Luận văn thạc sĩ hus nhân dòng biểu hiện và tinh sạch streptonkinase tái tổ hợp từ chủng streptococus pyogenes trong echerichia coli

Luận văn thạc sĩ phân tích hus nhân dòng biểu hiện và tinh sạch streptonkinase tái tổ hợp từ chủng streptococus pyogenes trong, đánh giá thực trạng, chỉ ra hạn chế, đề xuất giải

• Tác giả: Nguyễn Thị Thương
• Người hướng dẫn: PGS. Quyền Đình Thi
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Nhân dòng, biểu hiện và tinh sạch streptokinase tái tổ hợp từ chủng Streptococcus pyogenes trong Escherichia coli
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2011
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Chứng tắc nghẽn mạch máu
• 1.1.1. Quá trình đông máu
• 1.1.2. Cơ chế tan máu đông
• 1.1.3. Bệnh tắc nghẽn mạch máu
• 1.2. Giới thiệu chung
• 1.3. Cấu trúc không gian
• 1.4. Cơ chế hoạt động
• 1.5. SK tái tổ hợp
• 1.6. Tình hình nghiên cứu điều trị tan huyết khối của SK
• 1.7. Phân loại khoa học
• 1.8. Lịch sử nghiên cứu
• 1.9. Đặc điểm sinh học
• 1.10. Đặc điểm gây bệnh
• 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Nguyên liệu và thiết bị
• 2.1.1. Tế bào và plasmid
• 2.1.2. Dung dịch và đệm
• 2.1.3. Môi trường nuôi cấy
• 2.1.4. Thiết bị thí nghiệm
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Các phương pháp vi sinh vật
• 2.2.2. Các phương pháp sinh học phân tử
• 2.2.3. Các phương pháp hóa sinh
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Nhân dòng gene mã hóa mSK-nonhis
• 3.2. Thiết kế plasmid biểu hiện mSK
• 3.3. Biểu hiện streptokinase nonhis
• 3.4. Tinh sạch streptokinase nonhis
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu streptokinase tái tổ hợp từ Streptococcus pyogenes

Nghiên cứu về streptokinase tái tổ hợp từ Streptococcus pyogenes trong E. coli đã mở ra nhiều cơ hội trong việc điều trị các bệnh lý liên quan đến tắc nghẽn mạch máu. Streptokinase là một enzyme có khả năng tiêu huyết khối, giúp làm tan các cục máu đông trong lòng mạch. Việc sản xuất streptokinase tái tổ hợp không chỉ giúp giảm chi phí mà còn nâng cao hiệu quả điều trị. Nghiên cứu này tập trung vào việc nhân dòng, biểu hiện và tinh sạch protein này để phục vụ cho các ứng dụng y học.

1.1. Tầm quan trọng của streptokinase trong y học

Streptokinase đóng vai trò quan trọng trong việc điều trị các bệnh lý như nhồi máu cơ tim và thuyên tắc phổi. Enzyme này giúp làm tan cục máu đông, từ đó cải thiện lưu thông máu và giảm thiểu nguy cơ tử vong. Nghiên cứu cho thấy streptokinase có hiệu quả cao trong việc điều trị tắc nghẽn mạch máu, đặc biệt là ở các nước đang phát triển nơi mà chi phí thuốc cao là một vấn đề lớn.

1.2. Mục tiêu nghiên cứu và phương pháp thực hiện

Mục tiêu của nghiên cứu là phát triển quy trình sản xuất streptokinase tái tổ hợp từ Streptococcus pyogenes trong E. coli. Phương pháp thực hiện bao gồm nhân dòng gene, thiết kế plasmid biểu hiện và tinh sạch protein. Các bước này được thực hiện nhằm đảm bảo sản phẩm đạt tiêu chuẩn về độ tinh khiết và hoạt tính sinh học.

II. Thách thức trong việc sản xuất streptokinase tái tổ hợp

Mặc dù có nhiều lợi ích, việc sản xuất streptokinase tái tổ hợp cũng gặp phải nhiều thách thức. Một trong những vấn đề chính là việc đảm bảo độ tinh khiết của protein trong quá trình sản xuất. Các enzyme tái tổ hợp thường cần phải được tinh sạch để loại bỏ các tạp chất có thể gây ra phản ứng phụ. Hơn nữa, việc sử dụng E. coli làm hệ thống biểu hiện cũng có thể dẫn đến sự hình thành các protein không hoạt động hoặc không đúng cấu trúc.

2.1. Vấn đề về độ tinh khiết của protein

Độ tinh khiết của streptokinase là yếu tố quyết định đến hiệu quả điều trị. Các phương pháp tinh sạch như sắc ký lỏng hoặc điện di gel thường được sử dụng để đạt được độ tinh khiết cao. Tuy nhiên, quá trình này có thể tốn thời gian và chi phí cao, ảnh hưởng đến khả năng sản xuất quy mô lớn.

2.2. Khó khăn trong việc biểu hiện protein trong E. coli

Việc sử dụng E. coli làm hệ thống biểu hiện có thể dẫn đến sự hình thành các protein không hoạt động do sự gấp nếp không đúng cách. Điều này đòi hỏi các nhà nghiên cứu phải tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy và các yếu tố môi trường để đảm bảo protein được biểu hiện đúng cách và có hoạt tính sinh học.

III. Phương pháp tinh sạch streptokinase tái tổ hợp hiệu quả

Để đạt được sản phẩm streptokinase tái tổ hợp có độ tinh khiết cao, nhiều phương pháp đã được áp dụng. Các phương pháp này bao gồm sắc ký lỏng, điện di gel và các kỹ thuật sinh học phân tử. Mỗi phương pháp đều có ưu điểm và nhược điểm riêng, và việc lựa chọn phương pháp phù hợp là rất quan trọng để tối ưu hóa quy trình sản xuất.

3.1. Sắc ký lỏng trong tinh sạch protein

Sắc ký lỏng là một trong những phương pháp hiệu quả nhất để tinh sạch streptokinase. Phương pháp này cho phép tách biệt protein dựa trên kích thước và tính chất hóa học, giúp loại bỏ các tạp chất không mong muốn. Kết quả cho thấy sắc ký lỏng có thể đạt được độ tinh khiết lên đến 95%.

3.2. Điện di gel trong phân tích protein

Điện di gel là một kỹ thuật quan trọng trong việc phân tích và xác định độ tinh khiết của protein. Phương pháp này cho phép quan sát sự phân tách của các protein dựa trên kích thước và điện tích. Kết quả điện di gel giúp đánh giá hiệu quả của các bước tinh sạch và xác định hoạt tính của streptokinase.

IV. Ứng dụng thực tiễn của streptokinase tái tổ hợp

Sản phẩm streptokinase tái tổ hợp có nhiều ứng dụng trong y học, đặc biệt trong điều trị các bệnh lý liên quan đến tắc nghẽn mạch máu. Việc sử dụng enzyme này không chỉ giúp cải thiện tình trạng sức khỏe của bệnh nhân mà còn giảm thiểu chi phí điều trị. Nghiên cứu cho thấy streptokinase tái tổ hợp có hiệu quả tương đương với các sản phẩm nhập khẩu nhưng với giá thành thấp hơn.

4.1. Hiệu quả điều trị của streptokinase tái tổ hợp

Nghiên cứu lâm sàng cho thấy streptokinase tái tổ hợp có hiệu quả trong việc làm tan cục máu đông, giúp cải thiện lưu thông máu và giảm nguy cơ tử vong. Các thử nghiệm trên động vật cho thấy enzyme này có thể được sử dụng an toàn và hiệu quả trong điều trị nhồi máu cơ tim và thuyên tắc phổi.

4.2. Lợi ích kinh tế từ việc sản xuất streptokinase trong nước

Việc sản xuất streptokinase tái tổ hợp trong nước giúp giảm chi phí điều trị cho bệnh nhân. Sản phẩm này không chỉ đáp ứng nhu cầu trong nước mà còn có thể xuất khẩu, tạo ra nguồn thu cho nền kinh tế. Điều này đặc biệt quan trọng trong bối cảnh các sản phẩm nhập khẩu có giá thành cao.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu về streptokinase tái tổ hợp từ Streptococcus pyogenes trong E. coli đã mở ra nhiều cơ hội mới trong lĩnh vực y học. Mặc dù còn nhiều thách thức trong việc sản xuất và tinh sạch, nhưng những kết quả đạt được cho thấy tiềm năng lớn của enzyme này trong điều trị các bệnh lý tắc nghẽn mạch máu. Tương lai, việc tối ưu hóa quy trình sản xuất và nghiên cứu thêm về ứng dụng của streptokinase sẽ tiếp tục được thực hiện.

5.1. Hướng nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực streptokinase

Các nghiên cứu tiếp theo sẽ tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình sản xuất và tinh sạch streptokinase. Bên cạnh đó, việc nghiên cứu các ứng dụng mới của enzyme này trong điều trị các bệnh lý khác cũng sẽ được xem xét.

5.2. Tương lai của streptokinase trong điều trị bệnh tắc nghẽn mạch máu

Với những lợi ích vượt trội, streptokinase tái tổ hợp có thể trở thành một lựa chọn hàng đầu trong điều trị bệnh tắc nghẽn mạch máu. Việc phát triển sản phẩm này không chỉ giúp cải thiện sức khỏe cộng đồng mà còn góp phần vào sự phát triển của ngành dược phẩm trong nước.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Bệnh lý tim mạch và các biến chứng tắc nghẽn mạch máu hiện là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu thế giới, cướp đi sinh mạng của khoảng 7 triệu người mỗi năm và chiếm 12,2% tổng số ca tử vong toàn cầu. Theo ước tính từ Tổ chức Y tế Thế giới, có tới 75% số ca tử vong do tim mạch tập trung tại các quốc gia có thu nhập thấp và trung bình, với dự báo tỷ lệ tử vong sẽ tăng gấp 3 lần trong vòng hai thập kỷ tới. Cục máu đông (huyết khối) hình thành trong lòng mạch là nguyên nhân trực tiếp dẫn đến nhồi máu cơ tim cấp và đột quỵ. Trong khi các loại thuốc tiêu sợi huyết hiện đại có bản chất là yếu tố hoạt hóa plasminogen mô tái tổ hợp (r-tPA) có chi phí điều trị đắt gấp gần 10 lần, Streptokinase (SK) – một protein do liên cầu khuẩn Streptococcus sinh ra – trở thành liệu pháp cứu cánh kinh tế hàng đầu tại các nước đang phát triển.

Tuy nhiên, các chế phẩm enzyme tái tổ hợp thông thường thường gắn đuôi 6x-Histidine để thuận tiện cho quá trình tinh sạch ái lực, tiềm ẩn nguy cơ gây đáp ứng miễn dịch và tác dụng phụ bất lợi khi đưa vào cơ thể người qua đường tiêm truyền tĩnh mạch. Được triển khai trong khuôn khổ Đề tài Khoa học và Công nghệ cấp Nhà nước KC10 tại Phòng Công nghệ sinh học Enzyme thuộc Viện Công nghệ sinh học và Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội vào năm 2011, luận văn thạc sĩ chuyên ngành Vi sinh vật học tập trung vào mục tiêu: nhân dòng, thiết kế vector biểu hiện và xây dựng quy trình tinh sạch enzyme Streptokinase tái tổ hợp không mang đuôi 6x-Histidine (mSK-nonhis) trong hệ thống vi khuẩn Escherichia coli. Nghiên cứu mang ý nghĩa thực tiễn to lớn khi hoàn thiện quy trình công nghệ tạo nguồn dược phẩm tan huyết khối có độ tinh khiết cao đạt 97,9%, hiệu suất thu hồi 87% và hoạt tính riêng đạt 11.308 U/mg, góp phần chủ động nguồn nguyên liệu điều trị tim mạch giá rẻ tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên hai nền tảng lý thuyết sinh hóa và y sinh học cốt lõi: cơ chế đông máu nội sinh - ngoại sinh và quá trình tiêu sợi huyết sinh lý (fibrinolysis). Bản chất của quá trình đông máu là sự chuyển đổi fibrinogen hòa tan thành mạng lưới sợi fibrin không hòa tan nhờ enzyme thrombin. Ngược lại, quá trình tiêu sợi huyết diễn ra nhằm tái lưu thông tuần hoàn máu khi tiền enzyme plasminogen (trọng lượng phân tử gồm chuỗi đơn 791 amino acid với nồng độ trong huyết tương khoảng 0,2 µg/ml) được hoạt hóa thành plasmin hoạt động để cắt đứt mạng lưới fibrin thành các sản phẩm phân hủy hòa tan.

Mô hình xúc tác của Streptokinase (trọng lượng phân tử 47 kDa, cấu trúc đơn chuỗi gồm 414 amino acid ở dạng trưởng thành, điểm đẳng điện pI khoảng 4,7 và pH tối ưu từ 7,3 đến 7,6) hoạt động theo cơ chế liên kết đồng phân tử tỉ lệ 1:1 với plasminogen tạo thành phức hợp hoạt hóa gián tiếp. Phức hợp này làm biến đổi cấu hình không gian để xúc tác cắt liên kết peptide L-arginyl-L-valyl giữa vị trí gốc 560 và 561 trên các phân tử plasminogen tự do khác, tạo ra plasmin phân giải cục máu đông. Cấu trúc không gian 3 chiều của Streptokinase bao gồm 3 vùng chức năng: vùng alpha (amino acid 1-150), vùng beta (amino acid 151-287) và vùng gamma (amino acid 288-414). Nghiên cứu tập trung vào 4 khái niệm nền tảng: Streptokinase trưởng thành loại bỏ peptide tín hiệu (mSK), protein tái tổ hợp không gắn thẻ dung hợp (mSK-nonhis), thể vùi nội bào (inclusion bodies) và kỹ thuật tái cuộn xoắn protein (refolding).

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu và vật liệu thực nghiệm bao gồm mẫu DNA tổng số từ chủng vi khuẩn Streptococcus pyogenes DT7, chủng vi khuẩn biểu hiện Escherichia coli JM109(DE3), chủng dòng hóa Escherichia coli DH5alpha, cùng vector nhân dòng pJET1.2/blunt và plasmid biểu hiện pET21a(+). Cỡ mẫu thực nghiệm được chuẩn hóa với 2,5 g sinh khối tế bào vi khuẩn tươi thu hoạch từ 300 ml dịch nuôi cấy biểu hiện sau 6 giờ cảm ứng bằng chất kích hoạt isopropyl beta-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) nồng độ 1 mM ở nhiệt độ 28°C. Phương pháp chọn mẫu và bố trí thí nghiệm lặp lại 3 lần đối với toàn bộ các phép đo hoạt độ sinh hóa để đảm bảo độ tin cậy thống kê.

Kỹ thuật sinh học phân tử được lựa chọn bao gồm phản ứng khuếch đại chuỗi trùng hợp (PCR) trải qua 35 chu kỳ nhiệt với cặp mồi chuyên biệt mSKF và mSKR, biến nạp tế bào khả biến bằng phương pháp sốc nhiệt ở 42°C trong 45 giây và giải trình tự DNA tự động theo nguyên lý Sanger trên hệ thống ABI PRISM 3100 để kiểm tra chính xác khung đọc mã hóa. Phương pháp phân tích hóa sinh sử dụng điện di biến tính SDS-PAGE 15% để định lượng phân đoạn protein, lai miễn dịch Western blot trên màng PVDF sử dụng kháng thể thỏ đặc hiệu kháng SK, định lượng hàm lượng protein theo phương pháp Bradford đo độ hấp thụ quang học tại bước sóng 595 nm (xây dựng dựa trên đường chuẩn Albumin huyết thanh bò từ 0 đến 1 mg/ml) và định lượng hoạt độ tiêu sợi huyết thông qua phản ứng đo phổ hấp thụ của cơ chất tổng hợp AAS tại bước sóng 405 nm. Việc lựa chọn phương pháp phá tế bào bằng siêu âm 4 lần liên tiếp (mỗi lần 10 chu kỳ, 30 giây mỗi chu kỳ) trong đệm Kali phosphate 50 mM pH 7,5 được chứng minh là tối ưu để phân tách thể vùi mà không cần sử dụng hệ thống sắc ký cột phức tạp, đắt tiền.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Thứ nhất, thiết kế thành công vector biểu hiện pEmSK mang gene mã hóa mSK không đuôi 6x-Histidine. Sản phẩm PCR nhân dòng đoạn gene msk có kích thước 1.245 bp được gắn chuẩn xác vào vector pET21a(+) giữa hai vị trí cắt enzyme giới hạn NdeI và XhoI. Kết quả giải trình tự DNA khẳng định độ tương đồng 100% với trình tự mã hóa Streptokinase trên ngân hàng gene quốc tế GenBank (mã số EU872448). Cấu trúc biểu hiện được biến đổi thông minh bằng cách chèn bộ ba mã kết thúc TGA ngay trước vùng mã hóa 6x-Histidine, đảm bảo dịch mã ra protein 414 amino acid với trọng lượng phân tử 47 kDa hoàn toàn không mang đuôi His.

Thứ hai, mức độ biểu hiện protein tái tổ hợp đạt hiệu suất cao vượt trội ở dạng thể vùi. Protein mSK-nonhis được biểu hiện mạnh mẽ trong chủng E. coli JM109(DE3) sau 6 giờ cảm ứng với 1 mM IPTG ở 28°C. Phân tích định lượng qua phần mềm xử lý ảnh gel chuyên dụng Dolphin 1D cho thấy lượng protein mục tiêu chiếm tới 72% tổng lượng protein tế bào. Tỷ lệ biểu hiện này vượt trội hơn hẳn so với mức 25% trong chủng E. coli W3110 của nhóm tác giả Estrada và mức 50% khi sử dụng vector pGEX theo công bố của Reza trong các nghiên cứu quốc tế trước đây.

Thứ ba, tinh sạch thể vùi đơn giản qua 4 chu kỳ siêu âm đạt độ tinh khiết 97,9%. Bằng phương pháp phá siêu âm và ly tâm phân đoạn 12.500 vòng/phút trong 15 phút để loại bỏ protein hòa tan, độ sạch của protein đích tăng liên tục: từ 65,7% ở lần 1 lên 76,7% ở lần 2, đạt 85,7% ở lần 3 và chạm mức 97,9% ở lần 4 (tương ứng độ tinh sạch tăng 9,5 lần). Hiệu suất thu hồi đạt tới 87%, tương ứng sản lượng 0,78 mg mSK-nonhis tinh khiết trên 1 gam tế bào tươi với hoạt tính riêng đạt 11.308 U/mg. Phản ứng lai Western blot khẳng định băng protein 47 kDa bắt cặp đặc hiệu duy nhất với kháng thể kháng Streptokinase.

Thứ tư, tái hoạt hóa enzyme đạt hoạt tính cực đại với Tween 20 và glycerol. Protein dạng thể vùi sau khi hòa tan bằng dung dịch biến tính Guanidine 6 M được tái cuộn xoắn hiệu quả nhất trong đệm Kali phosphate 50 mM có bổ sung 1% Tween 20 và 10% glycerol ở 4°C trong 6 giờ, giúp hoạt độ riêng đạt mức kỷ lục 95.463 U/mg (tăng gấp 8 lần so với mẫu đối chứng không bổ sung chất hoạt hóa).

Thảo luận kết quả

Hiện tượng mSK-nonhis biểu hiện chủ yếu ở dạng thể vùi không hòa tan (chiếm trên 90% lượng protein tái tổ hợp) xuất phát từ tốc độ dịch mã cực nhanh dưới sự điều khiển của promoter T7 mạnh mẽ, khiến chuỗi polypeptide chưa kịp cuộn gấp cấu trúc không gian chính xác. Mặc dù là dạng bất hoạt tạm thời, thể vùi lại mang đến lợi thế công nghệ lớn khi bảo vệ phân tử mSK không bị phân giải bởi các enzyme protease nội bào của vi khuẩn chủ, đồng thời cho phép thu hồi protein thô với nồng độ cao chỉ bằng thao tác ly tâm đơn giản.

Các dữ liệu nghiên cứu được biểu diễn trực quan thông qua đồ thị tuyến tính của đường chuẩn nồng độ Bradford (phương trình y = 0,025x - 0,0169) và đường chuẩn hoạt độ SK (phương trình y = 0,0553x - 0,3226). Sự biến thiên của độ tinh khiết và hoạt tính qua 4 chu kỳ siêu âm được mô tả chi tiết qua bảng theo dõi hiệu suất thu hồi và điện di đồ SDS-PAGE nhuộm bạc. Kết quả tái cuộn xoắn cấu trúc bằng Tween 20 hoặc Triton X-100 kết hợp 10% glycerol chứng minh rằng glycerol đóng vai trò như một chất trợ dung ổn định cấu trúc bậc bốn, trong khi chất hoạt động bề mặt không ion hóa giúp ngăn ngừa hiện tượng tái kết tụ kỵ nước của các chuỗi protein đang mở xoắn. So với phương pháp tinh sạch qua cột ái lực Ni2+ truyền thống (vốn cho hiệu suất thu hồi chỉ từ 6,7% đến 52%), quy trình siêu âm rửa thể vùi trong nghiên cứu này mang lại hiệu suất thu hồi cao hơn từ 1,6 đến 13 lần, bảo đảm an toàn sinh học tuyệt đối cho các chế phẩm thuốc tiêm điều trị.

Đề xuất và khuyến nghị

Thứ nhất, tối ưu hóa quy trình lên men nuôi cấy bổ sung dưỡng chất (fed-batch). Đơn vị nghiên cứu cần nâng cao mật độ tế bào vi khuẩn E. coli JM109(DE3) bằng cách kiểm soát nồng độ oxy hòa tan (duy trì DO từ 30% đến 50%), bổ sung cao nấm men và điều hòa pH tự động. Mục tiêu đặt ra là nâng sinh khối tế bào từ 2,5 g/l lên trên 25 g/l và năng suất biểu hiện mSK-nonhis đạt mốc 1.000 đến 1.200 mg/l dịch nuôi cấy trong vòng 6 đến 12 tháng. Chủ thể thực hiện là nhóm nghiên cứu tại Phòng Công nghệ sinh học Enzyme.

Thứ hai, triển khai thử nghiệm tiền lâm sàng trên mô hình động vật mở rộng. Cần tiến hành đánh giá hiệu lực làm tan huyết khối, độc tính cấp tính, độc tính bán trường diễn và khả năng sinh kháng thể trung hòa của chế phẩm mSK-nonhis trên mô hình từ 30 đến 50 cá thể thỏ và chuột cống trắng gây tắc mạch nhân tạo trong khung thời gian từ 12 đến 18 tháng. Chủ thể thực hiện là Viện Công nghệ sinh học phối hợp cùng các viện nghiên cứu y dược học và Học viện Quân y.

Thứ ba, chuẩn hóa quy trình công nghệ loại bỏ nội độc tố (Endotoxin). Đơn vị phát triển cần ứng dụng màng siêu lọc tiếp tuyến hoặc cột sắc ký trao đổi ion chuyên biệt nhằm loại bỏ hoàn toàn Lipopolysaccharide (LPS) từ thành tế bào vi khuẩn E. coli, kiểm soát nồng độ nội độc tố xuống dưới 0,5 EU/ml để đáp ứng tiêu chuẩn Dược điển cho thuốc dạng tiêm trong vòng 6 tháng. Chủ thể thực hiện là bộ phận nghiên cứu và phát triển sản phẩm dược sinh học.

Thứ tư, chuyển giao công nghệ và thương mại hóa sản phẩm điều trị tan huyết khối giá rẻ. Cơ quan chủ quản cần hoàn tất thủ tục đăng ký bảo hộ quyền sở hữu trí tuệ cho quy trình công nghệ và phối hợp với các doanh nghiệp sản xuất dược phẩm trong nước để xây dựng dây chuyền sản xuất mSK-nonhis quy mô pilot từ 100 đến 500 lít mỗi mẻ trong vòng 24 tháng, hướng tới mục tiêu giảm từ 70% đến 80% chi phí điều trị nhồi máu cơ tim cho bệnh nhân nghèo so với thuốc nhập ngoại. Chủ thể thực hiện là Bộ Khoa học và Công nghệ cùng các doanh nghiệp dược phẩm đối tác.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Thứ nhất, các nhà khoa học và nghiên cứu viên trong lĩnh vực công nghệ sinh học. Nhóm đối tượng này có thể tiếp cận quy trình chi tiết về kỹ thuật đột biến cấu trúc vector pET21a(+), nhân dòng và biểu hiện protein ngoại lai không đuôi tag ở năng suất cao (chiếm 72% tổng protein tế bào). Đây là tài liệu tham khảo giá trị cho các dự án nghiên cứu biểu hiện enzyme và protein trị liệu trong hệ thống vi sinh vật.

Thứ hai, kỹ sư công nghệ và chuyên gia R&D tại các doanh nghiệp dược phẩm sinh học. Nghiên cứu cung cấp giải pháp công nghệ tinh sạch protein thể vùi bằng siêu âm kết hợp tái cuộn xoắn bằng chất hoạt động bề mặt và 10% glycerol, giúp cắt giảm chi phí hạt nhựa ái lực đắt đỏ và loại bỏ hoàn toàn nguy cơ độc tính của đuôi His trong thuốc tiêm truyền.

Thứ ba, bác sĩ chuyên khoa tim mạch và dược sĩ lâm sàng. Luận văn cung cấp cơ sở phân tử vững chắc về cơ chế tiêu sợi huyết của phức hợp Streptokinase-Plasminogen, các dữ liệu dược động học và bằng chứng thực chứng về khả năng tái lưu thông lòng mạch lên tới 90% khi can thiệp trong vòng 1,5 đến 3 giờ đầu sau biến cố nhồi máu cơ tim cấp.

Thứ tư, giảng viên, học viên cao học và sinh viên chuyên ngành Vi sinh vật học, Hóa sinh và Công nghệ sinh học. Tài liệu đóng vai trò là một case study mẫu mực về phương pháp luận thực nghiệm sinh học phân tử, cách thiết kế cặp mồi PCR, kỹ thuật điện di SDS-PAGE, thẩm tách Western blot và phương pháp định lượng động học enzyme xúc tác.

Câu hỏi thường gặp

Việc loại bỏ đuôi 6x-Histidine mang lại lợi ích cốt lõi gì cho chế phẩm Streptokinase tái tổ hợp? Đuôi 6x-Histidine tuy giúp đơn giản hóa quá trình tinh sạch qua cột ái lực ion kim loại nhưng lại là phân đoạn peptide ngoại lai có nguy cơ kích thích hệ miễn dịch của cơ thể sinh kháng thể chống thuốc hoặc gây sốc phản vệ nguy hiểm. Loại bỏ đuôi His giúp tạo ra phân tử mSK-nonhis có cấu trúc 414 amino acid tương đồng 100% với Streptokinase tự nhiên, đáp ứng tiêu chuẩn an toàn sinh học khắt khe của thuốc tiêm truyền tĩnh mạch.

Tại sao protein mSK-nonhis biểu hiện ở dạng thể vùi lại được xem là lợi thế trong quy trình sản xuất này? Biểu hiện dạng thể vùi bảo vệ phân tử mSK-nonhis không bị phân giải bởi các enzyme protease nội bào của vi khuẩn E. coli, đồng thời cho phép tích tụ protein mục tiêu với mật độ cực cao (chiếm 72% tổng protein tế bào). Quá trình tinh sạch chỉ cần rửa thể vùi bằng phương pháp siêu âm 4 lần là đã đạt độ tinh sạch 97,9% mà không cần dùng hóa chất tinh sạch phức tạp.

Phương pháp tinh sạch bằng phá tế bào siêu âm nhiều lần có hiệu quả như thế nào so với sắc ký ái lực? Quy trình rửa thể vùi qua 4 chu kỳ siêu âm trong đệm phosphate giúp loại bỏ gần như toàn bộ protein hòa tan của tế bào chủ, mang lại hiệu suất thu hồi ấn tượng lên tới 87% (sản lượng 0,78 mg/g tế bào). Con số này vượt trội hoàn toàn so với hiệu suất thu hồi chỉ đạt từ 6,7% đến 52% khi tinh sạch protein Streptokinase tái tổ hợp có đuôi His qua cột sắc ký ái lực niken.

Vì sao cần bổ sung 10% glycerol kết hợp chất hoạt động bề mặt trong bước tái hoạt hóa mSK-nonhis? Dung dịch Guanidine 6 M làm mở xoắn hoàn toàn cấu trúc thể vùi. Khi pha loãng để tái cuộn xoắn, các gốc amino acid kỵ nước dễ tự kết tụ gây kết tủa trở lại. Hỗn hợp 1% Tween 20 và 10% glycerol đóng vai trò trợ dung, hỗ trợ các chuỗi polypeptide cuộn gập chuẩn xác về cấu trúc không gian 3 chiều nguyên bản, nâng hoạt tính riêng của enzyme lên mức cực đại 95.463 U/mg.

Triển vọng ứng dụng thực tế của quy trình sản xuất mSK-nonhis tại các cơ sở y tế Việt Nam ra sao? Nghiên cứu tạo tiền đề vững chắc để sản xuất thuốc tiêu sợi huyết nội địa với chi phí chỉ bằng khoảng 10% đến 20% so với các biệt dược ngoại nhập như r-tPA hay Alteplase. Điều này giúp các bệnh viện tuyến tỉnh và vùng sâu, vùng xa có thể tiếp cận nguồn thuốc cấp cứu nhồi máu cơ tim kịp thời trong khung giờ vàng, cứu sống hàng ngàn bệnh nhân mỗi năm.

Kết luận

• Nhân dòng và thiết kế thành công vector pEmSK mang gene msk kích thước 1.245 bp từ Streptococcus pyogenes có gắn bộ ba kết thúc TGA để biểu hiện mSK-nonhis gồm 414 amino acid với trọng lượng phân tử 47 kDa.
• Tối ưu hóa biểu hiện thành công trong E. coli JM109(DE3) với năng suất vượt trội, chiếm 72% tổng protein tế bào dưới dạng thể vùi sau 6 giờ cảm ứng bằng 1 mM IPTG ở 28°C.
• Xây dựng quy trình tinh sạch thể vùi đơn giản, hiệu quả cao qua 4 lần phá siêu âm, đạt độ tinh khiết 97,9% (tăng độ sạch 9,5 lần), hiệu suất thu hồi 87% và hoạt tính riêng đạt 11.308 U/mg.
• Khám phá điều kiện tái cuộn xoắn tối ưu bằng 1% Tween 20 kết hợp 10% glycerol ở 4°C trong 6 giờ, giúp nâng hoạt tính riêng của mSK-nonhis lên mốc kỷ lục 95.463 U/mg.
• Xác thực độ đặc hiệu cấu trúc bằng phản ứng lai miễn dịch Western blot với kháng thể thỏ kháng Streptokinase, mở ra lộ trình từ 12 đến 24 tháng tiếp theo để thử nghiệm tiền lâm sàng và công nghiệp hóa dược phẩm sinh học tan huyết khối chất lượng cao tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Trong xã hội hiện đại, khi nền kinh tế ngày một phát triển cộng với áp lực về công việc và thời gian khiến cho chế độ ăn của con người trở nên mất cân đối là một trong những nguyên nhân lớn dẫn đến bệnh tim mạch. Bệnh tim mạch đang là nguyên nhân gây tử vong số một trên thế giới (www. Bệnh tim mạch làm chết 7 triệu người mỗi năm và chiếm 12,2% các ca tử vong trên toàn thế giới [41]. Xu hướng này sẽ tiếp tục gia tăng trong hai thập kỷ tiếp theo và gây ra những tác động lớn hơn ở các nước có thu nhập thấp và trung bình, nơi chiếm tới 3/4 số ca tử vong do tim mạch vào năm 2001 [13, 55].

Bệnh tim mạch là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu ở các nước Mỹ Latinh, Caribe, các nước Trung Đông và cả Châu Phi. Tử vong do tim mạch dự kiến sẽ tăng gấp 3 lần trong 20 năm tới [55]. Một trong những nguyên nhân chính dẫn đến các bệnh tim mạch là do chứng tắc nghẽn mạch máu. Do đó để hạn chế thấp nhất tỷ lệ tử vong và các biến chứng do bệnh tim mạch gây ra, các nhà khoa học đi theo hướng phòng ngừa và xử lý các huyết khối hình thành trong mạch.

Trên thị trường hiện nay có một số thuốc đặc trị tắc nghẽn mạch máu như Durakinase, Streptase, Alteplase, Tenecteplase Tuy nhiên, đây hầu hết là các sản phẩm của nước ngoài với giá thành rất đắt. Nghiên cứu so sánh không thấy sự khác biệt về ưu thế của các loại thuốc trên [21]. Sự khác biệt lớn nhất là giá cả, thuốc có bản chất r-tPA có giá gấp gần 10 lần streptokinase. Do đó, streptokinase thường được sử dụng hơn ở các nước đang phát triển.

Ở Việt Nam chưa có nhiều công trình nghiên cứu về các thuốc tan huyết. Đề tài KC10 (2009-2010) có thể coi là công trình nghiên cứu cấp nhà nước đầu tiên về lĩnh vực này. Trong đề tài này các nhà nghiên cứu đã nhân dòng, biểu hiện và tinh sạch thành công streptokinase. Streptokinase được biểu hiện cả ở dạng có tín hiệu và không có tín hiệu (mSK), trong đó mSK với hoạt tính cao hơn.

Streptokinase tái tổ hợp bước đầu được thử nghiệm trên đối tượng thỏ thí nghiệm cho kết quả tốt. 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Thương Để hạn chế thấp nhất tỷ lệ tử vong và các biến chứng của chứng tắc nghẽn mạch máu thì thời gian xử lý huyết khối trong mạch là một yếu tố vô cùng quan trọng. Thuốc tan huyết khối dạng tiêm được sử dụng rộng rãi hơn. Tuy nhiên, thuốc dạng tiêm đòi hỏi phải có độ tinh khiết cao, trong khi các enzyme tái tổ hợp thông thường thường dung hợp đuôi 6xhistidine (6xhis) để thuận tiện cho quá trình tinh sạch và việc dung hợp đuôi 6xhis được xem là có thể gây tác dụng phụ cho con người.

Trên cơ sở đó, trong khuôn khổ đề tài KC10 “Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme tái tổ hợp streptokinase và yếu tố hoạt hóa plasminogen mô (tPA) sử dụng trong điều trị” chúng tôi thực hiện đề tài luận văn “Nhân dòng, biểu hiện và tinh sạch streptokinase tái tổ hợp trong E. coli” với dạng streptokinase tái tổ hợp không dung hợp đuôi 6xhistidine để tiến tới sản xuất dược phẩm sinh học điều trị chứng tắc nghẽn mạch máu, có ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn cao. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Chứng tắc nghẽn mạch máu 1.1 Quá trình đông máu Đông máu là quá trình máu chuyển từ thể lỏng sang thể đặc. Bình thường đây là một cơ chế quan trọng giúp cơ thể sửa chữa những mạch máu bị tổn thương và chống mất máu do bị tổn thương thành mạch.

Quá trình đông máu phụ thuộc vào các yếu tố đông máu (bảng 1.1) và gồm ba giai đoạn. Giai đoạn tạo thành prothrombinase Quá trình này xảy ra khi có chấn thương thành mạch, khi có sự tiếp xúc với collagen của thành mạch, với các mô khác ngoài nội mạc hoặc bất cứ vật lạ nào. Sự tạo thành prothrombinase được thực hiện theo hai cơ chế nội sinh và ngoại sinh (hình 1. Hai cơ chế này chỉ khác nhau ở giai đoạn hình thành yếu tố X hoạt hóa (Xa).

2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Thương Cơ chế ngoại sinh: Khi máu tiếp xúc với mạch máu bị tổn thương, mô ở vị trí tổn thương giải phóng ra yếu tố III (thromboplastin mô) và phospholipid. Yếu tố III hoạt hóa yếu tố X thành yếu tố Xa. Sự hình thành phức hợp prothrombinase từ yếu tố Xa có sự tham gia của yếu tố Va, ion Ca2+ và phospholipid. Yếu tố Va làm tăng hoạt tính của yếu tố Xa.

Phospholipid đóng vai trò là chất nền còn ion Ca2+ làm cầu nối giữa các yếu tố. Thrombin trong trường hợp này có tác dụng điều hòa. Cơ chế nội sinh: Khi máu tiếp xúc với collagen của thành mạch bị tổn thương hoặc bề mặt vật lạ sẽ làm hoạt hóa yếu tố XII thành yếu tố XIIa và giải phóng phospholipid tiểu cầu. Yếu tố XIIa chuyển yếu tố XI thành yếu tố XIa (có sự tham gia của yếu tố Fletcher và Fitzgerald).

Yếu tố XIa chuyển yếu tố IX thành yếu tố IXa (có sự tham gia của yếu tố tiểu cầu). Yếu tố X được hoạt hóa có sự tham gia của yếu tố VIIIa (yếu tố VIII được hoạt hóa nhờ thrombin), yếu tố IXa, ion Ca2+ và phospholipid. Sự hình thành phức hợp prothrombinase từ yếu tố Xa có sự tham gia của phospholipid, yếu tố Va (yếu tố V được hoạt hóa nhờ thrombin) và ion Ca 2+. Prothrombinase được hình thành từ cơ chế nội sinh hoặc ngoại sinh hoặc đồng thời cả hai cơ chế nội sinh và ngoại sinh.

Điều này chứng tỏ hoạt tính của prothrombinase là phụ thuộc vào sự hoạt hóa của các yếu tố tham gia vào quá trình này. Các yếu tố đông máu. Các yếu tố Tên gọi và vai trò I Fibrinogen, là một loại globulin, do gan tổng hợp đưa vào máu. Prothrombin, là một protein huyết tương do gan sinh ra.

Sự tổng hợp II prothrombin liên quan chặt chẽ đến sự hấp thụ vitamin K. Nếu rối loạn hấp thụ vitamin K ở đường tiêu hóa sẽ dẫn đến giảm prothrombin. Thromboplastin, enzyme tạo ra khi tiểu cầu bị vỡ, hoặc mô bị tổn III thương. IV Ion Ca2+ có trong huyết tương, có tác dụng hoạt hóa prothrombin.

Proaccelerin, một loại globulin, do gan sinh ra, làm tăng tốc độ đông V máu. VI Dạng hoạt hoá của yếu tố V. VII Proconvectin, yếu tố xúc tiến tạo Thrombin. 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Thương Yếu tố chống chảy máu A, có trong huyết tương, có vai trò quan trọng VIII trong sự tạo thành thromboplastin nội sinh.

Nếu thiếu yếu tố này, máu vẫn đông nhưng cục máu mềm, dễ di động. Yếu tố chống chảy máu B, cũng là một protein huyết tương, cần cho sự IX tạo thành thromboplastin. Yếu tố stuart, có trong huyết tương, do gan sinh ra tương đối bền vững X có tác dụng trong sự tạo thành thromboplastin và chuyển prothrombin thành thrombin. Prothromboplastin - có sẵn trong huyết tương, có vai trò tập trung tiểu XI cầu.

Yếu tố hageman, có trong huyết tương, có tác dụng hoạt hoá sự đông XII máu. Yếu tố ổn định fibrin, có sẵn trong huyết tương, có tác dụng củng cố sợi XIII fibrin thêm vững chắc. Con đƣờng ngoại sinh Con đƣờng nội sinh Mô tổn thương Thành mạch tổn thương Yếu tố XII Yếu tố XIIa Yếu tố mô Ca2+ Yếu tố XI Yếu tố XIa Yếu tố VII Yếu tố VIIa Ca2+ Ca2+, Yếu tố IXa Yếu tố IX phospholipid Ca2+, yếu tố VIII phospholipid Yếu tố X 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Thương Yếu tố X Yếu tố Xa Ca2+, yếu tố VIII phospholipid Yếu tố VII Yếu tố Va, VIIIa Prothrombin (yếu tố II ) Thrombin Ca2+ Sợi fibrin Yếu tố XIII Yếu tố XIIIa Cục máu đông Hình 1. Giai đoạn tạo thành thrombin Prothrombinase tạo ra theo cơ chế nội sinh và (hoặc) ngoại sinh cùng với Ca2+ xúc tác cho phản ứng chuyển prothrombin thành thrombin.

Sự hình thành thrombin từ prothrombin là rất nhanh, được tính bằng vài giây. Giai đoạn tạo thành fibrin và cục máu đông Fibrinogen là một protein do gan sản xuất, nồng độ trong máu bình thường là 100-700 mg/100 ml máu. Bình thường fibrinogen rất khó vào dịch kẽ. Khi thành mạch tăng tính thấm (mô bị viêm) thì fibrinogen vào dịch kẽ và bị đông lại do các yếu tố gây đông máu cùng vào dịch kẽ.

Dưới tác dụng của thrombin, fibrinogen dạng hòa tan chuyển thành fibrin đơn phân dạng không hòa tan. Các fibrin đơn phân tự trùng hợp thành fibrin ở dạng sợi nhờ yếu tố XIII. Giai đoạn này cũng có sự tham gia của ion Ca2+. Các tế bào máu được giữ lại trên lưới fibrin và tạo nên cục máu 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Thương đông.

Như vậy bản chất của quá trình đông máu là hình thành lưới fibrin từ fibrinogen nhờ thrombin.2 Cơ chế tan máu đông Cục máu đông có thể tan trở lại nhờ quá trình tiêu fibrin (fibrinolysis). Đây là một quá trình ngược với đông máu (hình 1. Tiêu fibrin là một quá trình sinh lý, nhằm làm tan cục máu đông được tạo thành ở giai đoạn trước đó, tái lưu thông tuần hoàn máu. Các yếu tố tham gia gồm có plasminogen, plasmin và các chất hoạt hóa.

Plasminogen: Là tiền tố của plasmin, ở dạng bất hoạt. Hàm lượng trong huyết tương là 0,2 µg/ml. Plasminogen là một chuỗi polypeptide 791 amino acid, bình thường tồn tại ở dạng Glu-plasminogen (dạng nguyên vẹn), khi có tác động của plasmin, Glu-plasminogen tách ra một số peptide nhỏ, phần còn lại là Lys-plasminogen. Plasmin: Các chất hoạt hóa sẽ chuyển plasminogen thành plasmin.

Plasmin gồm hai chuỗi polypeptide, nối với nhau bằng một cầu nối disulfide: chuỗi nhẹ gắn với serine-protease, chuỗi nặng có vị trí gắn với fibrin. Khi fibrin xuất hiện, lập tức xảy ra hiện tượng hoạt hóa plasminogen thành plasmin. Plasmin xúc tác phản ứng cắt fibrin thành các sản phẩm bị phân hủy và do đó làm tan cục máu đông. Plasminogen Các chất hoạt hóa Plasmin Fibrin PDF (các sản phẩm bị phân hủy) Hình 1.

Sơ đồ tiêu sợi huyết. 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Thương 1.3 Bệnh tắc nghẽn mạch máu Đông máu là một trong những cơ chế phòng vệ tự nhiên của cơ thể khi chấn thương xảy ra. Tuy nhiên, khi thành mạch bị xơ vữa, bị tổn thương làm xuất hiện huyết khối làm tắc nghẽn động mạch, tĩnh mạch gây nên bệnh tắc nghẽn mạch máu.