ĐẶT VẤN ĐỀ Tế bào gốc là một trong những lĩnh vực sinh học lôi cuốn nhất hiện nay. Từ lâu, cấy ghép tế bào gốc đã đƣợc y học thế giới lựa chọn nhƣ là liệu pháp hữu hiệu để chữa khỏi một số căn bệnh mạn tính, hiểm nghèo liên quan đến máu, tủy, xƣơng khớp…Trên thế giới, có một số nguồn tế bào gốc đƣợc đƣa vào ứng dụng nhƣ tế bào gốc tủy xƣơng và tế bào gốc máu cuống rốn, các tế bào gốc từ 2 nguồn này chủ yếu là tế bào gốc tạo máu nên đƣợc ứng dụng trong nghiên cứu và điều trị các bệnh về máu, còn các bệnh cần có sự tái tạo thuộc hệ thống trung mô thì ít đƣợc ứng dụng. Trong khi đó, các bệnh của trung mô lại rất thƣờng gặp nhƣ các vết thƣơng, vết loét, bệnh lý hệ mạch, não, tim…Một nguồn TB gốc khác đang đƣợc kỳ vọng nhiều chính là tế bào gốc phôi, mặc dù có tiềm năng lớn nhƣng việc nghiên cứu và sử dụng còn rất khó khăn về công nghệ và đặc biệt là bị cản trở bởi vấn đề y đức (sử dụng tế bào gốc phôi đồng nghĩa với việc hủy đi một phôi vốn có thể trở thành một con ngƣời). Gần đây, nhiều nghiên cứu tập trung khai thác các tế bào gốc từ phần phụ của thai nhƣ bánh rau, dây rốn.
Thành công về công nghệ đã có thể tách và nhân lên các tế bào gốc nhƣng chỉ có những bệnh nhân có bảo quản dây rốn – bánh rau…khi sinh ra mới có hy vọng đƣợc dùng các nguồn tế bào gốc này. Hiện nay, chỉ có số lƣợng rất ít ngƣời đƣợc lƣu giữ dây rốn hay bánh rau sau khi sinh ra, đồng thời chi phí cũng rất tốn kém và xác suất ngƣời lƣu trữ mô lại có các bệnh cần đƣợc điều trị bằng các tế bào gốc này cũng không phải cao. Tế bào gốc mỡ là quần thể tế bào vạn năng, chúng có thể biệt hóa thành nhiều dòng khác nhau. Mô mỡ là loại mô có sẵn với số lƣợng lớn và dễ dàng thu hồi nên đây là nguồn tế bào đầy hứa hẹn cho y học tái tạo trong tƣơng lai có thể sử dụng để ghép tự thân và đặc biệt là không gặp phải những vấn đề y đức.
Đối với lĩnh vực nghiên cứu liền vết thƣơng thấy rằng, tế bào gốc mô mỡ là một trong những dạng tế bào quan trọng di cƣ đến vùng tổn thƣơng để thực hiện nhiều khâu trong pha tăng sinh của quá trình liền vết thƣơng. 1 z Tế bào gốc trung mô đã đƣợc nghiên cứu tách từ mô mỡ nhƣng trong thành phần tế bào đƣợc tách còn nhiều dạng tế bào khác nhƣ bạch cầu, hồng cầu…Tỷ lệ tế bào gốc trung mô thay đổi nên khó xác định chính xác cần sử dụng bao nhiêu tế bào là cần thiết và bao nhiêu tế bào trong hỗn dịch tế bào mới tách là đủ để cho một lần ghép điều trị vết thƣơng. Do đó, cần nghiên cứu xây dựng hoàn chỉnh quy trình tách và tinh lọc tế bào gốc trung mô. Nếu nhƣ các tế bào gốc trung mô tách ra lại có tác dụng kích thích tăng sinh hoặc di cƣ của 2 loại tế bào chủ yếu của da thì đó sẽ là cơ sở khoa học cần thiết cho việc tiếp tục các nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc mô mỡ trên lâm sàng và định hƣớng cho các nghiên cứu chế tạo các chế phẩm sinh học phục vụ điều trị các tổn thƣơng thuộc hệ thống trung mô đặc biệt là vết thƣơng và vết bỏng.
Ngày nay, nhu cầu điều trị vết thƣơng bằng ghép tế bào gốc là rất lớn, cụ thể tại Mỹ với 260 triệu dân thì hàng năm có khoảng 6,5 triệu ngƣời mang các vết thƣơng mạn tính. Hàng năm tại miền tây Châu Âu có khoảng 150.000 ngƣời cần đƣợc điều trị bằng da nhân tạo. Riêng tại Đức có khoảng 3 triệu ngƣời bị loét và chi phí lên tới hơn 1 tỷ Euro dành cho điều trị. Tại Việt Nam hàng năm ƣớc tính khoảng 791.000 ngƣời gặp tai nạn về bỏng [8].
Tuy chƣa có con số thống kê cụ thể nhƣng chỉ tính riêng tại Viện Bỏng Quốc Gia, hàng năm có khoảng 5000 bệnh nhân bỏng điều trị thì nhu cầu về ghép da cũng đã chiếm khoảng 2500 bệnh nhân Xuất phát từ những cơ sở khoa học và tiềm năng ứng dụng của tế bào gốc mỡ, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Nghiên cứu khả năng tăng sinh của tế bào gốc mỡ và ảnh hưởng của chúng đến tế bào da nuôi cấy định hướng trong điều trị vết thương” nhằm mục tiêu sau: 1. Đánh giá đặc điểm phân lập và sự tăng sinh của tế bào gốc mỡ trong điều kiện nuôi cấy invitro 2. Đánh giá ảnh hưởng của tế bào gốc mỡ đến tế bào da nuôi cấy 2 z Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Các tế bào chủ yếu tham gia liền vết thƣơng Diễn biến liền vết thƣơng nói chung đều trải qua các giai đoạn đông máu, viêm, tăng sinh, tái lập mô và liền sẹo [3].
Tuy quá trình liền vết thƣơng có nhiều cơ chế phức tạp nhƣng kết quả cuối cùng là tái lập lại các mô tế bào đã bị tổn thƣơng. Để duy trì chức năng bảo vệ cơ thể, con ngƣời cần có da. Thành phần tế bào da ngƣời chủ yếu bao gồm 2 loại là nguyên bào sợi (Fibroblasts) và tế bào sừng (Keratinocytes). Nguyên bào sợi là tế bào tạo ra lớp trung bì còn tế bào sừng tạo ra lớp biểu bì.
Hai loại tế bào này có những chức năng khác nhau nhƣng lại tƣơng tác, kết hợp với nhau để tạo ra cấu trúc da hoàn chỉnh. Hai loại tế bào này cũng là những tế bào chủ yếu làm lành các tổn thƣơng da. Khi da bị tổn thƣơng, nguyên bào sợi là tế bào tổng hợp nên đệm gian bào, tiết các yếu tố tăng trƣởng tạo điều kiện để tế bào sừng từ bờ mép vết thƣơng tăng sinh che phủ bề mặt làm lành vết thƣơng. Nguyên bào sợi (Fibroblasts) là tế bào quan trọng nhất trong giai đoạn tăng sinh, chúng tạo ra các thành phần đệm gian bào làm nền cho quá trình biểu mô hoá và cung cấp các sợi laminin, decorin, elastin, fibronectin để tế bào biểu mô bám và trƣợt trên đó giúp tăng nhanh quá trình biểu mô hoá che phủ vết thƣơng.
Chúng tạo ra protein đệm mà trong đó collagen tạo nên sự bền vững và toàn vẹn của mô. Đồng thời nguyên bào sợi là nguồn cung cấp quan trọng một số yếu tố tăng trƣởng (growth factors - GF) kích thích liền vết thƣơng nhƣ TGF-β, PDGF, KGF. Hơn nữa, nguyên bào sợi chuyển dạng thành myofibroblasts tạo nên sự co rút và liền vết thƣơng nhanh hơn. Nguyên bào sợi còn tham gia vào giai đoạn sửa chữa sẹo diễn ra trong nhiều năm sau khi vết thƣơng.
Ngày thứ 2 sau khi bị thƣơng bị bỏng, nguyên bào sợi xuất hiện ở vết thƣơng do sự dịch chuyển từ mô liên kết bên cạnh. Sản xuất các siêu sợi actin 3 z của cơ trơn chuyển nguyên bào sợi thành myofibroblast, gây co kéo làm hẹp vết thƣơng (1-2 mm/24 giờ). Tổng hợp men Metalloproteinase, collagenase gây thoái huỷ protein khoảng kẽ; men Stomalysin thoái huỷ protein màng nền. Điều hoà tổng hợp và thoá biến collagen thông qua FGF-, TGF-.
Sắp xếp collagen theo cấu trúc mô. Trong khoảng thời gian từ 5-7 ngày, các nguyên bào sợi tăng sinh, và đƣợc kích thích tiết PDGF, TGF-beta để điều khiển quá trình tổng hợp và lắng đọng các thành phần đệm gian bào bao gồm: fibronectin, laminin, glycosaminoglycans (GAGs) và collagen. Nguyên bào sợi còn tham gia vào giai đoạn sửa chữa sẹo diễn ra trong nhiều năm sau khi vết thƣơng đã liền. Tế bào sừng (Keratinocytes) tạo nên lớp biểu bì bảo vệ cơ thể.
Biểu bì gồm nhiều lớp tế bào biểu mô lát tầng sừng hóa, thành phần chính là các tế bào sừng gồm nhiều lớp tế bào sắp xếp chặt chẽ với nhau [1]. Lớp mầm hay còn gọi là lớp đáy chứa các tế bào gốc biểu bì có khả năng tự tồn tại, tự tái sinh nhiều lần và nhanh trong suốt cuộc sống của con ngƣời. Giữa các tế bào sừng có các cầu nối gian bào làm kết nối chặt chẽ giữa chúng với nhau. Các tế bào lớp đáy có cấu trúc cầu nối khác với các lớp ở trên, chúng có thể dễ dàng bị xoá bỏ và cũng tự tái tạo lại để các tế bào sừng mới sinh ra di chuyển lên trên tạo ra các lớp tế bào biệt hoá ở phía trên.
Trong các tế bào của lớp mầm biểu bì thì chỉ có 10 là tế bào mầm biểu bì còn lại là các tế bào đang ở các giai đoạn gián phân. Bình thƣờng sự phân chia tế bào sừng lớp mầm cân bằng với sự sừng hoá bong vảy của biểu bì nhƣng khi da bị tổn thƣơng thì chúng tăng cƣờng phân chia để tạo ra nhiều tế bào biểu mô. Các tế bào biểu mô sẽ di cƣ vào trung tâm của vết thƣơng ở dạng đơn lớp cho đến khi các tế bào tiếp xúc trực tiếp với nhau thì tốc độ phân chia chậm lại và biệt hoá thành các lớp gai, lớp hạt, lớp sừng ở phía trên để thực hiện chức năng bảo vệ của biểu bì. Trong quá trình di cƣ chúng cần đệm gian bào đủ chất lƣợng nhƣ trung bì, chúng cần có các sợi decorin, laminin…để bám vào và trƣợt dọc theo các sợi đó để di chuyển vào trung tâm vết thƣơng.
Trong trƣờng hợp các vết thƣơng mạn tính, cấu trúc đệm gian bào bị tổn thƣơng không 4 z hồi phục, vết thƣơng trở nên xơ sợi, các nguyên bào sợi nghèo nàn hoặc không thể thực hiện đầy đủ chức năng nên các tế bào biểu mô không thể phân chia hay di cƣ vào vết thƣơng. Chính các mối tƣơng tác chặt chẽ giữa hai loại tế bào trên mà trong điều trị cần chú ý tới các điều kiện để cả hai cùng tăng sinh, cùng biệt hoá, cùng thực hiện chức năng liền vết thƣơng thì vết thƣơng mới nhanh liền. Sơ đồ sự tăng sinh của nguyên bào sợi trong các giai đoạn khác nhau của quá trình liền vết thương (Nguồn: Werner S et al (2003), Physiol. 12-24 giờ sau bị thương, nguyên bào sợi quanh tổn thương được kích hoạt.
Từ 3-7 ngày sau bị thương, nguyên bào sợi di cư vào vùng tổn thương, tăng sinh và tổng hợp đệm gian bào. Từ 1-2 tuần sau bị thương, mô hạt hình thành, nguyên bào sợi chuyển dạng thành myofibroblast gây co hẹp vết thương và tiết collagen. Công nghệ mô – tế bào làm lành vết thƣơng 1.