Luận văn thạc sĩ hus nhân dòng biểu hiện và tinh sạch streptonkinase tái tổ hợp từ chủng streptococus pyogenes trong echerichia coli

Luận văn thạc sĩ phân tích hus nhân dòng biểu hiện và tinh sạch streptonkinase tái tổ hợp từ chủng streptococus pyogenes trong, đánh giá thực trạng, chỉ ra hạn chế, đề xuất giải

• Tác giả: Nguyễn Thị Thương
• Người hướng dẫn: PGS. Quyền Đình Thi
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Nhân dòng, biểu hiện và tinh sạch streptokinase tái tổ hợp từ chủng Streptococcus pyogenes trong Escherichia coli
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2011
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Chứng tắc nghẽn mạch máu
• 1.1.1. Quá trình đông máu
• 1.1.2. Cơ chế tan máu đông
• 1.1.3. Bệnh tắc nghẽn mạch máu
• 1.2. Giới thiệu chung
• 1.3. Cấu trúc không gian
• 1.4. Cơ chế hoạt động
• 1.5. SK tái tổ hợp
• 1.6. Tình hình nghiên cứu điều trị tan huyết khối của SK
• 1.7. Phân loại khoa học
• 1.8. Lịch sử nghiên cứu
• 1.9. Đặc điểm sinh học
• 1.10. Đặc điểm gây bệnh
• 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Nguyên liệu và thiết bị
• 2.1.1. Tế bào và plasmid
• 2.1.2. Dung dịch và đệm
• 2.1.3. Môi trường nuôi cấy
• 2.1.4. Thiết bị thí nghiệm
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Các phương pháp vi sinh vật
• 2.2.2. Các phương pháp sinh học phân tử
• 2.2.3. Các phương pháp hóa sinh
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Nhân dòng gene mã hóa mSK-nonhis
• 3.2. Thiết kế plasmid biểu hiện mSK
• 3.3. Biểu hiện streptokinase nonhis
• 3.4. Tinh sạch streptokinase nonhis
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu streptokinase tái tổ hợp từ Streptococcus pyogenes

Nghiên cứu về streptokinase tái tổ hợp từ Streptococcus pyogenes trong E. coli đã mở ra nhiều cơ hội trong việc điều trị các bệnh lý liên quan đến tắc nghẽn mạch máu. Streptokinase là một enzyme có khả năng tiêu huyết khối, giúp làm tan các cục máu đông trong lòng mạch. Việc sản xuất streptokinase tái tổ hợp không chỉ giúp giảm chi phí mà còn nâng cao hiệu quả điều trị. Nghiên cứu này tập trung vào việc nhân dòng, biểu hiện và tinh sạch protein này để phục vụ cho các ứng dụng y học.

1.1. Tầm quan trọng của streptokinase trong y học

Streptokinase đóng vai trò quan trọng trong việc điều trị các bệnh lý như nhồi máu cơ tim và thuyên tắc phổi. Enzyme này giúp làm tan cục máu đông, từ đó cải thiện lưu thông máu và giảm thiểu nguy cơ tử vong. Nghiên cứu cho thấy streptokinase có hiệu quả cao trong việc điều trị tắc nghẽn mạch máu, đặc biệt là ở các nước đang phát triển nơi mà chi phí thuốc cao là một vấn đề lớn.

1.2. Mục tiêu nghiên cứu và phương pháp thực hiện

Mục tiêu của nghiên cứu là phát triển quy trình sản xuất streptokinase tái tổ hợp từ Streptococcus pyogenes trong E. coli. Phương pháp thực hiện bao gồm nhân dòng gene, thiết kế plasmid biểu hiện và tinh sạch protein. Các bước này được thực hiện nhằm đảm bảo sản phẩm đạt tiêu chuẩn về độ tinh khiết và hoạt tính sinh học.

II. Thách thức trong việc sản xuất streptokinase tái tổ hợp

Mặc dù có nhiều lợi ích, việc sản xuất streptokinase tái tổ hợp cũng gặp phải nhiều thách thức. Một trong những vấn đề chính là việc đảm bảo độ tinh khiết của protein trong quá trình sản xuất. Các enzyme tái tổ hợp thường cần phải được tinh sạch để loại bỏ các tạp chất có thể gây ra phản ứng phụ. Hơn nữa, việc sử dụng E. coli làm hệ thống biểu hiện cũng có thể dẫn đến sự hình thành các protein không hoạt động hoặc không đúng cấu trúc.

2.1. Vấn đề về độ tinh khiết của protein

Độ tinh khiết của streptokinase là yếu tố quyết định đến hiệu quả điều trị. Các phương pháp tinh sạch như sắc ký lỏng hoặc điện di gel thường được sử dụng để đạt được độ tinh khiết cao. Tuy nhiên, quá trình này có thể tốn thời gian và chi phí cao, ảnh hưởng đến khả năng sản xuất quy mô lớn.

2.2. Khó khăn trong việc biểu hiện protein trong E. coli

Việc sử dụng E. coli làm hệ thống biểu hiện có thể dẫn đến sự hình thành các protein không hoạt động do sự gấp nếp không đúng cách. Điều này đòi hỏi các nhà nghiên cứu phải tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy và các yếu tố môi trường để đảm bảo protein được biểu hiện đúng cách và có hoạt tính sinh học.

III. Phương pháp tinh sạch streptokinase tái tổ hợp hiệu quả

Để đạt được sản phẩm streptokinase tái tổ hợp có độ tinh khiết cao, nhiều phương pháp đã được áp dụng. Các phương pháp này bao gồm sắc ký lỏng, điện di gel và các kỹ thuật sinh học phân tử. Mỗi phương pháp đều có ưu điểm và nhược điểm riêng, và việc lựa chọn phương pháp phù hợp là rất quan trọng để tối ưu hóa quy trình sản xuất.

3.1. Sắc ký lỏng trong tinh sạch protein

Sắc ký lỏng là một trong những phương pháp hiệu quả nhất để tinh sạch streptokinase. Phương pháp này cho phép tách biệt protein dựa trên kích thước và tính chất hóa học, giúp loại bỏ các tạp chất không mong muốn. Kết quả cho thấy sắc ký lỏng có thể đạt được độ tinh khiết lên đến 95%.

3.2. Điện di gel trong phân tích protein

Điện di gel là một kỹ thuật quan trọng trong việc phân tích và xác định độ tinh khiết của protein. Phương pháp này cho phép quan sát sự phân tách của các protein dựa trên kích thước và điện tích. Kết quả điện di gel giúp đánh giá hiệu quả của các bước tinh sạch và xác định hoạt tính của streptokinase.

IV. Ứng dụng thực tiễn của streptokinase tái tổ hợp

Sản phẩm streptokinase tái tổ hợp có nhiều ứng dụng trong y học, đặc biệt trong điều trị các bệnh lý liên quan đến tắc nghẽn mạch máu. Việc sử dụng enzyme này không chỉ giúp cải thiện tình trạng sức khỏe của bệnh nhân mà còn giảm thiểu chi phí điều trị. Nghiên cứu cho thấy streptokinase tái tổ hợp có hiệu quả tương đương với các sản phẩm nhập khẩu nhưng với giá thành thấp hơn.

4.1. Hiệu quả điều trị của streptokinase tái tổ hợp

Nghiên cứu lâm sàng cho thấy streptokinase tái tổ hợp có hiệu quả trong việc làm tan cục máu đông, giúp cải thiện lưu thông máu và giảm nguy cơ tử vong. Các thử nghiệm trên động vật cho thấy enzyme này có thể được sử dụng an toàn và hiệu quả trong điều trị nhồi máu cơ tim và thuyên tắc phổi.

4.2. Lợi ích kinh tế từ việc sản xuất streptokinase trong nước

Việc sản xuất streptokinase tái tổ hợp trong nước giúp giảm chi phí điều trị cho bệnh nhân. Sản phẩm này không chỉ đáp ứng nhu cầu trong nước mà còn có thể xuất khẩu, tạo ra nguồn thu cho nền kinh tế. Điều này đặc biệt quan trọng trong bối cảnh các sản phẩm nhập khẩu có giá thành cao.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu về streptokinase tái tổ hợp từ Streptococcus pyogenes trong E. coli đã mở ra nhiều cơ hội mới trong lĩnh vực y học. Mặc dù còn nhiều thách thức trong việc sản xuất và tinh sạch, nhưng những kết quả đạt được cho thấy tiềm năng lớn của enzyme này trong điều trị các bệnh lý tắc nghẽn mạch máu. Tương lai, việc tối ưu hóa quy trình sản xuất và nghiên cứu thêm về ứng dụng của streptokinase sẽ tiếp tục được thực hiện.

5.1. Hướng nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực streptokinase

Các nghiên cứu tiếp theo sẽ tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình sản xuất và tinh sạch streptokinase. Bên cạnh đó, việc nghiên cứu các ứng dụng mới của enzyme này trong điều trị các bệnh lý khác cũng sẽ được xem xét.

5.2. Tương lai của streptokinase trong điều trị bệnh tắc nghẽn mạch máu

Với những lợi ích vượt trội, streptokinase tái tổ hợp có thể trở thành một lựa chọn hàng đầu trong điều trị bệnh tắc nghẽn mạch máu. Việc phát triển sản phẩm này không chỉ giúp cải thiện sức khỏe cộng đồng mà còn góp phần vào sự phát triển của ngành dược phẩm trong nước.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Trong xã hội hiện đại, khi nền kinh tế ngày một phát triển cộng với áp lực về công việc và thời gian khiến cho chế độ ăn của con người trở nên mất cân đối là một trong những nguyên nhân lớn dẫn đến bệnh tim mạch. Bệnh tim mạch đang là nguyên nhân gây tử vong số một trên thế giới (www. Bệnh tim mạch làm chết 7 triệu người mỗi năm và chiếm 12,2% các ca tử vong trên toàn thế giới [41]. Xu hướng này sẽ tiếp tục gia tăng trong hai thập kỷ tiếp theo và gây ra những tác động lớn hơn ở các nước có thu nhập thấp và trung bình, nơi chiếm tới 3/4 số ca tử vong do tim mạch vào năm 2001 [13, 55].

Bệnh tim mạch là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu ở các nước Mỹ Latinh, Caribe, các nước Trung Đông và cả Châu Phi. Tử vong do tim mạch dự kiến sẽ tăng gấp 3 lần trong 20 năm tới [55]. Một trong những nguyên nhân chính dẫn đến các bệnh tim mạch là do chứng tắc nghẽn mạch máu. Do đó để hạn chế thấp nhất tỷ lệ tử vong và các biến chứng do bệnh tim mạch gây ra, các nhà khoa học đi theo hướng phòng ngừa và xử lý các huyết khối hình thành trong mạch.

Trên thị trường hiện nay có một số thuốc đặc trị tắc nghẽn mạch máu như Durakinase, Streptase, Alteplase, Tenecteplase Tuy nhiên, đây hầu hết là các sản phẩm của nước ngoài với giá thành rất đắt. Nghiên cứu so sánh không thấy sự khác biệt về ưu thế của các loại thuốc trên [21]. Sự khác biệt lớn nhất là giá cả, thuốc có bản chất r-tPA có giá gấp gần 10 lần streptokinase. Do đó, streptokinase thường được sử dụng hơn ở các nước đang phát triển.

Ở Việt Nam chưa có nhiều công trình nghiên cứu về các thuốc tan huyết. Đề tài KC10 (2009-2010) có thể coi là công trình nghiên cứu cấp nhà nước đầu tiên về lĩnh vực này. Trong đề tài này các nhà nghiên cứu đã nhân dòng, biểu hiện và tinh sạch thành công streptokinase. Streptokinase được biểu hiện cả ở dạng có tín hiệu và không có tín hiệu (mSK), trong đó mSK với hoạt tính cao hơn.

Streptokinase tái tổ hợp bước đầu được thử nghiệm trên đối tượng thỏ thí nghiệm cho kết quả tốt. 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Thương Để hạn chế thấp nhất tỷ lệ tử vong và các biến chứng của chứng tắc nghẽn mạch máu thì thời gian xử lý huyết khối trong mạch là một yếu tố vô cùng quan trọng. Thuốc tan huyết khối dạng tiêm được sử dụng rộng rãi hơn. Tuy nhiên, thuốc dạng tiêm đòi hỏi phải có độ tinh khiết cao, trong khi các enzyme tái tổ hợp thông thường thường dung hợp đuôi 6xhistidine (6xhis) để thuận tiện cho quá trình tinh sạch và việc dung hợp đuôi 6xhis được xem là có thể gây tác dụng phụ cho con người.

Trên cơ sở đó, trong khuôn khổ đề tài KC10 “Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme tái tổ hợp streptokinase và yếu tố hoạt hóa plasminogen mô (tPA) sử dụng trong điều trị” chúng tôi thực hiện đề tài luận văn “Nhân dòng, biểu hiện và tinh sạch streptokinase tái tổ hợp trong E. coli” với dạng streptokinase tái tổ hợp không dung hợp đuôi 6xhistidine để tiến tới sản xuất dược phẩm sinh học điều trị chứng tắc nghẽn mạch máu, có ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn cao. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Chứng tắc nghẽn mạch máu 1.1 Quá trình đông máu Đông máu là quá trình máu chuyển từ thể lỏng sang thể đặc. Bình thường đây là một cơ chế quan trọng giúp cơ thể sửa chữa những mạch máu bị tổn thương và chống mất máu do bị tổn thương thành mạch.

Quá trình đông máu phụ thuộc vào các yếu tố đông máu (bảng 1.1) và gồm ba giai đoạn. Giai đoạn tạo thành prothrombinase Quá trình này xảy ra khi có chấn thương thành mạch, khi có sự tiếp xúc với collagen của thành mạch, với các mô khác ngoài nội mạc hoặc bất cứ vật lạ nào. Sự tạo thành prothrombinase được thực hiện theo hai cơ chế nội sinh và ngoại sinh (hình 1. Hai cơ chế này chỉ khác nhau ở giai đoạn hình thành yếu tố X hoạt hóa (Xa).

2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Thương Cơ chế ngoại sinh: Khi máu tiếp xúc với mạch máu bị tổn thương, mô ở vị trí tổn thương giải phóng ra yếu tố III (thromboplastin mô) và phospholipid. Yếu tố III hoạt hóa yếu tố X thành yếu tố Xa. Sự hình thành phức hợp prothrombinase từ yếu tố Xa có sự tham gia của yếu tố Va, ion Ca2+ và phospholipid. Yếu tố Va làm tăng hoạt tính của yếu tố Xa.

Phospholipid đóng vai trò là chất nền còn ion Ca2+ làm cầu nối giữa các yếu tố. Thrombin trong trường hợp này có tác dụng điều hòa. Cơ chế nội sinh: Khi máu tiếp xúc với collagen của thành mạch bị tổn thương hoặc bề mặt vật lạ sẽ làm hoạt hóa yếu tố XII thành yếu tố XIIa và giải phóng phospholipid tiểu cầu. Yếu tố XIIa chuyển yếu tố XI thành yếu tố XIa (có sự tham gia của yếu tố Fletcher và Fitzgerald).

Yếu tố XIa chuyển yếu tố IX thành yếu tố IXa (có sự tham gia của yếu tố tiểu cầu). Yếu tố X được hoạt hóa có sự tham gia của yếu tố VIIIa (yếu tố VIII được hoạt hóa nhờ thrombin), yếu tố IXa, ion Ca2+ và phospholipid. Sự hình thành phức hợp prothrombinase từ yếu tố Xa có sự tham gia của phospholipid, yếu tố Va (yếu tố V được hoạt hóa nhờ thrombin) và ion Ca 2+. Prothrombinase được hình thành từ cơ chế nội sinh hoặc ngoại sinh hoặc đồng thời cả hai cơ chế nội sinh và ngoại sinh.

Điều này chứng tỏ hoạt tính của prothrombinase là phụ thuộc vào sự hoạt hóa của các yếu tố tham gia vào quá trình này. Các yếu tố đông máu. Các yếu tố Tên gọi và vai trò I Fibrinogen, là một loại globulin, do gan tổng hợp đưa vào máu. Prothrombin, là một protein huyết tương do gan sinh ra.

Sự tổng hợp II prothrombin liên quan chặt chẽ đến sự hấp thụ vitamin K. Nếu rối loạn hấp thụ vitamin K ở đường tiêu hóa sẽ dẫn đến giảm prothrombin. Thromboplastin, enzyme tạo ra khi tiểu cầu bị vỡ, hoặc mô bị tổn III thương. IV Ion Ca2+ có trong huyết tương, có tác dụng hoạt hóa prothrombin.

Proaccelerin, một loại globulin, do gan sinh ra, làm tăng tốc độ đông V máu. VI Dạng hoạt hoá của yếu tố V. VII Proconvectin, yếu tố xúc tiến tạo Thrombin. 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Thương Yếu tố chống chảy máu A, có trong huyết tương, có vai trò quan trọng VIII trong sự tạo thành thromboplastin nội sinh.

Nếu thiếu yếu tố này, máu vẫn đông nhưng cục máu mềm, dễ di động. Yếu tố chống chảy máu B, cũng là một protein huyết tương, cần cho sự IX tạo thành thromboplastin. Yếu tố stuart, có trong huyết tương, do gan sinh ra tương đối bền vững X có tác dụng trong sự tạo thành thromboplastin và chuyển prothrombin thành thrombin. Prothromboplastin - có sẵn trong huyết tương, có vai trò tập trung tiểu XI cầu.

Yếu tố hageman, có trong huyết tương, có tác dụng hoạt hoá sự đông XII máu. Yếu tố ổn định fibrin, có sẵn trong huyết tương, có tác dụng củng cố sợi XIII fibrin thêm vững chắc. Con đƣờng ngoại sinh Con đƣờng nội sinh Mô tổn thương Thành mạch tổn thương Yếu tố XII Yếu tố XIIa Yếu tố mô Ca2+ Yếu tố XI Yếu tố XIa Yếu tố VII Yếu tố VIIa Ca2+ Ca2+, Yếu tố IXa Yếu tố IX phospholipid Ca2+, yếu tố VIII phospholipid Yếu tố X 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Thương Yếu tố X Yếu tố Xa Ca2+, yếu tố VIII phospholipid Yếu tố VII Yếu tố Va, VIIIa Prothrombin (yếu tố II ) Thrombin Ca2+ Sợi fibrin Yếu tố XIII Yếu tố XIIIa Cục máu đông Hình 1. Giai đoạn tạo thành thrombin Prothrombinase tạo ra theo cơ chế nội sinh và (hoặc) ngoại sinh cùng với Ca2+ xúc tác cho phản ứng chuyển prothrombin thành thrombin.

Sự hình thành thrombin từ prothrombin là rất nhanh, được tính bằng vài giây. Giai đoạn tạo thành fibrin và cục máu đông Fibrinogen là một protein do gan sản xuất, nồng độ trong máu bình thường là 100-700 mg/100 ml máu. Bình thường fibrinogen rất khó vào dịch kẽ. Khi thành mạch tăng tính thấm (mô bị viêm) thì fibrinogen vào dịch kẽ và bị đông lại do các yếu tố gây đông máu cùng vào dịch kẽ.

Dưới tác dụng của thrombin, fibrinogen dạng hòa tan chuyển thành fibrin đơn phân dạng không hòa tan. Các fibrin đơn phân tự trùng hợp thành fibrin ở dạng sợi nhờ yếu tố XIII. Giai đoạn này cũng có sự tham gia của ion Ca2+. Các tế bào máu được giữ lại trên lưới fibrin và tạo nên cục máu 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Thương đông.

Như vậy bản chất của quá trình đông máu là hình thành lưới fibrin từ fibrinogen nhờ thrombin.2 Cơ chế tan máu đông Cục máu đông có thể tan trở lại nhờ quá trình tiêu fibrin (fibrinolysis). Đây là một quá trình ngược với đông máu (hình 1. Tiêu fibrin là một quá trình sinh lý, nhằm làm tan cục máu đông được tạo thành ở giai đoạn trước đó, tái lưu thông tuần hoàn máu. Các yếu tố tham gia gồm có plasminogen, plasmin và các chất hoạt hóa.

Plasminogen: Là tiền tố của plasmin, ở dạng bất hoạt. Hàm lượng trong huyết tương là 0,2 µg/ml. Plasminogen là một chuỗi polypeptide 791 amino acid, bình thường tồn tại ở dạng Glu-plasminogen (dạng nguyên vẹn), khi có tác động của plasmin, Glu-plasminogen tách ra một số peptide nhỏ, phần còn lại là Lys-plasminogen. Plasmin: Các chất hoạt hóa sẽ chuyển plasminogen thành plasmin.

Plasmin gồm hai chuỗi polypeptide, nối với nhau bằng một cầu nối disulfide: chuỗi nhẹ gắn với serine-protease, chuỗi nặng có vị trí gắn với fibrin. Khi fibrin xuất hiện, lập tức xảy ra hiện tượng hoạt hóa plasminogen thành plasmin. Plasmin xúc tác phản ứng cắt fibrin thành các sản phẩm bị phân hủy và do đó làm tan cục máu đông. Plasminogen Các chất hoạt hóa Plasmin Fibrin PDF (các sản phẩm bị phân hủy) Hình 1.

Sơ đồ tiêu sợi huyết. 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Thương 1.3 Bệnh tắc nghẽn mạch máu Đông máu là một trong những cơ chế phòng vệ tự nhiên của cơ thể khi chấn thương xảy ra. Tuy nhiên, khi thành mạch bị xơ vữa, bị tổn thương làm xuất hiện huyết khối làm tắc nghẽn động mạch, tĩnh mạch gây nên bệnh tắc nghẽn mạch máu.