Luận văn thạc sĩ: Nghiên cứu tạo aptamer đặc hiệu vi khuẩn Escherichia coli O157:H7

Luận văn trình bày chi tiết quá trình nghiên cứu, sàng lọc tạo aptamer ssDNA đặc hiệu có khả năng liên kết với vi khuẩn Escherichia coli O157:H7.

• Tác giả: Nguyễn Thanh Thủy
• Người hướng dẫn: TS. Lã Thị Huyền
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Nghiên Cứu Tạo Aptamer Đặc Hiệu Vi Khuẩn Escherichia Coli O157:H7
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2013
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Aptamer là gì Giải pháp mới phát hiện E

Aptamer là các đoạn oligonucleotide (ssDNA hoặc RNA) hoặc peptide ngắn, được tạo ra qua con đường nhân tạo. Chúng có khả năng liên kết mạnh mẽ và đặc hiệu với một phân tử đích cụ thể, từ ion kim loại, phân tử nhỏ, protein cho đến toàn bộ tế bào. Được phát hiện lần đầu vào năm 1990, aptamer nhanh chóng nổi lên như một công cụ đầy hứa hẹn trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là y sinh và an toàn thực phẩm. Khả năng của aptamer đến từ cấu trúc không gian ba chiều độc đáo, cho phép chúng "ôm khít" lấy phân tử đích tương tự như cơ chế khóa và chìa. Trong bối cảnh vi khuẩn gây bệnh đường ruột như E. coli O157:H7 đang là một thách thức lớn, việc phát triển các phương pháp phát hiện nhanh và chính xác trở nên cấp thiết. Aptamer, thường được ví như kháng thể nhân tạo, mang lại một giải pháp đột phá. Chúng có thể được tạo ra để nhận diện đặc hiệu các kháng nguyên bề mặt của E. coli O157:H7, mở đường cho việc phát triển các cảm biến sinh học (biosensor) và kit test nhanh E. coli với độ nhạy và độ đặc hiệu cao. So với kháng thể truyền thống, việc sản xuất aptamer không phụ thuộc vào hệ thống sinh học sống, giúp giảm chi phí, rút ngắn thời gian và đảm bảo tính đồng nhất giữa các lô sản xuất. Nghiên cứu tạo aptamer đặc hiệu vi khuẩn E. coli O157:H7 tập trung vào việc sàng lọc và xác định các chuỗi DNA có ái lực cao nhất với chủng vi khuẩn này, hứa hẹn tạo ra những công cụ chẩn đoán hiệu quả, góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

1.1. Giới thiệu tổng quan về phân tử Oligonucleotide Aptamer

Aptamer, có nguồn gốc từ tiếng Latin 'aptus' (phù hợp) và tiếng Hy Lạp 'meros' (phần), là những đoạn acid nucleic sợi đơn (aptamer DNA hoặc aptamer RNA) có khả năng gấp cuộn thành các cấu trúc không gian ba chiều phức tạp. Cấu trúc này cho phép chúng nhận biết và liên kết với các phân tử đích một cách chuyên biệt. Khác với cơ chế nhận diện dựa trên chuỗi trình tự của acid nucleic, khả năng liên kết của aptamer hoàn toàn dựa vào hình dạng cấu trúc. Quá trình tạo ra aptamer được thực hiện in vitro thông qua một kỹ thuật gọi là SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment). Kỹ thuật này cho phép sàng lọc từ một thư viện khổng lồ (lên tới 10¹⁵ phân tử) các chuỗi oligonucleotide ngẫu nhiên để tìm ra những phân tử có ái lực liên kết aptamer cao và đặc hiệu nhất với mục tiêu đã chọn. Phổ đích của aptamer vô cùng đa dạng, bao gồm các ion, thuốc, độc tố, protein, virus và cả tế bào vi khuẩn.

1.2. So sánh ưu điểm vượt trội của Aptamer và kháng thể

Mặc dù có cùng chức năng nhận diện phân tử, aptamer sở hữu nhiều ưu điểm vượt trội so với kháng thể. Thứ nhất, aptamer được tổng hợp hoàn toàn bằng hóa học, đảm bảo độ tinh sạch cao và tính đồng nhất giữa các mẻ, loại bỏ các biến thể không mong muốn thường gặp trong sản xuất kháng thể. Thứ hai, quá trình sản xuất aptamer nhanh hơn và chi phí thấp hơn đáng kể. Thứ ba, aptamer có độ ổn định cao hơn trong nhiều điều kiện nhiệt độ và pH khác nhau, đồng thời có thể biến tính và hồi tính thuận nghịch mà không làm mất hoạt tính. Đặc biệt, aptamer có kích thước nhỏ hơn kháng thể, cho phép chúng thâm nhập vào các vị trí khó tiếp cận và giảm thiểu đáp ứng miễn dịch không mong muốn trong các ứng dụng điều trị. Cuối cùng, aptamer có thể được tạo ra để nhận diện các mục tiêu không có tính sinh miễn dịch hoặc các chất độc hại, một khả năng mà kháng thể bị hạn chế. Những ưu điểm này làm cho aptamer trở thành một công cụ thay thế đầy tiềm năng cho kháng thể trong lĩnh vực chẩn đoán vi sinh vật và y dược.

II. E

Vi khuẩn Escherichia coli O157:H7 là một chủng thuộc nhóm E. coli gây xuất huyết đường ruột (EHEC), được xem là tác nhân gây ngộ độc thực phẩm cực kỳ nguy hiểm trên toàn cầu. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), chủng vi khuẩn này là nguyên nhân của nhiều vụ dịch lớn, gây ra các triệu chứng nghiêm trọng như tiêu chảy ra máu, viêm đại tràng xuất huyết. Đặc biệt, độc tố Shiga (Shiga toxin) do E. coli O157:H7 sản sinh có thể dẫn đến hội chứng tán huyết urê huyết (HUS), gây suy thận cấp và có tỷ lệ tử vong cao, nhất là ở trẻ em và người cao tuổi. Mối nguy từ E. coli O157:H7 càng trở nên nghiêm trọng do liều gây nhiễm của chúng rất thấp, chỉ cần từ 10-100 tế bào vi khuẩn là có thể gây bệnh. Vi khuẩn này dễ dàng lây nhiễm vào chuỗi cung ứng thực phẩm qua thịt chưa nấu kỹ, rau sống, sữa chưa tiệt trùng và nguồn nước ô nhiễm, đặt ra một thách thức lớn cho ngành an toàn thực phẩm. Các phương pháp phát hiện truyền thống như nuôi cấy vi sinh thường mất nhiều thời gian (vài ngày) và đòi hỏi phòng thí nghiệm chuyên sâu. Các kỹ thuật sinh học phân tử như PCR tuy nhanh hơn nhưng yêu cầu thiết bị đắt tiền và kỹ thuật viên có chuyên môn. Do đó, việc nghiên cứu tạo aptamer đặc hiệu vi khuẩn E. coli O157:H7 là một hướng đi cấp thiết nhằm phát triển công cụ chẩn đoán vi sinh vật nhanh chóng, đơn giản và hiệu quả ngay tại hiện trường.

2.1. Tác hại của vi khuẩn gây bệnh đường ruột E. coli O157 H7

Khi xâm nhập vào cơ thể, E. coli O157:H7 bám vào tế bào biểu mô ruột và bắt đầu sản sinh độc tố Shiga. Độc tố này sau khi được hấp thu vào máu sẽ di chuyển đến các cơ quan khác, đặc biệt là thận. Tại đây, chúng tấn công các tế bào nội mô mạch máu, gây tổn thương và dẫn đến sự hình thành các cục máu đông nhỏ. Quá trình này gây ra hội chứng tán huyết urê huyết (HUS), đặc trưng bởi ba triệu chứng chính: thiếu máu tán huyết, giảm tiểu cầu và suy thận cấp. Bệnh nhân có thể tử vong nếu không được điều trị kịp thời. Bên cạnh đó, vi khuẩn này còn gây ra viêm đại tràng xuất huyết, dẫn đến đau bụng dữ dội và tiêu chảy phân có máu. Mức độ nguy hiểm và khả năng lây lan nhanh chóng khiến việc phát hiện E. coli sớm trở thành yếu tố then chốt trong việc kiểm soát dịch bệnh và bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng.

2.2. Những hạn chế trong các phương pháp chẩn đoán vi sinh vật

Các phương pháp chẩn đoán E. coli O157:H7 hiện tại đối mặt với nhiều hạn chế. Phương pháp nuôi cấy truyền thống, dù là tiêu chuẩn vàng, nhưng tốn thời gian từ 3-5 ngày để cho kết quả, làm chậm quá trình điều tra và xử lý ngộ độc. Các phương pháp miễn dịch học dựa trên kháng thể (như ELISA) có thể nhanh hơn nhưng đôi khi gặp vấn đề về độ đặc hiệu chéo và độ ổn định của kháng thể. Các kỹ thuật sinh học phân tử như Real-time PCR có độ nhạy cao nhưng chi phí đầu tư thiết bị và vận hành lớn, không phù hợp cho việc sàng lọc quy mô rộng hoặc kiểm tra tại chỗ. Những thách thức này thúc đẩy nhu cầu tìm kiếm một công nghệ mới, kết hợp được tốc độ, độ chính xác, chi phí hợp lý và dễ sử dụng, mà trong đó công nghệ dựa trên aptasensor đang nổi lên như một ứng cử viên sáng giá.

III. Hướng dẫn phương pháp SELEX sàng lọc aptamer đặc hiệu E

Quy trình tạo aptamer đặc hiệu vi khuẩn E. coli O157:H7 được thực hiện thông qua phương pháp SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment). Đây là một quy trình chọn lọc in vitro mạnh mẽ để phân lập các aptamer có ái lực cao từ một thư viện oligonucleotide ban đầu. Quá trình này bắt đầu với một thư viện ssDNA tổng hợp, chứa hàng nghìn tỷ (10¹⁴ - 10¹⁵) chuỗi trình tự ngẫu nhiên. Thư viện này được ủ với tế bào E. coli O157:H7 (phân tử đích). Các chuỗi ssDNA có cấu trúc phù hợp sẽ liên kết với các phân tử trên bề mặt vi khuẩn. Sau giai đoạn ủ, các chuỗi không liên kết sẽ được rửa trôi. Những chuỗi đã liên kết đặc hiệu sẽ được thu lại và khuếch đại bằng kỹ thuật PCR. Sản phẩm PCR sau đó được xử lý để tạo lại ssDNA và trở thành thư viện đầu vào cho vòng sàng lọc tiếp theo. Quá trình này được lặp lại nhiều vòng (thường từ 8-15 vòng). Ở mỗi vòng, điều kiện rửa giải được làm nghiêm ngặt hơn (ví dụ: tăng nồng độ chất cạnh tranh, giảm thời gian ủ) để tăng cường áp lực chọn lọc, chỉ giữ lại những aptamer có ái lực liên kết aptamer mạnh nhất. Để đảm bảo tính đặc hiệu của aptamer, các vòng sàng lọc âm (sàng lọc loại trừ) với các chủng vi khuẩn gần gũi nhưng không phải là đích (ví dụ: E. coli K12) được thực hiện xen kẽ. Cuối cùng, quần thể aptamer đã được làm giàu sẽ được tách dòng và giải trình tự để xác định các ứng viên tiềm năng nhất.

3.1. Nguyên lý cốt lõi của phương pháp SELEX sàng lọc aptamer

Nguyên lý của phương pháp SELEX dựa trên sự chọn lọc có định hướng và khuếch đại theo cấp số nhân. Quá trình gồm ba bước lặp lại: (1) Liên kết: Thư viện ssDNA được ủ với phân tử đích (E. coli O157:H7). (2) Phân tách: Các phức hợp aptamer-đích được tách ra khỏi các chuỗi không liên kết. (3) Khuếch đại: Các chuỗi được chọn lọc được nhân lên số lượng lớn bằng PCR. Chìa khóa của SELEX là việc tăng dần độ khắc nghiệt qua mỗi vòng lặp, giúp loại bỏ các phân tử có ái lực yếu và làm giàu các phân tử có ái lực cao. Quy trình này mô phỏng quá trình tiến hóa của Darwin ở cấp độ phân tử, cho phép "tiến hóa" ra các aptamer DNA có khả năng nhận diện mục tiêu một cách tối ưu.

3.2. Quy trình sàng lọc aptamer và tối ưu hóa điều kiện

Một quy trình sàng lọc aptamer điển hình bao gồm các bước chính: chuẩn bị thư viện ssDNA ban đầu, thực hiện các vòng sàng lọc dương với vi khuẩn đích E. coli O157:H7 và các vòng sàng lọc âm với vi khuẩn không phải đích. Trong nghiên cứu này, 8 vòng sàng lọc dương và 1 vòng sàng lọc âm đã được tiến hành. Điều kiện sàng lọc được tối ưu hóa bằng cách tăng dần độ nghiêm ngặt, chẳng hạn như giảm nồng độ thư viện DNA đầu vào, giảm thời gian ủ và tăng số lần rửa. Việc theo dõi sự làm giàu của các phân tử gắn đặc hiệu được thực hiện bằng cách đo nồng độ DNA thu được sau mỗi vòng. Quá trình sàng lọc sẽ dừng lại khi tỷ lệ DNA thu hồi đạt đến trạng thái bão hòa, cho thấy quần thể aptamer có ái lực cao đã được làm giàu thành công.

IV. Quy trình tách dòng và xác định trình tự aptamer ssDNA

Sau khi hoàn tất quá trình sàng lọc aptamer bằng phương pháp SELEX, bước tiếp theo và cũng là bước quyết định là tách dòng và xác định trình tự của các ứng viên aptamer tiềm năng. Quần thể ssDNA thu được từ vòng sàng lọc cuối cùng là một hỗn hợp gồm nhiều chuỗi có ái lực cao. Để phân tích từng chuỗi riêng lẻ, sản phẩm PCR của quần thể này được gắn vào một vector plasmid chuyên dụng, ví dụ như vector pCR™2.1-TOPO®. Phản ứng gắn này tạo ra các plasmid tái tổ hợp, mỗi plasmid mang một trình tự aptamer DNA duy nhất. Tiếp theo, các plasmid tái tổ hợp này được biến nạp vào tế bào chủ là vi khuẩn E. coli (ví dụ chủng DH5α). Vi khuẩn sau khi biến nạp sẽ được nuôi cấy trên môi trường thạch chọn lọc có chứa kháng sinh và chất chỉ thị màu (X-gal). Mỗi khuẩn lạc mọc lên đại diện cho một dòng vi khuẩn mang một loại plasmid tái tổ hợp duy nhất. Các khuẩn lạc này sau đó được chọn lọc và nuôi cấy để nhân lên số lượng lớn. DNA plasmid được tách chiết từ các dòng vi khuẩn này và gửi đi giải trình tự bằng các phương pháp tự động (ví dụ: phương pháp Sanger). Kết quả giải trình tự sẽ cung cấp thông tin chính xác về chuỗi nucleotide của từng aptamer. Các trình tự này sau đó được phân tích, so sánh và dự đoán cấu trúc không gian bậc hai để chọn ra những aptamer tốt nhất cho các bước đánh giá và ứng dụng tiếp theo.

4.1. Kỹ thuật gắn sản phẩm PCR vào vector và biến nạp

Sản phẩm PCR từ vòng SELEX cuối cùng được tinh sạch và tiến hành phản ứng gắn (ligation) vào vector tách dòng. Trong nghiên cứu này, bộ kit TOPO® TA Cloning® được sử dụng, tận dụng đặc tính enzyme Taq polymerase thường thêm một gốc Adenine (A) vào đầu 3' của sản phẩm PCR. Vector pCR™2.1-TOPO® được thiết kế sẵn có một đầu 3'-Thymine (T) nhô ra, giúp việc gắn sản phẩm PCR vào vector trở nên hiệu quả và nhanh chóng. Hỗn hợp sau phản ứng gắn sẽ được dùng để biến nạp vào tế bào E. coli khả biến. Quá trình biến nạp thường sử dụng phương pháp sốc nhiệt, làm thay đổi tạm thời tính thấm của màng tế bào vi khuẩn, cho phép plasmid xâm nhập vào bên trong. Các tế bào biến nạp thành công sẽ được chọn lọc dựa trên khả năng kháng kháng sinh (do gen kháng kháng sinh có trên vector quy định).

4.2. Phân tích kết quả giải trình tự và dự đoán cấu trúc

Kết quả giải trình tự của các dòng aptamer được phân tích bằng các công cụ tin sinh học. Các trình tự giống hệt nhau được nhóm lại để xác định tần suất xuất hiện của mỗi loại aptamer, những trình tự xuất hiện nhiều lần thường là những ứng viên sáng giá. Các công cụ như FASTA được dùng để so sánh trình tự aptamer với ngân hàng gen nhằm đảm bảo tính mới của chúng. Quan trọng hơn, cấu trúc không gian bậc hai của các aptamer được dự đoán bằng phần mềm Mfold. Cấu trúc này, bao gồm các vùng thân (stem) và vùng vòng (loop), là yếu tố quyết định đến khả năng và tính đặc hiệu của aptamer khi liên kết với phân tử đích. Việc phân tích cấu trúc giúp lựa chọn ra những aptamer có cấu trúc ổn định và tiềm năng nhất để tổng hợp và kiểm tra ái lực.

V. Ứng dụng aptamer và hạt nano vàng phát hiện E

Một trong những ứng dụng thực tiễn nổi bật nhất của nghiên cứu tạo aptamer đặc hiệu vi khuẩn E. coli O157:H7 là phát triển các cảm biến sinh học nhanh và nhạy. Aptamer sau khi được xác định và tổng hợp có thể được tích hợp với nhiều công nghệ khác nhau để tạo ra tín hiệu nhận biết. Một phương pháp phổ biến và hiệu quả là kết hợp aptamer với hạt nano vàng (AuNPs). Hạt nano vàng có các đặc tính quang học độc đáo, đặc biệt là hiện tượng cộng hưởng plasmon bề mặt, khiến dung dịch của chúng có màu đỏ đặc trưng. Các phân tử aptamer DNA được cố định aptamer lên bề mặt hạt nano vàng. Khi không có vi khuẩn E. coli O157:H7, các hạt nano vàng bọc aptamer phân tán đều trong dung dịch, duy trì màu đỏ. Tuy nhiên, khi có mặt vi khuẩn đích, aptamer sẽ liên kết đặc hiệu với kháng nguyên trên bề mặt E. coli. Sự liên kết này gây ra sự kết tụ của các hạt nano vàng, dẫn đến sự thay đổi màu sắc của dung dịch từ đỏ sang tím hoặc xanh lam. Sự thay đổi màu sắc này có thể quan sát bằng mắt thường hoặc đo bằng máy quang phổ, cho phép phát hiện E. coli một cách nhanh chóng. Phương pháp này không chỉ đơn giản, chi phí thấp mà còn có tiềm năng phát triển thành các kit test nhanh E. coli dạng que thử (tương tự que thử thai), rất phù hợp cho việc kiểm tra tại hiện trường trong ngành an toàn thực phẩm.

5.1. Chế tạo phức hợp aptamer hạt nano vàng AuNPs

Việc chế tạo phức hợp aptamer-AuNPs là bước quan trọng để tạo ra aptasensor dựa trên màu sắc. Các hạt nano vàng được tổng hợp bằng phương pháp khử hóa học. Sau đó, dung dịch aptamer được ủ cùng với dung dịch hạt nano vàng. Các aptamer sẽ tự động bám lên bề mặt hạt vàng thông qua tương tác tĩnh điện và các lực khác. Quá trình này được tối ưu hóa về nồng độ aptamer, nồng độ muối và thời gian ủ để đảm bảo các hạt vàng được bao phủ ổn định. Sự hình thành phức hợp được xác nhận bằng các kỹ thuật như kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) và đo phổ hấp thụ UV-Vis. Phức hợp ổn định này chính là đầu dò phân tử, sẵn sàng cho các thử nghiệm phát hiện vi khuẩn.

5.2. Nguyên lý hoạt động của aptasensor dựa trên sự đổi màu

Nguyên lý của aptasensor màu dựa trên sự thay đổi khoảng cách giữa các hạt nano vàng. Ở trạng thái phân tán, các hạt nano vàng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng khoảng 520 nm, tạo ra màu đỏ. Khi có vi khuẩn E. coli O157:H7, các aptamer trên các hạt nano vàng khác nhau sẽ cùng lúc bám vào một tế bào vi khuẩn, đóng vai trò như một cầu nối, kéo các hạt nano vàng lại gần nhau. Sự kết tụ này làm thay đổi phổ hấp thụ plasmon, dịch chuyển đỉnh hấp thụ về phía bước sóng dài hơn, khiến mắt người cảm nhận được sự thay đổi màu sắc từ đỏ sang tím. Độ nhạy của phương pháp có thể được tinh chỉnh bằng cách thay đổi kích thước hạt nano và mật độ cố định aptamer. Phương pháp này cung cấp một cách phát hiện E. coli trực quan, không cần thiết bị phức tạp.

VI. Triển vọng và tương lai của công nghệ Aptamer tại Việt Nam

Nghiên cứu tạo aptamer đặc hiệu vi khuẩn E. coli O157:H7 không chỉ giải quyết một vấn đề cấp bách về an toàn thực phẩm mà còn mở ra một hướng đi công nghệ mới và đầy triển vọng tại Việt Nam. Công nghệ aptamer, với những ưu điểm về chi phí, độ ổn định và tính linh hoạt, có tiềm năng ứng dụng vô cùng rộng rãi. Trong tương lai, các aptamer được phát triển có thể tích hợp vào các nền tảng cảm biến sinh học đa dạng hơn, chẳng hạn như cảm biến điện hóa, cảm biến quang học sợi, hoặc vi mạch dòng chảy, nhằm tăng độ nhạy và khả năng định lượng chính xác. Việc phát triển thành công các kit test nhanh E. coli dựa trên aptamer sẽ là một bước tiến lớn, giúp các cơ quan quản lý, doanh nghiệp chế biến và người tiêu dùng có thể chủ động kiểm soát chất lượng thực phẩm một cách hiệu quả. Xa hơn nữa, nền tảng công nghệ sàng lọc aptamer này có thể được mở rộng để tạo ra các công cụ chẩn đoán cho nhiều tác nhân gây bệnh khác trong nông nghiệp, thủy sản và y tế, như virus cúm gia cầm, Salmonella, hoặc các dấu ấn sinh học của bệnh ung thư. Việc làm chủ công nghệ lõi này sẽ giúp Việt Nam tự chủ trong việc sản xuất các sinh phẩm chẩn đoán quan trọng, giảm phụ thuộc vào nhập khẩu và góp phần nâng cao năng lực khoa học công nghệ của đất nước.

6.1. Đánh giá ái lực và tính đặc hiệu của aptamer đã chọn lọc

Tương lai của công nghệ này phụ thuộc vào việc đánh giá kỹ lưỡng các aptamer ứng viên. Ái lực liên kết aptamer (thể hiện qua hằng số phân ly Kd) cần được xác định để chọn ra những phân tử có khả năng bám dính mạnh nhất. Đồng thời, tính đặc hiệu của aptamer phải được kiểm tra chéo với một loạt các chủng vi sinh vật khác để đảm bảo chúng chỉ nhận diện duy nhất E. coli O157:H7. Các phương pháp như Dot blot, ELISA-like hoặc đo lường cộng hưởng plasmon bề mặt (SPR) có thể được sử dụng cho mục đích này. Chỉ những aptamer vượt qua các bài kiểm tra nghiêm ngặt này mới được lựa chọn để phát triển các ứng dụng thương mại.

6.2. Hướng phát triển các bộ kit chẩn đoán thương mại

Mục tiêu cuối cùng là thương mại hóa công nghệ dưới dạng các kit test nhanh E. coli tiện lợi. Để đạt được điều này, quy trình sản xuất aptamer và chế tạo aptasensor cần được chuẩn hóa và tối ưu hóa ở quy mô lớn. Các nghiên cứu tiếp theo sẽ tập trung vào việc tăng độ ổn định của kit trong điều kiện bảo quản thông thường, đơn giản hóa các bước thao tác để người không có chuyên môn cũng có thể sử dụng, và xác nhận hiệu quả của kit trên các mẫu thực phẩm thực tế (thịt, rau, sữa). Sự thành công trong việc thương mại hóa sẽ tạo ra những sản phẩm "Made in Vietnam" có giá trị cao, phục vụ thiết thực cho xã hội và khẳng định vị thế của khoa học công nghệ Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Ngộ độc thực phẩm là vấn đề rất đƣợc quan tâm không chỉ ở Việt Nam mà còn trên toàn thế giới. Nguyên nhân chủ yếu gây ngộ độc thực phẩm là vi sinh vật, thƣờng gặp nhƣ Escherichia coli (E. coli), Salmonella spp. Trong đó, vi sinh vật gây ngộ độc nguy hiểm và thƣờng gặp nhất là E.

Theo báo cáo số 18 năm 2011 trong chuỗi báo cáo đánh giá nguy cơ nhiễm vi sinh vật của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) và Tổ chức Nông lƣơng thế giới (FAO) đã thống kê tỉ lệ ngƣời nhiễm E.000 dân: Tại Liên minh Châu Âu 1,3 ngƣời; tại Mỹ 1,9 ngƣời; tại Newzeland và Australia 2 ngƣời; tại Argentina 22 ngƣời. coli O157:H7 thuộc loài E. coli gây xuất huyết ruột (EHEC - Enterohaemorrhagic E. coli), sinh độc tố Shiga.

coli O157:H7 là đối tƣợng gây ngộ độc thực phẩm cực kỳ nguy hiểm trên phạm vi toàn cầu. Chúng gây tiêu chảy phân máu, viêm đại tràng xuất huyết. Những trƣờng hợp hoại tử nặng có thể dẫn tới thủng ruột. Độc tố Shiga còn có thể gây hội chứng tăng ure huyết tan máu, suy thận (HUS - haemorrhagic uremic syndrome) dẫn tới tử vong.

coli O157:H7 là tác nhân gây bệnh nguy hiểm nhƣng dễ dàng bị lây nhiễm ở nhiều thực phẩm thiết yếu nhƣ nƣớc, rau, thịt sống, thịt chƣa nấu kỹ…Mối nguy E. coli O157:H7 rất lớn do chủng này có liều gây độc thấp (10 – 100 tế bào), gây dịch tiêu chảy, tốc độ lây lan nhanh, sinh độc tố Shiga, tỷ lệ gây tan huyết và suy thận cao, dẫn tới tử vong. Hàng năm, khoảng 15% trẻ em và một tỷ lệ thấp hơn ngƣời lớn nhiễm E. coli O157:H7 và dẫn tới hội chứng tán huyết, suy thận, trong đó 50% số bệnh nhân phải chạy thận và 5% tử vong.

Kể từ khi đƣợc xác định năm 1982 tại Hoa Kỳ, E. coli O157:H7 đã trở thành mầm bệnh quan trọng nhất trong nhóm các bệnh lây lan qua thực phẩm tại Hoa Kỳ cũng nhƣ các nƣớc đã phát triển ở Châu Âu và Nhật Bản. Tại Việt Nam, theo số liệu thống kê của Cục Vệ sinh An toàn thực phẩm – Bộ Y tế: Năm 2013 có 5.200 trƣờng hợp bị ngộ độc. coli là nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm quan trọng nên rất đƣợc quan tâm nghiên cứu.

Tuy đã có nhiều nghiên cứu về phân lập và xác định tỷ lệ nhiễm E. coli nói chung nhƣng 1 về E. coli O157:H7 nói riêng chỉ có một số nghiên cứu nhỏ, phân tán, chƣa thỏa đáng với mức độ nguy hiểm của nó. coli O157:H7 còn gặp nhiều khó khăn, mất nhiều thời gian, đòi hỏi các trang thiết bị, máy móc hiện đại, phân tích viên có trình độ chuyên môn cao.

Do đó, việc phân tích chính xác E. coli O157:H7 ở nƣớc ta còn hạn chế. Aptamer có bản chất là acid oligonucleic hoặc các phân tử peptide có khả năng liên kết chặt chẽ với một phân tử đích cụ thể nhờ sự tƣơng tác cấu trúc trong không gian 3 chiều. Phổ đích của aptamer rất đa dạng từ ion, phân tử, đại phân tử tới tế bào.

Aptamer đã đƣợc ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: vận chuyển các phân tử, chẩn đoán các mối nguy, tạo cảm biến sinh học, nghiên cứu y dƣợc, điều trị ung thƣ, tạo thuốc phân tử, điều trị lâm sàng, nghiên cứu dịch tễ học… Trong một số trƣờng hợp với vai trò nhƣ đầu dò nhận biết phân tử, aptamer có ái lực liên kết thậm chí vƣợt qua các kháng thể đơn dòng. Xuất phát từ nhu cầu sàng lọc, xác định E. coli O157:H7 một cách nhanh chóng, hạ giá thành nên chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tạo aptamer đặc hiệu vi khuẩn Escherichia coli O157:H7”. Mục tiêu của đề tài nhằm xây dựng đƣợc quy trình sàng lọc và sàng lọc đƣợc phân tử aptamer có khả năng nhận biết đặc hiệu vi khuẩn E.

Nội dung nghiên cứu: - Xây dựng thƣ viện ssDNA và sàng lọc các aptamer liên kết với vi khuẩn E. - Tách dòng và xác định trình tự aptamer nhận biết đặc hiệu vi khuẩn E. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về Escherichia coli O157:H7 1.

Giới thiệu chung về E. coli O157:H7 Escherichia coli O157:H7 thuộc họ Enterobacteriaceae, chi Escherichia [5]. Chúng là vi khuẩn Gram âm, hình que, có khả năng di động (hình 1. Kích thƣớc: dài từ 2 - 4 µm, rộng 0.8 - 1µm, có nhiều lông toàn thân và có roi dài khoảng 20 nm.

coli O157:H7 là sinh vật nhân sơ, DNA có cấu trúc siêu xoắn nằm giữa tế bào, không có màng nhân bao bọc. coli O157:H7 có cấu tạo đơn giản bao gồm: Lớp ngoài là thành tế bào,có thêm lớp màng lipopolysaccharide (LPS). Lớp trong là màng sinh chất (gồm 1 lớp lipid nằm giữa 2 lớp phospho) bao quanh tế bào chất. Tế bào chất là phần vật chất dạng keo chứa protein, acid nucleic, hydrat carbon, lipid, các ion vô cơ và nhiều nhiều chất khác có khối lƣợng phân tử thấp [7,8].1: Cấu tạo tế bào vi khuẩn E.

coli O157:H7 DNA của vi khuẩn E. coli O157:H7 gồm hệ gen nhân dài sấp xỉ 5,5 triệu bp, gồm khoảng 5483 gen và 2 plasmid có chiều dài lần lƣợt là 93 kb và 3,3 kb (hình 1. Trong hệ gen nhân chứa 2 gen mã hóa cho độc tố đặc trƣng của vi khuẩn này là stx1 và stx2 [5,25]. coli O157:H7 có hai loại kháng nguyên là O và H, trong đó O là kháng nguyên bề mặt, còn H là kháng nguyên lông roi [5,6].1: Thông số hệ gen của vi khuẩn E.

coli O157:H7 Hệ gen pO157 pOSAK1 Độ dài 5,498,450 bp 92,721 bp 3,306 bp Tỉ lệ G+C 50.4 % Khung đọc mở (ORF): 5,361 83 3 Vùng mã hóa protein 88.8 % Chiều dài trung bình của các ORF 904 bp 922 bp 579 bp rRNA (16S-23S-5S) 7 0 0 tRNA và tmRNA 103 0 0 Hình 1.2: Cấu trúc hệ gen của vi khuẩn E. Đặc tính của E. coli O157:H7 là vi sinh vật hiếu kị khí tùy tiện, có khả năng hô hấp và lên men để trao đổi chất. Chúng không sinh bào tử, tế bào tồn tại dạng đơn lẻ hoặc theo cặp đôi.

Vi khuẩn này có thể sinh trƣởng ở dải nhiệt độ rộng từ 80C đến 460C, nhiệt độ tối ƣu là 370C, bị tiêu diệt ở nhiệt độ trên 700C. coli O157:H7 sinh truởng đƣợc trên môi trƣờng có pH từ 4,4 đến 9,0; thậm chí ở 370C trong 2 - 7h, nó vẫn có thể tồn tại đƣợc ở pH = 2,5 [43]; pH tối ƣu khoảng 6 - 7. Vi khuẩn này bị ức chế ở môi trƣờng có nồng độ muối là 8,5%, chậm phát triển ở nồng độ trên 2,5%. coli O157:H7 sống kí sinh trong hệ tiêu hóa của ngƣời và động vật.

Tuy nhiên khi bị phóng thích ra ngoài môi trƣờng chúng vẫn tiếp tục tồn tại 2 - 3 ngày ở 250C, 10 - 31 ngày ở 80C. Điều này càng làm cho chúng có khả năng lan rộng và xâm nhiễm vào các tế bào vật chủ mới [14]. coli O157:H7 có khả năng lên men đƣờng lactose. Trên môi trƣờng Endo agar khuẩn lạc E.

coli O157:H7 tròn, lồi, có ánh kim (hình 1.3: Hình ảnh khuẩn lạc của E. coli O157:H7 trên môi trƣờng Endo agar và trên môi trƣờng Fluorocult® E. coli O157:H7 không có khả năng lên men đƣờng sorbitol và cellobise. Vi khuẩn này không tạo ra  -D-glucuronidase do đó không chuyển hóa 4- methylumbelliferyl--D-glucuronid (MUG) thành 4-methylumbelliferonenên khi chiếu dƣới đèn UV khuẩn lạc không phát huỳnh quang.

Khi nuôi cấy trên môi trƣờng Fluorocult® có bổ sung sorbitol và 4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronid (MUG), do không có khả năng lên men đƣờng sorbitol, khuẩn lạc có màu xanh nhạt 5 phân biệt với các E. coli khác có màu vàng do lên men đƣợc đƣờng sorbitol. Đây là đặc điểm đƣợc sử dụng trong xét nghiệm để phát hiện sự có mặt của vi khuẩn này [26]. coli O157:H7 là loại vi khuẩn có khả năng sinh độc tố.

Chúng có khả năng sinh độc tố Shiga hay còn gọi độc tố Vero. Loại độc tố này không gây hại đối với động vật nhƣng lại gây nguy hiểm cho ngƣời nhƣ gây tán huyết, suy thận, thậm chí tử vong [38]. coli O157:H7 có hai loại kháng nguyên là O và H. Kháng nguyên thân O (somatic antigen) là kháng nguyên của vách tế bào, cấu tạo bởi lipopolysaccharide, có trên 150 loại khác nhau.

Đặc tính của kháng nguyên O: - Bền nhiệt, không bị hủy khi đun nóng 100oC trong 2h. - Kháng cồn, không bị hủy khi tiếp xúc với cồn 50%. - Bị hủy bởi formol 5%. - Rất độc, chỉ cần 0,05 mg đủ để giết chuột nhắt sau 24h.

Khi kháng nguyên O gặp kháng huyết thanh tƣơng ứng sẽ xảy ra phản ứng ngƣng kết O. Kháng nguyên O giữ vai trò nhất định đối với khả năng gây bệnh của dòng vi khuẩn và có tính chất chuyên biệt cho từng loài vật chủ [7]. Kháng nguyên lông roi H (flagellar antigen): có trên 50 loại khác nhau, cấu tạo bởi protein và có tính chất không chịu nhiệt, bị hủy bởi cồn 50% và các proteinase, không bị hủy bởi formol 5%. Khi kháng nguyên H gặp kháng thể tƣơng ứng sẽ xảy ra hiện tƣợng ngƣng kết H [7,20].

Nguyên nhân và cơ chế gây bệnh của E. coli O157:H7 là vi khuẩn sinh độc tố. Trong hệ gen nhân của vi khuẩn này chứa 2 gen mã hóa cho độc tố đặc trƣng của chúng là stx1 và stx2. Trong đó, stx viết tắt của Shiga – like – toxin [8].

Stx là một ngoại độc tố không bền nhiệt, tác động lên cả ruột và hệ thần kinh trung ƣơng của ngƣời. coli O157:H7 gây tiêu chảy, xuất huyết, đồng thời ức chế hấp thu đƣờng và các acid amin ở ruột non. Theo kết quả nghiên cứu của Bộ môn vi sinh, Khoa Y, Đại học Y Dƣợc Tp. Hồ Chí 6 Minh, năm 1996: Độc tố theo đƣờng máu gây ảnh hƣởng nghiêm trọng đến hệ thần kinh, có thể dẫn đến mê sảng, biến chứng thần kinh trầm trọng: co giật, tê liệt.

Stx1 và Stx2 đều có tiểu đơn vị A có hoạt tính enzyme và tiểu đơn vị B gắn với thụ thể đặc hiệu là một glycolipid kí hiệu Gb3 (thụ thể đặc hiệu của Stx2 là Gb4). Các Gb3 thƣờng thấy ở các tế bào biểu mô thận, tế bào biểu mô ruột, tế bào biểu mô mạch [8]. Stx là một protein có tính kháng nguyên mạnh, mang tính chất của một ngoại độc tố, các gen mã hóa nằm trên chromosome. stx1 có tính bảo tồn cao trong khi stx2 rất hay thay đổi về trình tự [19,25].

Tất cả các loại Stx đều có chung một cấu trúc AB5, trong đó một tiểu đơn vị A kết hợp với năm tiểu đơn vị B. Tiểu đơn vị A có hoạt tính N – Glycosidase xúc tác cắt một gốc adenin từ 28S rRNA của tiểu đơn vị ribisome 60S trong các tế bào bị độc tố tác động.