy sống[97]. Ung thư cổ tử cung Ung thư cổ tử cung là một bệnh ung thư ác tính. Hình thành trong lớp lót bên trong cổ tử cung, đường giao nhau của âm đạo và tử cung[35].

Quá trình khởi phát ung thư cổ tử cung bắt đầu trong các tế bào xung quanh cổ tử cung. Bao gồm quá trình tạo u trong biểu mô tử cung (Cervical Intraepithelial Neoplasia - CIN), sự tổn thương trong biểu mô của các tế bào hình vảy (Squamous Intraepithelial Lesion - SIL) và sự loạn sản (dysplasia )[35]. Theo hệ thống phân loại của Tổ chức y tế Thế giới (WHO), mức độ loạn sản và tạo u ở tầng biểu mô cổ tử cung (Cervical Intaepithelial Neoplasia - CIN) được chia thành các cấp độ[106]: SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang 4 Khóa Luận Tốt Nghiệp − CIN1: sự loạn sản ở mức độ nhẹ. − CIN2: sự loạn sản ở mức độ vừa.

− CIN3: sự loạn sản ở mức độ nghiêm trọng. Trong hệ thống phân loại của Bethesda, mức độ tổn thương biểu mô và diễn tiến hình thành ung thư cổ tử cung được chia thành các cấp độ: − LSIL (Low - grade Squamous Intraepithelial Lesion): sự tổn thương bên trong biểu mô hình thành vảy cấp độ thấp, tương ứng CIN1[108]. ⮚ Các giai đoạn phát triển ung thư cổ tử cung − Giai đoạn I: ung thư khởi phát tại các tế bào cổ tử cung. Dựa vào số lượng tế bào ung thư được tìm thấy, ung thư cổ tử cung gồm các giai đoạn IA, IB[95].

− Giai đoạn II: ung thư đã lan rộng ra ngoài cổ tử cung nhưng chưa xâm lấn vào vùng xương chậu hoặc phần phía dưới của âm đạo[95]. + Giai đoạn IIA: ung thư đã di cư ra khỏi vùng cổ tử cung đến khoảng 2/3 phía trên của âm đạo[95]. + Giai đoạn IIB: ung thư đã lan tràn ra ngoài cổ tử cung đến các mô xung quanh nhưng chưa lan đến xương chậu[95]. − Giai đoạn III: ung thư đã lan rộng đến phần dưới của âm đạo và có thể lan rộng đến vùng xương chậu[95].

+ Giai đoạn IIIA: ung thư đã lan rộng đến phần dưới của âm đạo nhưng chưa lan rộng đến phần xương chậu[95]. + Giai đoạn IIIB: Ung thư đã lan rộng đến xương chậu, khối u đã đủ lớn để ngăn cản các ống niệu quản (ống nối thận đến bàng quang) [95]. SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang 5 Khóa Luận Tốt Nghiệp − Giai đoạn IV: ung thư đã lan rộng ra ngoài vùng xương chậu, có thể tìm thấy tế bào ung thư trong niêm mạc bàng quang, trực tràng hoặc đã lan rộng đến các bộ phận khác của cơ thể[95]. + Giai đoạn IVA: các tế bào ung thư di căn đến vùng mô, cơ quan lân cận: bàng quang hoặc trực tràng[95].

+ Giai đoạn IVB: các tế bào ung thư di căn đến vùng mô, cơ quan khác ở xa trên cơ thể: gan, ruột, phổi hoặc xương[95]. Tình hình ung thư cổ tử cung ở trên thế giới Theo số liệu thống kê của Globocan (2012), ung thư cổ tử cung là loại ung thư phổ biến thứ tư trên Thế giới.000 trường hợp mới, 266.000 trường hợp tử vong, chiếm 7,5% số ca tử vong do ung thư ở phụ nữ. Ở các vùng chưa phát triển, số trường hợp tử vong do ung thư xấp xỉ khoảng 87,0%. Ung thư cổ tử cung là bệnh ung thư xảy ra phổ biến nhất ở phụ nữ thuộc khu vực Đông Phi và Trung Phi[105].

Tỷ lệ phụ nữ mắc bệnh ung thư cổ tử cung trên thế giới (Globocan, 2012)[104] SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang 6 Khóa Luận Tốt Nghiệp Hình 1. Tỷ lệ số trường hợp tử vong do ung thư cổ tử cung ở phụ nữ trên thế giới (Globocan, 2012)[104] I. Tình hình ung thư cổ tử cung ở Việt Nam Theo Globocan 2012, ung thư cổ tử cung thuộc nhóm ung thư thường gặp ở phụ nữ Việt Nam, trong nhóm bệnh lý này còn có ung thư vú, ung thư phổi, ung thư gan và ung thư dạ dày.146 trường hợp mắc bệnh ung thư cổ cung (9,4%). Số trường hợp tử vong là 2.

Tỷ lệ phụ nữ mắc bệnh ung thư cổ tử cung ở Việt Nam (Globocan, 2012)[104] SVTT: Lâm Thị Thanh Tâm Trang 7 Khóa Luận Tốt Nghiệp Hình 1. Tỷ lệ số trường hợp tử vong do ung thư cổ tử cung của phụ nữ ở Việt Nam (Globocan, 2012)[100] I. Virus HPV Human papillomavirus (HPV) là virus gây u nhú ở người, thuộc nhóm tác nhân gây bệnh lây truyền qua đường tình dục ở cả nam giới và nữ giới trên Thế giới[18]. Dựa vào sự tương quan giữa kiểu gen HPV với sự xâm nhiễm, gây tổn thương cổ tử cung và cơ chế sinh ung, HPV có thể được chia thành các nhóm như sau: − Nhóm HPV type nguy cơ thấp (Low - risk type): 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81, 89[79].

− Nhóm HPV type nguy cơ cao (High - risk type): 16, 18, 31, 33, 34, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, và 73[8]. Theo báo cáo khoa học của Hausen và cộng sự (1966), nhóm HPV type nguy cơ cao có khả năng gây ra sự tăng sinh mất kiểm soát dẫn đến hình thành các khối u ác tính ngay khi hiện diện với một lượng (nồng độ) thấp trong cơ thể ký chủ[38].