Nghiên cứu đặc trưng tần suất alen hệ nhận dạng STR trong giám định ADN của các tộc người Việt Nam

Luận án tiến sĩ nghiên cứu hus nghiên cứu đặc trưng tần suất alen hệ nhận dạng str ampflstr® identifiler® plus kit của một số, phát triển phương pháp mới, đánh giá hiệu quả ứng

• Tác giả: Trịnh Tuấn Toàn
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Quang Huy
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Hóa sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu đặc trưng tần suất alen hệ nhận dạng STR (AmpFlSTR® Identifiler® Plus Kit) của một số tộc người Việt Nam để ứng dụng trong giám định ADN
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Sơ lƣợc về lịch sử nhận dạng cá thể người bằng ADN
• DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu tần suất alen STR trong giám định ADN

Nghiên cứu tần suất alen STR (Short Tandem Repeat) trong giám định ADN là một lĩnh vực quan trọng trong di truyền học và pháp y. STR là các đoạn ADN ngắn lặp lại, có tính đa hình cao, giúp phân biệt các cá thể. Việc xác định tần suất alen STR của các tộc người Việt Nam không chỉ hỗ trợ trong việc giám định ADN mà còn góp phần vào nghiên cứu di truyền học và bảo tồn văn hóa. Nghiên cứu này nhằm mục đích cung cấp dữ liệu cần thiết cho các ứng dụng trong khoa học hình sự và xác định quan hệ huyết thống.

1.1. Khái niệm và vai trò của alen STR trong giám định ADN

Alen STR là các đoạn ADN có cấu trúc lặp lại, được sử dụng rộng rãi trong giám định ADN. Chúng có vai trò quan trọng trong việc xác định danh tính cá nhân và quan hệ huyết thống. STR cho phép phân tích ADN với độ chính xác cao, giúp truy nguyên nguồn gốc và xác định mối quan hệ giữa các cá thể.

1.2. Tầm quan trọng của nghiên cứu tần suất alen STR tại Việt Nam

Việt Nam có nhiều tộc người với đặc trưng di truyền khác nhau. Nghiên cứu tần suất alen STR giúp hiểu rõ hơn về sự đa dạng di truyền trong các tộc người, từ đó hỗ trợ cho các hoạt động giám định ADN và bảo tồn di sản văn hóa. Dữ liệu này cũng có thể được áp dụng trong các lĩnh vực khác như y học và sinh học phân tử.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu tần suất alen STR

Mặc dù nghiên cứu tần suất alen STR mang lại nhiều lợi ích, nhưng cũng gặp phải không ít thách thức. Một trong những vấn đề lớn nhất là sự đa dạng di truyền giữa các tộc người. Mỗi tộc người có những đặc trưng riêng về tần suất alen, điều này đòi hỏi phải có các nghiên cứu riêng biệt cho từng nhóm. Ngoài ra, việc thu thập mẫu và phân tích ADN cũng gặp nhiều khó khăn do điều kiện địa lý và văn hóa.

2.1. Đặc điểm di truyền của các tộc người Việt Nam

Mỗi tộc người tại Việt Nam có những đặc điểm di truyền riêng, ảnh hưởng đến tần suất alen STR. Việc hiểu rõ các đặc điểm này là cần thiết để đảm bảo tính chính xác trong giám định ADN. Các nghiên cứu trước đây cho thấy sự khác biệt rõ rệt về tần suất alen giữa các tộc người, điều này cần được xem xét kỹ lưỡng.

2.2. Khó khăn trong việc thu thập mẫu và phân tích ADN

Việc thu thập mẫu ADN từ các tộc người thiểu số gặp nhiều khó khăn do điều kiện địa lý và sự e ngại của người dân. Ngoài ra, quy trình phân tích ADN cũng yêu cầu thiết bị hiện đại và kỹ thuật viên có chuyên môn cao, điều này có thể gây khó khăn trong việc thực hiện nghiên cứu.

III. Phương pháp nghiên cứu tần suất alen STR hiệu quả

Để nghiên cứu tần suất alen STR, cần áp dụng các phương pháp khoa học hiện đại. Các bước chính bao gồm thu thập mẫu, tách chiết ADN, phân tích và tính toán tần suất alen. Sử dụng bộ kít AmpFlSTR® Identifiler® Plus là một trong những phương pháp hiệu quả nhất hiện nay, giúp đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy của kết quả.

3.1. Quy trình thu thập và xử lý mẫu ADN

Quy trình thu thập mẫu ADN bao gồm việc lấy mẫu máu từ các cá thể, sau đó lưu trữ và xử lý mẫu theo tiêu chuẩn. Việc này đảm bảo rằng mẫu ADN không bị biến đổi và có thể sử dụng cho các phân tích tiếp theo. Các bước xử lý mẫu cần được thực hiện cẩn thận để đảm bảo độ chính xác của kết quả.

3.2. Phân tích tần suất alen bằng công nghệ hiện đại

Sử dụng công nghệ điện di mao quản và PCR (Polymerase Chain Reaction) để phân tích tần suất alen STR. Các phương pháp này cho phép xác định chính xác các alen có trong mẫu ADN, từ đó tính toán tần suất alen cho từng tộc người. Kết quả phân tích sẽ được so sánh với các dữ liệu đã có để đánh giá tính đặc trưng.

IV. Ứng dụng thực tiễn của nghiên cứu tần suất alen STR

Nghiên cứu tần suất alen STR có nhiều ứng dụng thực tiễn trong giám định ADN và khoa học hình sự. Kết quả nghiên cứu không chỉ giúp xác định danh tính cá nhân mà còn hỗ trợ trong việc điều tra tội phạm và xác định quan hệ huyết thống. Việc xây dựng bảng tần suất alen cho các tộc người Việt Nam sẽ tạo ra cơ sở dữ liệu quý giá cho các nghiên cứu và ứng dụng sau này.

4.1. Ứng dụng trong giám định ADN hình sự

Kết quả nghiên cứu tần suất alen STR có thể được sử dụng để xác định danh tính nghi phạm trong các vụ án hình sự. Việc này giúp tăng cường tính chính xác trong việc điều tra và truy tố tội phạm. Các cơ quan chức năng có thể dựa vào dữ liệu này để đưa ra các quyết định chính xác hơn trong quá trình điều tra.

4.2. Ứng dụng trong xác định quan hệ huyết thống

Nghiên cứu tần suất alen STR cũng có thể được áp dụng trong việc xác định quan hệ huyết thống giữa các cá nhân. Điều này đặc biệt quan trọng trong các vụ việc liên quan đến quyền lợi thừa kế hoặc xác định cha mẹ. Dữ liệu tần suất alen sẽ giúp cung cấp bằng chứng khoa học vững chắc trong các tranh chấp về huyết thống.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu tần suất alen STR

Nghiên cứu tần suất alen STR trong giám định ADN các tộc người Việt Nam là một lĩnh vực đầy tiềm năng. Kết quả nghiên cứu không chỉ cung cấp thông tin quý giá cho khoa học hình sự mà còn góp phần vào việc bảo tồn di sản văn hóa. Trong tương lai, cần tiếp tục mở rộng nghiên cứu để bao quát nhiều tộc người hơn, từ đó xây dựng một cơ sở dữ liệu toàn diện về tần suất alen STR tại Việt Nam.

5.1. Triển vọng mở rộng nghiên cứu tần suất alen

Cần mở rộng nghiên cứu tần suất alen STR cho nhiều tộc người khác nhau tại Việt Nam. Việc này sẽ giúp tạo ra một bức tranh tổng thể về sự đa dạng di truyền trong cộng đồng. Các nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào các tộc người ít được nghiên cứu để đảm bảo tính toàn diện.

5.2. Ứng dụng công nghệ mới trong nghiên cứu

Sử dụng các công nghệ mới trong phân tích ADN sẽ giúp nâng cao độ chính xác và hiệu quả của nghiên cứu. Các phương pháp như giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) có thể được áp dụng để thu thập dữ liệu chi tiết hơn về tần suất alen, từ đó cải thiện chất lượng giám định ADN.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Tình hình tội phạm và các hành vi vi phạm pháp luật tại các địa bàn vùng sâu, vùng xa, vùng đồng bào tộc người thiểu số sinh sống có chiều hướng gia tăng cả về số lượng và mức độ nghiêm trọng, đặc biệt là các hành vi xâm hại nhân thân (giết người, cố ý gây thương tích, xâm hại tình dục) và tội phạm buôn bán, vận chuyển ma túy. Phân tích ADN là phương pháp khoa học phục vụ điều tra hình sự nhằm truy nguyên cá thể và xác định quan hệ huyết thống. Về phương diện sinh học phân tử, mỗi tộc người sở hữu những đặc trưng riêng thể hiện qua sự khác biệt về tần suất các alen của các locus đoạn ngắn lặp liên tiếp (Short Tandem Repeats - STR). Do đó, dữ liệu tần suất alen của tộc người này không thể áp dụng cho tộc người khác. Việc khảo sát tần suất alen hệ STR ở các tộc người tại Việt Nam là yêu cầu thực tiễn nhằm đảm bảo tính khách quan và chính xác cho công tác giám định pháp y.

Khoảng trống nghiên cứu được tác giả xác định: trước thời điểm nghiên cứu, tại Việt Nam chưa có công trình nào khảo sát tổng thể, toàn diện về tần suất các alen hệ STR bằng bộ kit AmpFlSTR® Identifiler® Plus trên các tộc người có dân số đông, phân bố phức tạp với cỡ mẫu đủ lớn và có tính đại diện cao trên phạm vi toàn quốc. Các dữ liệu trước đó chủ yếu thực hiện trên cỡ mẫu nhỏ của người Kinh hoặc nghiên cứu cục bộ từng địa phương bằng các bộ kit tự thiết kế nội bộ.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định gồm ba nội dung:

1. Xác định tần suất alen của 15 locus STR thuộc bộ kit AmpFlSTR® Identifiler® Plus gồm D8S1179, D21S11, D7S820, CSF1PO, D3S1358, TH01, D13S317, D16S539, D2S1338, D19S433, vWA, TPOX, D18S51, D5S818, FGA và một locus xác định giới tính Amelogenin (X, Y) của 9 tộc người có dân số đông tại Việt Nam (Kinh, Tày, Thái, Mường, Khmer, H’mông, Nùng, Hoa và Dao).
2. Đánh giá tính đặc trưng tần suất alen của 9 tộc người và xây dựng bảng tần suất alen của 15 locus STR đối với 9 tộc người này.
3. Xây dựng bảng tính ứng dụng trên phần mềm Microsoft Excel tích hợp dữ liệu tần suất alen để tính chỉ số truy nguyên cá thể và xác định quan hệ huyết thống trong giám định ADN hình sự.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Mẫu máu thu thập trên thẻ giấy FTA® card của 13.396 cá thể không có quan hệ huyết thống thuộc 9 tộc người tại Việt Nam, có lý lịch rõ ràng do lực lượng Công an và chính quyền địa phương quản lý.
• Phạm vi không gian: Trên địa bàn toàn quốc, phân bố tại các vùng địa lý tự nhiên và hành chính gồm Bắc Bộ (Tây Bắc, Đông Bắc, Đồng bằng sông Hồng), Trung Bộ (Bắc Trung Bộ, Nam Trung Bộ và Tây Nguyên) và Nam Bộ (Đông Nam Bộ, Tây Nam Bộ).
• Phạm vi thời gian: Nghiên cứu thực hiện trong giai đoạn 4 năm, từ tháng 01/2014 đến tháng 12/2017. Địa điểm thực nghiệm tại Trung tâm Giám định Sinh học thuộc Viện Khoa học hình sự (Bộ Công an) và Khoa Sinh học thuộc Trường Đại học Khoa học Tự nhiên (Đại học Quốc gia Hà Nội).

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Nhận dạng cá thể người bằng ADN bắt đầu từ năm 1985 khi Alec Jeffreys phát hiện các trình tự lặp lại minisatellite (VNTR), và đến năm 1987 chứng cứ ADN lần đầu tiên được chấp nhận tại tòa án Hoa Kỳ. Dự án Hệ gen người (Human Genome Project - HGP, 1990–2001) đã giải mã trọn vẹn bộ gen người, thúc đẩy việc khai thác các chỉ thị STR phục vụ nhận dạng cá thể và xác định huyết thống. Kỹ thuật STR ban đầu được phát triển tại phòng thí nghiệm của Thomas Laskey (Đại học Y khoa Baylor, Hoa Kỳ) và Trung tâm Khoa học hình sự Vương quốc Anh. Năm 1993, Hãng Promega thương mại hóa bộ kit CTT (3 locus CSF1PO, TPOX, TH01) sử dụng điện di nhuộm bạc với xác suất trùng lặp 1/500. Sau đó, các hệ kit huỳnh quang đa locus ra đời: Profiler Plus (2001), SEfiler (2002), Identifiler (2001), Identifiler Plus (2012), GlobalFiler (2013) của Hãng Applied Biosystems; PowerPlex 16, PowerPlex Fusion (2013) của Hãng Promega.

Trên thế giới, việc xây dựng cơ sở dữ liệu tần suất alen quần thể cho các hệ kit STR là quy định bắt buộc trong khoa học hình sự:

• Tại Hoa Kỳ: Cục Điều tra Liên bang (FBI) thiết lập cơ sở dữ liệu hệ CODIS 13 locus và mở rộng, phân tích tần suất trên các nhóm dân cư người Mỹ da trắng, người Mỹ gốc Phi, người Mỹ gốc Á, người Mỹ gốc Tây Ban Nha và Bồ Đào Nha.
• Tại Vương quốc Anh: Cơ quan Quản lý Khoa học Hình sự (FSR) do John Buckleton sáng lập đã chỉ đạo thiết lập cơ sở dữ liệu hệ DNA-17 cho 6 nhóm dân tộc lớn đại diện trên 98% dân số (Da trắng, Ấn Độ - Pakistan, Caribe, Trung Quốc, Trung Đông, châu Phi).
• Tại Liên bang Nga: Các nhà khoa học đã khảo sát tần suất 15 locus STR của bộ kit PowerPlex trên 17 quần thể thuộc 6 thành phố và 11 nhóm tộc người, phân chia cấu trúc di truyền thành nhóm Mongoloid (Khakas, Bashkir) và nhóm Slavic cùng các quần thể vùng Volga - Ural, Bắc Kavkaz.
• Tại Rumani: Nghiên cứu trên 1.331 cá thể tại thủ đô Bucharest đối với 15 locus thuộc hệ Investigator ESSplex Plus.
• Tại Ai Cập: Khảo sát 297 cá thể thuộc ba nhóm dân cư Berbers, Hồi giáo và Copts bằng bộ kit Identifiler.
• Tại khu vực châu Á: Singapore và Malaysia xây dựng cơ sở dữ liệu tần suất alen riêng biệt cho ba nhóm cư dân chính gồm người gốc Mã Lai, người gốc Hoa và người gốc Ấn Độ. Tại Trung Quốc, Yacheng Liu và cộng sự nghiên cứu trên người Hán tại Bắc Kinh (201 mẫu), Thiểm Tây (203 mẫu), Liêu Ninh (538 mẫu); Khoa Di truyền Pháp y thuộc Đại học Thẩm Dương nghiên cứu trên người Mãn Châu (150 mẫu), người Mãn, Mông Cổ, Kyrgyz, Uzbekistan; nghiên cứu trên 522 người gốc Việt tại tỉnh Vân Nam sử dụng bộ kit PowerPlex 21.
• Về quy chuẩn cỡ mẫu: Chakraborty (1992) cùng các nghiên cứu liên quan xác định cỡ mẫu từ 100 đến 150 cá thể cho mỗi quần thể là đủ độ tin cậy để thống kê các alen có tần suất dưới 1% trong khoa học hình sự. Hội đồng Viện Nghiên cứu Quốc gia Hoa Kỳ (NRC) khuyến nghị điều chỉnh tần suất alen thấp nhất bằng giá trị 5/2N (N là kích cỡ mẫu).

Tại Việt Nam, các nghiên cứu ban đầu được thực hiện bởi Nguyễn Văn Lợi (1998) trên các locus đơn lẻ; Nghiêm Xuân Dũng tối ưu hóa kit cho các locus D5S818, D7S820, D13S317; Hà Quốc Khanh nghiên cứu hệ NineplexII; Lê Đình Lương và cộng sự nghiên cứu các locus STR và VNTR. Viện Khoa học hình sự (2008) tiến hành khảo sát tần suất alen hệ Identifiler trên 170 cá thể người Kinh. Trần Trọng Hội và cộng sự khảo sát 15 locus STR trên người Khmer ở Sóc Trăng, người Mường ở Hòa Bình, người Kinh ở Hà Nội và Thành phố Hồ Chí Minh bằng bộ kit tự thiết kế nội bộ. Lê Thị Bích Trâm khảo sát trên 250 mẫu người Kinh.

Khoảng trống nghiên cứu mà luận án lựa chọn giải quyết là khắc phục tình trạng thiếu hụt dữ liệu quần thể diện rộng. Luận án là công trình đầu tiên tại Việt Nam phân tích tần suất alen của hệ chuẩn thương mại AmpFlSTR® Identifiler® Plus trên quy mô 13.396 mẫu, bao phủ toàn diện 9 tộc người chiếm đa số dân cư tại Việt Nam, phục vụ trực tiếp cho hoạt động giám định tư pháp hình sự.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án dựa trên lý thuyết di truyền học quần thể và toán học xác suất trong khoa học hình sự:

• Khái niệm đoạn ngắn lặp liên tiếp (STR): Là các đoạn ADN có đơn vị lặp lại từ 2 đến 6 cặp bazơ (bp), phân bố rải rác trên nhiễm sắc thể (NST). Bốn kiểu lặp STR gồm: lặp đơn giản (simple repeats), lặp phức (compound repeats), lặp phức tạp (complex repeats), và lặp siêu biến (complex hypervariable repeats). Ba tiêu chuẩn bắt buộc của locus STR dùng trong hình sự gồm: mức độ đa hình và tỷ lệ dị hợp tử cao (> 70%); kích thước phân tử ngắn (100–500 bp) để hạn chế đứt gãy và dễ khuếch đại bằng PCR; các locus phân ly độc lập, nằm trên các NST khác nhau.
• Tỷ số khả dĩ (Likelihood Ratio - LR): Đại lượng toán học đánh giá trọng số chứng cứ buộc tội theo công thức: $$LR = \frac{P(E|H_p)}{P(E|H_d)}$$ Trong đó $H_p$ là giả thuyết dấu vết thuộc về nghi phạm ($P(E|H_p) = 1$); $H_d$ là xác suất kiểu gen ngẫu nhiên xuất hiện trong quần thể dựa trên tần suất alen. Sự chênh lệch tần suất alen giữa các tộc người làm thay đổi đáng kể giá trị LR. Luận án lấy dẫn chứng locus D13S317 có kiểu gen dị hợp tử 12/13: ở người Mỹ gốc Phi tần suất alen 12 là 0,429 và alen 13 là 0,152 cho giá trị $LR = 7,66$; trong khi ở người Mỹ da trắng tần suất alen 12 là 0,283 và alen 13 là 0,104 cho giá trị $LR = 16,99$.
• Quy chuẩn alen: Alen phổ biến là alen có tần suất đạt từ 0,1 (10%) trở lên. Alen có tần suất thấp là các alen có tần suất nhỏ hơn 0,001 (0,1%) hoặc nhỏ hơn ngưỡng 5/2N theo quy ước của NRC.
• Các chỉ số đánh giá giá trị pháp y: Khả năng phân biệt (Power of Discrimination - PD), Khả năng loại trừ (Power of Exclusion - PE), Chỉ số quan hệ huyết thống cha con (Paternity Index - PI), Chỉ số xác định huyết thống cha con điển hình (Typical Paternity Index - TPI), cùng các chỉ số kết hợp gồm Combined PD (CPD) và Combined PE (CPE). Kiểm định trạng thái cân bằng di truyền Hardy-Weinberg (Hác đi - Van béc) được thực hiện bằng phương pháp kiểm định Chi-bình phương ($\chi^2$).
• Phương pháp phân tích phát sinh loài: Khoảng cách di truyền chuẩn của Nei (Genetic distance - D) và cây phân loại di truyền (Phylogenetic tree) được xây dựng bằng phần mềm POPTREE.

Phương pháp thực nghiệm và thu thập dữ liệu:

• Thu mẫu: Máu toàn phần được thu nhận trên thẻ giấy chuyên dụng FTA® card kèm trích ngang lý lịch cá nhân có xác nhận hành chính, phân loại theo 9 tộc người: Kinh (chia 3 miền Bắc, Trung, Nam), Tày, Thái, Mường, Khmer, H’mông, Nùng, Hoa và Dao. Đục lỗ mẫu máu khô bằng máy đục tự động BSD Punching.
• Tách chiết ADN: Sử dụng bộ kit PrepFiler™ Forensic DNA Extraction Kit (Hãng Applied Biosystems) kết hợp hệ thống robot tự động TECAN (Thụy Sỹ).
• Định lượng ADN: Sử dụng bộ kit Quantifiler™ Human DNA Quantification Kit trên hệ thống máy Real-time PCR ECO (Hãng Illumina, Hoa Kỳ).
• Nhân bản ADN (PCR): Thực hiện phản ứng PCR đa mồi (multiplex PCR) khuếch đại đồng thời 16 locus bằng bộ kit AmpFlSTR® Identifiler® Plus trên máy nhân bản gen PCR 9700 (Hãng Applied Biosystems).
• Điện di mao quản (Capillary Electrophoresis - CE): Sản phẩm PCR được điện di phát hiện huỳnh quang 5 màu (6-FAM, VIC, NED, PET và thang nội chuẩn LIZ 600) trên hệ thống máy giải trình tự tự động ABI Prism 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Thu thập dữ liệu và phân tích kiểu gen tự động bằng phần mềm GeneMapper® ID Software v3.2.
• Xây dựng phần mềm ứng dụng: Lập trình bảng tính tự động trên Microsoft Excel để tính toán xác suất trùng hợp ngẫu nhiên, chỉ số LR và chỉ số huyết thống cha con phục vụ thực tế giám định.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa cơ sở lý luận và tổng quan tình hình nghiên cứu gồm các nội dung chính:

• Lịch sử nhận dạng cá thể người bằng ADN, cấu trúc bộ gen người, các vùng đa hình lặp lại minisatellite và microsatellite (STR).
• Nguyên lý cấu tạo và hoạt động của bộ kit AmpFlSTR® Identifiler® Plus gồm 15 locus STR (D8S1179, D21S11, D7S820, CSF1PO, D3S1358, TH01, D13S317, D16S539, D2S1338, D19S433, vWA, TPOX, D18S51, D5S818, FGA) và locus xác định giới tính Amelogenin.
• Cơ sở toán học của tỷ số khả dĩ (LR), ý nghĩa của alen có tần suất thấp và alen phổ biến trong truy nguyên cá thể hình sự.
• Các kỹ thuật tách chiết ADN (phương pháp hữu cơ phenol/chloroform, phương pháp hạt nhựa Chelex, tách chiết trên giấy FTA, tách chiết vi sóng, cột ly tâm PrepFiler), phương pháp định lượng bằng Real-time PCR, kỹ thuật PCR đa mồi và điện di mao quản.
• Phân bố địa lý của 7 vùng lãnh thổ và đặc điểm dân số, nhân khẩu học của 9 tộc người được lựa chọn tại Việt Nam theo số liệu Tổng điều tra dân số và nhà ở năm 2009:
  • Tộc người Kinh: 73.594.427 người, chiếm 86,2% dân số cả nước.
  • Tộc người Tày: 1.626.392 người, đứng thứ hai về dân số.
  • Tộc người Thái: 1.550.423 người, đứng thứ ba về dân số.
  • Tộc người Mường: 1.268.306 người, đứng thứ tư về dân số.
  • Tộc người Khmer: 1.259.282 người, đứng thứ năm về dân số.
  • Tộc người H’mông: 1.068.189 người, đứng thứ sáu về dân số.
  • Tộc người Nùng: 968.800 người, đứng thứ bảy về dân số.
  • Tộc người Hoa: 823.071 người, đứng thứ tám về dân số.
  • Tộc người Dao: 751.067 người, đứng thứ chín về dân số.
• Đánh giá tổng quan các công trình nghiên cứu tần suất STR trên thế giới (Hoa Kỳ, Anh, Rumani, Nga, Ai Cập, Singapore, Malaysia, Trung Quốc) và các nghiên cứu tại Việt Nam (Viện Khoa học hình sự, Đề tài cấp Bộ Công an). Xác định nguyên tắc chọn cỡ mẫu đại diện tối thiểu từ 100 đến 150 cá thể cho mỗi quần thể nghiên cứu.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết vật liệu, trang thiết bị và quy trình thực nghiệm:

• Đối tượng: Thu thập mẫu máu trên thẻ FTA card từ 13.396 cá thể không có quan hệ huyết thống thuộc 9 tộc người tại các địa bàn đại diện.
• Danh mục hóa chất và thiết bị: Thẻ thu mẫu FTA® card và FTA® purification kit; bộ kit tách chiết PrepFiler™; kit định lượng Quantifiler™; kit khuếch đại AmpFlSTR® Identifiler® Plus; máy đục tự động BSD Punching; hệ thống robot TECAN; máy PCR 9700; máy Real-time PCR ECO Illumina; máy điện di mao quản ABI 3130xl; hệ thống máy chủ IBM và HP.
• Địa điểm và thời gian: Thực hiện từ tháng 01/2014 đến tháng 12/2017 tại Trung tâm Giám định Sinh học (Viện Khoa học hình sự) và Khoa Sinh học (Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội).
• Quy trình thực nghiệm chuẩn hóa qua các bước: thu thập mẫu máu trên giấy FTA -> đục lỗ mẫu -> tách chiết ADN -> định lượng nồng độ ADN khuôn -> phản ứng PCR đa mồi 16 locus -> điện di mao quản CE -> phân tích kiểu gen bằng phần mềm GeneMapper ID -> thống kê tần suất alen -> kiểm định cân bằng Hardy-Weinberg ($\chi^2$) -> tính toán các chỉ số hình sự (PD, PE, PI, CPD, CPE) -> tính khoảng cách di truyền Nei và xây dựng cây phát sinh loài bằng phần mềm POPTREE -> lập bảng tính ứng dụng trên Excel.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm và thảo luận chuyên sâu:

• Phân bố số lượng mẫu thu thập thực tế của 9 tộc người: Tất cả các nhóm đều đạt quy mô trên 150 cá thể, riêng người Kinh được phân bố tại ba miền Bắc, Trung, Nam.
• Kết quả định lượng và phân tích hồ sơ ADN: Nồng độ ADN tách chiết từ giấy FTA đạt tiêu chuẩn cho phản ứng PCR huỳnh quang, các tín hiệu đỉnh huỳnh quang điện di (electropherogram) rõ nét, không bị nhiễu nền hoặc hiện tượng tắt alen (allelic drop-out).
• Thống kê số lượng và tần suất alen tại 15 locus STR: Xác định toàn bộ phổ alen xuất hiện ở 9 tộc người. Phân tích chi tiết sự phân bố alen tại từng locus cụ thể (D8S1179, D21S11, D7S820, CSF1PO, D3S1358, TH01, D13S317, D16S539, D2S1338, D19S433, vWA, TPOX, D18S51, D5S818, FGA).
• Phát hiện các alen đặc trưng và alen có tần suất thấp: Xác định được 54 alen có tần suất thấp chưa có trong thang alen chuẩn quốc tế (allelic ladder) của bộ kit AmpFlSTR Identifiler Plus xuất hiện trên các tộc người nghiên cứu. Các alen đặc trưng này được thống kê chi tiết theo từng tộc người (như alen 19 của locus D16S539, alen 8 của locus vWA, alen 10.2 của locus CSF1PO ở người Kinh, alen 14 và 15 của locus TPOX, alen 23 của locus D5S818, alen 19 của locus D8S1179, alen 19 của locus D21S11, alen 16 của locus D13S317, alen 17 của locus D19S433, alen 7 của locus D3S1358).
• Đánh giá các chỉ số pháp y: Tính toán chi tiết các chỉ số PD, PE, PI cho từng locus ở từng tộc người và tổng hợp thành các chỉ số kết hợp CPD, CPE.
  • Các locus có khả năng phân biệt cao nhất ở người Việt Nam gồm: FGA, D2S1338, D18S51, D8S1179, D19S433.
  • Các locus có khả năng phân biệt thấp gồm: TPOX, CSF1PO, TH01, D3S1358 (do số lượng alen ít và tỷ lệ alen phổ biến chiếm ưu thế áp đảo).
  • Giá trị CPD trên toàn bộ 15 locus ở các tộc người đều đạt ngưỡng trên $0,9999999999$ và CPE đạt trên $0,9999$, đáp ứng tiêu chuẩn giám định hình sự quốc tế.
• Phân tích khoảng cách di truyền và cây phân loại di truyền (POPTREE):
  • Người Kinh ba miền (Bắc, Trung, Nam) có khoảng cách di truyền rất gần gũi, tạo thành một cụm đồng nhất.
  • Tộc người Mường, Tày, Nùng hợp thành một nhóm có quan hệ di truyền gần với người Kinh.
  • Tộc người Hoa, Thái và Khmer có khoảng cách di truyền xa hơn so với cụm Kinh - Mường - Tày - Nùng.
  • Tộc người H’mông và tộc người Dao tách biệt hoàn toàn thành hai nhánh độc lập, có khoảng cách di truyền khác biệt lớn so với các tộc người còn lại và khác biệt lẫn nhau.
• Xây dựng công cụ ứng dụng: Thiết lập thành công Bảng tính Excel tự động hóa việc tính toán tỷ số khả dĩ (LR), xác suất ngẫu nhiên và chỉ số huyết thống (PI), kiểm chứng qua các ví dụ giám định thực tế tại Viện Khoa học hình sự.

Bảng tổng hợp đặc tính các locus STR chính trong bộ kit AmpFlSTR® Identifiler® Plus được phân tích trong luận án:

Tên Locus STR	Nhiễm sắc thể	Chất nhuộm huỳnh quang	Dải alen trong thang chuẩn (Allelic Ladder)	Đánh giá hiệu quả truy nguyên cá thể tại Việt Nam
D8S1179	8	6-FAM	8 - 19	Cao
D21S11	21q21	6-FAM	24 - 38	Cao
D7S820	7q11.21-22	6-FAM	6 - 15	Trung bình
CSF1PO	5q33.3-34	6-FAM	6 - 15	Thấp
D3S1358	3p	VIC	12 - 19	Thấp
TH01	11p15.5	VIC	4 - 13.3	Thấp
D13S317	13q22-31	VIC	8 - 15	Trung bình
D16S539	16q24-qter	VIC	5 - 15	Trung bình
D2S1338	2q35-37.1	VIC	15 - 28	Cao
D19S433	19q12-13.1	NED	9 - 17.2	Cao
vWA	12p12-pter	NED	11 - 24	Trung bình
TPOX	2p23-2per	NED	6 - 13	Thấp
D18S51	18q21.3	NED	7 - 27	Cao
D5S818	5q21-31	PET	7 - 16	Trung bình
FGA	4q28	PET	17 - 51.2	Cao
Amelogenin	X, Y	PET	X, Y	Xác định giới tính

Kết quả và những đóng góp mới

Các đóng góp mới về mặt lý luận và khoa học di truyền được luận án xác định:

• Là công trình đầu tiên tại Việt Nam thu thập và phân tích hồ sơ ADN bằng bộ kit chuẩn AmpFlSTR® Identifiler® Plus trên 13.396 mẫu máu cá thể không có quan hệ huyết thống thuộc 9 tộc người có dân số đông nhất sinh sống trên lãnh thổ Việt Nam.
• Thiết lập bảng tần suất alen của 15 locus STR đạt độ tin cậy và tính đại diện quần thể cao, đáp ứng đầy đủ điều kiện pháp lý và khoa học để áp dụng trong công tác giám định tư pháp hình sự.
• Phát hiện 54 alen có tần suất thấp hiện chưa có trong thang alen chuẩn quốc tế (allelic ladder) trên các locus STR ở các tộc người nghiên cứu.
• Xác định cấu trúc quan hệ di truyền giữa các tộc người Việt Nam dựa trên khoảng cách di truyền Nei và cây phân loại di truyền (POPTREE):
  • Người Kinh ở ba miền Bắc, Trung, Nam có quan hệ di truyền rất gần gũi, cho phép sử dụng chung bảng tần suất alen người Kinh trong tính toán truy nguyên cá thể và xác định huyết thống.
  • Các tộc người Mường, Tày, Nùng tạo thành một nhóm có quan hệ di truyền gần với người Kinh.
  • Tộc người Hoa, Thái và Khmer có khoảng cách di truyền xa hơn đối với nhóm người Kinh.
  • Tộc người H’mông và Dao tách thành hai nhóm riêng biệt, có sự khác biệt di truyền rõ nét với nhau và khác biệt với toàn bộ các tộc người còn lại.
• Xác định mức độ hiệu quả của từng locus STR trong nhận dạng cá thể người Việt Nam:
  • Nhóm locus có hiệu quả cao: FGA, D2S1338, D18S51, D8S1179, D19S433.
  • Nhóm locus có hiệu quả thấp: TPOX, CSF1PO, TH01, D3S1358.
• Xây dựng thành công phần mềm Bảng tính Excel phục vụ tính toán các chỉ số truy nguyên cá thể (LR, CPD) và chỉ số quan hệ huyết thống (PI, CPE), bước đầu chuyển giao và áp dụng trực tiếp vào thực tế công tác giám định ADN hình sự.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất từ kết quả nghiên cứu:

• Đưa bảng tần suất alen 15 locus STR của 9 tộc người vào sử dụng chính thức trong hệ thống các phòng thí nghiệm giám định sinh học pháp y trên cả nước (Viện Khoa học hình sự - Bộ Công an, Viện Pháp y Quân đội - Bộ Quốc phòng, Viện Pháp y Quốc gia - Bộ Y tế).
• Khi tiến hành giám định các vụ án hình sự hoặc xác định huyết thống liên quan đến đối tượng thuộc các tộc người thiểu số (như H’mông, Dao, Thái, Khmer...), bắt buộc phải áp dụng bảng tần suất alen riêng biệt của chính tộc người đó để tính toán tỷ số khả dĩ (LR) và xác suất trùng khớp, tránh sai số do việc áp dụng dữ liệu của người Kinh.
• Trong trường hợp mẫu sinh học bị biến tính hoặc đứt gãy chỉ phân tích được một số locus đơn lẻ, ưu tiên lựa chọn và sử dụng các locus có hiệu quả phân biệt cao (FGA, D2S1338, D18S51, D8S1179, D19S433) để đưa ra kết luận giám định.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của luận án:

• Nghiên cứu mới khảo sát trên 9 tộc người có dân số đông nhất tại Việt Nam, chưa bao quát hết 54 thành phần tộc người trên cả nước; các tộc người có quy mô dân số rất ít (như Brâu, Rơ Măm, Ơ Đu...) chưa được thu thập mẫu để khảo sát tần suất alen.
• Phạm vi nghiên cứu giới hạn ở 15 locus STR trên nhiễm sắc thể thường và locus giới tính Amelogenin thuộc bộ kit thương mại AmpFlSTR® Identifiler® Plus; chưa mở rộng sang các hệ kit nhận dạng thế hệ mới có 21 đến 24 locus STR (như GlobalFiler, PowerPlex Fusion) cũng như các hệ chỉ thị di truyền trên nhiễm sắc thể giới tính nam (Y-STR) hoặc ADN ty thể (mtDNA).

Hướng nghiên cứu tiếp theo:

• Mở rộng thu thập mẫu và nghiên cứu đặc trưng tần suất alen STR đối với các tộc người thiểu số có quy mô dân số nhỏ, sinh sống biệt lập tại khu vực Tây Bắc, Tây Nguyên và Tây Nam Bộ.
• Nghiên cứu cập nhật tần suất alen trên các hệ kit nhận dạng cá thể mở rộng có số lượng locus lớn hơn (21–24 locus) và các hệ đa hình đơn nucleotit (SNP) nhằm phục vụ các trường hợp mẫu dấu vết sinh học bị phân hủy nặng.
• Kết hợp nghiên cứu các chỉ thị Y-STR và dòng mẹ mtDNA trên các tộc người này để phục vụ toàn diện công tác truy nguyên dòng họ và nhân chủng học phân tử.

Giá trị tham khảo

Giá trị tham khảo đối với các nhóm đối tượng học thuật và thực tiễn:

• Cán bộ giám định sinh học pháp y, giám định viên kỹ thuật hình sự tại Viện Khoa học hình sự (Bộ Công an), Phòng Kỹ thuật hình sự Công an các tỉnh/thành phố, các viện pháp y thuộc Bộ Y tế và Bộ Quốc phòng: Luận án cung cấp cơ sở dữ liệu số liệu gốc về tần suất alen 15 locus STR của 9 tộc người, giúp việc tính toán xác suất buộc tội (tỷ số khả dĩ LR) và xác định quan hệ huyết thống đạt độ chuẩn xác cao.
• Cơ quan điều tra, Viện Kiểm sát, Tòa án nhân dân các cấp: Cung cấp căn cứ khoa học vững chắc để đánh giá tính hợp pháp, tính khách quan của kết luận giám định ADN khi giải quyết các vụ án hình sự xảy ra tại các địa bàn có đồng bào tộc người thiểu số sinh sống.
• Giảng viên, nghiên cứu sinh, học viên cao học chuyên ngành Hóa sinh học, Di truyền học, Sinh học phân tử, Khoa học hình sự và Nhân chủng học: Là tài liệu chuyên khảo tham khảo về phương pháp thu thập mẫu diện rộng, quy trình chuẩn hóa PCR đa mồi, điện di mao quản, kiểm định thống kê di truyền quần thể và ứng dụng phần mềm POPTREE phân tích khoảng cách di truyền.

Nội dung đáng tham khảo nhất trong luận án gồm:

• Bảng dữ liệu tần suất alen của 15 locus STR trên 9 tộc người Việt Nam.
• Danh mục 54 alen có tần suất thấp chưa có trong thang alen chuẩn quốc tế.
• Bảng tính Excel tự động tính toán chỉ số truy nguyên cá thể và huyết thống cha con.

Câu hỏi thường gặp

1. Bộ kit AmpFlSTR® Identifiler® Plus khuếch đại đồng thời bao nhiêu locus và gồm những locus cụ thể nào? Bộ kit khuếch đại đồng thời 16 locus gồm 15 locus STR trên nhiễm sắc thể thường (D8S1179, D21S11, D7S820, CSF1PO, D3S1358, TH01, D13S317, D16S539, D2S1338, D19S433, vWA, TPOX, D18S51, D5S818, FGA) và 1 locus xác định giới tính Amelogenin (X, Y).

2. Quy mô mẫu nghiên cứu thực tế của luận án là bao nhiêu cá thể và gồm những tộc người nào? Nghiên cứu được thực hiện trên tổng số 13.396 mẫu máu của các cá thể không có quan hệ huyết thống, thuộc 9 tộc người có dân số đông nhất tại Việt Nam gồm: Kinh, Tày, Thái, Mường, Khmer, H’mông, Nùng, Hoa và Dao.

3. Mối quan hệ di truyền giữa người Kinh ở ba miền và các tộc người khác được xác định như thế nào trong luận án? Kết quả tính khoảng cách di truyền Nei và cây phân loại di truyền (POPTREE) cho thấy: người Kinh ở ba miền Bắc, Trung, Nam có quan hệ di truyền rất gần gũi và tạo thành một cụm; nhóm tộc người Mường, Tày, Nùng có quan hệ gần với người Kinh; nhóm tộc người Hoa, Thái, Khmer có khoảng cách xa hơn; riêng tộc người H’mông và Dao tách biệt thành hai nhóm độc lập, khác biệt rõ rệt với nhau và với các tộc người còn lại.

4. Những locus STR nào có hiệu quả truy nguyên cá thể cao nhất và thấp nhất đối với quần thể người tại Việt Nam? Các locus có hiệu quả truy nguyên cá thể cao nhất gồm FGA, D2S1338, D18S51, D8S1179, D19S433. Các locus có hiệu quả phân biệt thấp nhất gồm TPOX, CSF1PO, TH01, D3S1358.

5. Luận án đã phát hiện bao nhiêu alen có tần suất thấp chưa có trong thang chuẩn quốc tế và ý nghĩa của phát hiện này là gì? Luận án phát hiện 54 alen có tần suất thấp chưa có trong thang alen chuẩn quốc tế (allelic ladder) của bộ kit AmpFlSTR Identifiler Plus trên các tộc người nghiên cứu. Việc xác định các alen này giúp các phòng thí nghiệm không bị nhầm lẫn khi đọc kết quả điện di và nâng cao giá trị bằng chứng truy nguyên cá thể trong các vụ án hình sự.

Kết luận

Luận án của tác giả Trịnh Tuấn Toàn là công trình nghiên cứu di truyền học quần thể hình sự quy mô lớn tại Việt Nam, đã phân tích thành công hồ sơ ADN của 13.396 cá thể thuộc 9 tộc người đông dân nhất bằng bộ kit chuẩn AmpFlSTR® Identifiler® Plus. Công trình đã xây dựng được bảng tần suất alen của 15 locus STR, phát hiện 54 alen tần suất thấp nằm ngoài thang chuẩn quốc tế và làm sáng tỏ cấu trúc khoảng cách di truyền giữa các tộc người. Kết quả nghiên cứu cùng bộ công cụ bảng tính Excel đã được ứng dụng trực tiếp vào công tác giám định tư pháp hình sự và xác định huyết thống tại Viện Khoa học hình sự, góp phần nâng cao tính chính xác và khách quan của chứng cứ khoa học kỹ thuật.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Vào những năm đầu thế kỷ XXI, các nhà khoa học đã thành công trong giải mã toàn bộ hệ gen của người, việc giải mã hệ gen của người, nghiên cứu ở mức độ phân tử nhằm hiểu rõ hơn, làm sáng tỏ nhiều vấn đề liên quan tới các nghiên cứu của các nhà khoa học mà trước đây chưa giải quyết được, đặc biệt có ý nghĩa về ứng dụng trong y học liên quan đến sức khỏe, phòng và điều trị bệnh và ứng dụng vào các lĩnh vực khoa học khác. Việc ứng dụng những tiến bộ khoa học kỹ thuật vào sản xuất và phục vụ đời sống con người đã được áp dụng từ rất sớm. Trong đời sống xã hội, bên cạnh sự phát triển và tiến bộ của toàn xã hội thì mặt trái, mặt tiêu cực như tình hình tội phạm và các hành vi vi phạm pháp luật khác có xu hướng phát triển và ngày càng tinh vi hơn đòi hỏi lực lượng đấu tranh phòng, chống tội phạm cần có những công cụ có hiệu quả để bảo vệ và giữ vững an ninh chính trị và trật tự an toàn xã hội. Một trong những ứng dụng tiến bộ khoa học, kỹ thuật trong điều tra tội phạm là kỹ thuật phân tích ADN.

Kỹ thuật này có tính ứng dụng cao trong việc điều tra phá án, bởi nó cho phép truy nguyên cá thể người với độ chính xác cao hơn nhiều so với các phương pháp nhận dạng hoặc phân tích truyền thống. Dấu vết sinh học, tế bào trong đó có ADN thu được ở hiện trường của các vụ án thường là rất ít hoặc bị biến tính, phân hủy nhưng lại là chứng cứ quan trọng giúp truy tìm thủ phạm của vụ án hoặc xác định tung tích nạn nhân chính xác, khách quan, đồng thời nó cũng là phương pháp quan trọng trong việc xác định quan hệ huyết thống cha, mẹ - con, xác định mối quan hệ anh - em, dòng tộc. Tính cấp thiết của đề tài luận án Thống kê của Bộ Công an trong thời gian gần đây cho thấy, tình trạng vi phạm pháp luật trong vùng đồng bào tộc người thiểu số ở địa bàn miền núi, vùng xa có chiều hướng gia tăng cả về số lượng và mức độ nghiêm trọng. Trong các vụ phạm pháp hình sự, những vụ việc xâm hại về nhân thân như xâm hại tình dục, giết người, cố ý gây thương tích ngày càng xảy ra nhiều, có những vụ án có tính 10 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] chất đặc biệt nghiêm trọng.

Thời gian qua đã xảy ra một số vụ thảm án mà đối tượng là người thuộc các tộc người có dân số ít trên lãnh thổ Việt Nam. Đặc biệt nổi lên là tình hình tội phạm buôn bán, vận chuyển trái phép chất ma túy tại các địa bàn vùng sâu, vùng xa, là địa bàn của tộc người thiểu số sinh sống có xu hướng tăng đột biến và diễn biến phức tạp, kéo theo nhiều tội phạm hình sự khác ngày một gia tăng [12]. Mỗi tộc người đều có những đặc trưng sinh học nhất định, trong đó ở mức ADN trong các locus STR được thể hiện bằng sự khác nhau về tần suất các alen đối với mỗi tộc người vì vậy, không thể áp dụng cơ sở dữ liệu của tộc người này cho một tộc người khác. Do đó, đối với mỗi tộc người, để đảm bảo tính khoa học, tính chính xác và khách quan trong kết luận giám định, cần thiết phải tiến hành khảo sát tần suất các alen của các locus STR, dùng trong giám định ADN hình sự.