Khảo sát và xây dựng cơ sở dữ liệu tần suất alen ở 15 locus gen từ quần thể người dân tộc Nùng

Luận văn thạc sĩ khảo sát và xây dựng cơ sở dữ liệu tần suất alen ở 15 locus gen, ứng dụng trong giám định ADN cho người dân tộc Nùng.

• Tác giả: Lương Thị Phúc
• Người hướng dẫn: PGS, TS. Nguyễn Văn Hà
• Trường học: Viện Sinh Thái Và Tài Nguyên Sinh Vật
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Khảo sát và xây dựng cơ sở dữ liệu tần suất các alen ở 15 locus gen bằng hệ identifiler từ quần thể người dân tộc Nùng ứng dụng trong giám định ADN
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sỹ
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Các phương pháp truy nguyên cá thể dùng trong Khoa học hình sự
• 1.2. Mười lăm (15) locus gen hệ Identifiler trên các nhiễm sắc thể
• 1.2.1. Các tiêu chuẩn cho locus STR dùng trong giám định ADN
• 1.2.2. Ý nghĩa của cơ sở dữ liệu tần suất alen của các locus STR
• 1.2.3. Cơ sở khoa học và thực tiễn của việc nghiên cứu đề tài
• 1.2.4. Tình hình nghiên cứu và phát triển các bộ kit dùng trong giám định ADN nhân tế bào
• 1.2.5. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
• 1.2.6. Tình hình nghiên cứu trong nước
• 1.2.7. Dân tộc Nùng sinh sống trên lãnh thổ Việt Nam
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu nghiên cứu
• 2.2. Đối tượng nghiên cứu
• 2.3. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ nghiên cứu
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5. Quy trình phân tích ADN
• 2.6. Xử lý thống kê số liệu và tính tần suất các locus gen
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Phân tích kiểu gen của 15 locus gen từ 120 mẫu thu thập
• 3.2. Kết quả thu, bảo quản mẫu và tách chiết ADN
• 3.3. Kết quả thực hiện phản ứng PCR, điện di và phân tích kiểu gen
• 3.4. Tính tần suất của 15 locus gen từ 120 mẫu thu thập được
• 3.5. Kết quả tính tần suất các alen
• 3.6. So sánh chỉ số kiểm định χ2 giữa tính toán (χ2tt) với lý thuyết (χ2lt) và đánh giá sự phù hợp với định luật Hardy - Weinberg
• 3.7. So sánh tần suất alen của người Nùng với một số dân tộc
• 3.8. Một số ví dụ về ứng dụng kết quả của đề tài trong công tác giám định ADN tại Viện Khoa học hình sự - Bộ Công an
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan về khảo sát tần suất alen ở người dân tộc Nùng

Khảo sát tần suất alen ở 15 locus gen từ người dân tộc Nùng là một nghiên cứu quan trọng trong lĩnh vực giám định ADN. Nghiên cứu này không chỉ giúp xác định các đặc điểm di truyền của quần thể mà còn cung cấp dữ liệu cần thiết cho các vụ án hình sự. Việc hiểu rõ về tần suất alen sẽ hỗ trợ trong việc xác định mối quan hệ huyết thống và truy nguyên cá thể.

1.1. Ý nghĩa của việc khảo sát tần suất alen

Khảo sát tần suất alen giúp xác định các đặc điểm di truyền của người dân tộc Nùng. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc giám định ADN, đặc biệt là trong các vụ án hình sự. Dữ liệu này sẽ cung cấp cơ sở khoa học cho các kết luận giám định.

1.2. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Nghiên cứu tập trung vào 120 cá thể người Nùng không có quan hệ họ hàng. Các mẫu được thu thập từ nhiều tỉnh khác nhau, đảm bảo tính đại diện cho quần thể. Điều này giúp tăng độ tin cậy của kết quả nghiên cứu.

II. Vấn đề và thách thức trong khảo sát tần suất alen

Khảo sát tần suất alen đối với người dân tộc Nùng gặp nhiều thách thức. Một trong những vấn đề chính là thiếu dữ liệu di truyền từ các quần thể khác. Điều này làm khó khăn trong việc so sánh và phân tích. Ngoài ra, việc thu thập mẫu từ các cá thể không có quan hệ huyết thống cũng là một thách thức lớn.

2.1. Thiếu dữ liệu di truyền

Việc thiếu dữ liệu di truyền từ các quần thể khác làm khó khăn trong việc xác định tần suất alen. Điều này có thể dẫn đến những sai sót trong kết luận giám định ADN.

2.2. Khó khăn trong thu thập mẫu

Thu thập mẫu từ các cá thể không có quan hệ huyết thống là một thách thức lớn. Điều này đòi hỏi sự cẩn thận và chính xác trong quá trình thu thập để đảm bảo tính đại diện.

III. Phương pháp khảo sát tần suất alen hiệu quả

Để khảo sát tần suất alen, nghiên cứu sử dụng các phương pháp hiện đại như PCR và điện di. Các phương pháp này giúp xác định chính xác tần suất của từng alen tại các locus gen. Việc áp dụng công nghệ tiên tiến đảm bảo độ tin cậy và chính xác của kết quả.

3.1. Phương pháp PCR trong nghiên cứu

Phương pháp PCR được sử dụng để nhân bản ADN từ các mẫu thu thập. Điều này giúp tăng cường số lượng ADN cần thiết cho phân tích, đảm bảo độ chính xác cao trong kết quả.

3.2. Điện di và phân tích kết quả

Điện di được sử dụng để phân tách các sản phẩm PCR. Phân tích kết quả giúp xác định tần suất alen tại các locus gen, từ đó cung cấp dữ liệu cho giám định ADN.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả khảo sát tần suất alen từ người dân tộc Nùng đã cung cấp dữ liệu quý giá cho giám định ADN. Những thông tin này không chỉ hỗ trợ trong các vụ án hình sự mà còn có thể được áp dụng trong nghiên cứu di truyền học. Việc xây dựng cơ sở dữ liệu tần suất alen sẽ giúp nâng cao độ chính xác trong giám định ADN.

4.1. Kết quả tần suất alen

Kết quả khảo sát cho thấy tần suất alen tại các locus gen có sự khác biệt rõ rệt. Điều này cho thấy tính đa dạng di truyền trong quần thể người Nùng.

4.2. Ứng dụng trong giám định ADN

Dữ liệu tần suất alen sẽ được sử dụng trong các vụ án hình sự để xác định mối quan hệ huyết thống và truy nguyên cá thể. Điều này giúp nâng cao tính chính xác trong kết luận giám định.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Khảo sát tần suất alen ở người dân tộc Nùng là một nghiên cứu cần thiết và có ý nghĩa quan trọng. Kết quả nghiên cứu không chỉ cung cấp dữ liệu cho giám định ADN mà còn mở ra hướng đi mới cho các nghiên cứu di truyền học trong tương lai. Việc tiếp tục nghiên cứu và mở rộng cơ sở dữ liệu sẽ giúp nâng cao độ chính xác trong giám định ADN.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu

Nghiên cứu này đóng góp vào việc xây dựng cơ sở dữ liệu tần suất alen cho người dân tộc Nùng. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc nâng cao độ chính xác trong giám định ADN.

5.2. Hướng nghiên cứu trong tương lai

Tiếp tục mở rộng nghiên cứu tần suất alen cho các dân tộc khác tại Việt Nam. Điều này sẽ giúp xây dựng một cơ sở dữ liệu toàn diện cho giám định ADN trong nước.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1: Tổng quan tài liệu 4 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết quả nghiên cứu và bàn luận Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Các phƣơng pháp truy nguyên cá thể dùng trong Khoa học hình sự Có nhiều phương pháp được sử dụng để xác định cá thể người như: - Nhận biết qua vân tay, tiếng nói. - Nhận biết bằng các yếu tố huyết thanh như: xác định các nhóm kháng nguyên hồng cầu (nhóm máu), xác định một số yếu tố protein trong huyết thanh, xác định một số enzym, nhưng khả năng phân biệt còn thấp. Phƣơng pháp phân tích ADN để xác định cá thể Những năm cuối thế kỷ 20, đặc biệt là thập kỷ 80, 90 các nhà khoa học hình sự ứng dụng công nghệ gen (DNA- Technology) vào trong xác định tội phạm.

Trong nhân tế bào người (tế bào lưỡng bội) có 46 nhiễm sắc thể (NST) được xếp thành 23 cặp đồng dạng: 22 cặp nhiễm sắc thể thường và một cặp nhiễm sắc thể giới tính. Riêng tế bào trứng và tinh trùng có 23 nhiễm sắc thể (tế bào đơn bội). Thế hệ con cái, thông thường nhận từ mẹ 23 nhiễm sắc thể thông qua tế bào trứng và 23 nhiễm sắc thể từ cha thông qua tế bào tinh trùng. Sự kết hợp giữa trứng và tinh trùng đã duy trì được số lượng nhiễm sắc thể trong tế bào thường là 46.

Bộ nhiễm sắc thể được bảo tồn và truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác và mang tính đặc trưng cho người [25, 27]. Năm 1984 Alec Jeffreys và các cộng sự ở trường đại học Leicester (Anh) khi nghiên cứu các đoạn ADN mã hoá cho myoglobin trong máu người đã phát hiện ra trình tự của các bazơnitơ được lặp lại một số lần với chiều dài đoạn lặp từ 10-15 bp (base pair), các đoạn lặp này được gọi là tiểu vệ tinh 5 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Ông cũng phân lập được hai đoạn và nhân bội chúng, sử dụng làm mẫu dò (probe) để phát hiện những vùng mà Jeffreys gọi là vùng siêu biến (hypervariable region) ở các vật liệu di truyền khác nhau [25]. Đây được coi là bước ngoặt lớn trong lịch sử phát triển của Khoa học hình sự thế giới nói chung và Sinh học pháp lý nói riêng.

Các tiểu vệ tinh được phát hiện thấy trong mọi tế bào và ở những vị trí khác nhau trong hệ gen người. Điều đáng chú ý là số lần lặp lại các đoạn lặp này ở các cá thể khác nhau thì khác nhau. Alec Jeffreys coi đây là đặc điểm rất quan trọng để phân biệt sự khác nhau giữa các cá thể (truy nguyên cá thể). Giám định ADN cho mục đích tư pháp ra đời từ đây.

Giám định ADN ra đời không chỉ khắc phục được những hạn chế của các phương pháp huyết thanh học mà còn giải quyết được những vụ án bế tắc trước đây- những vụ án mà ADN là bằng chứng duy nhất. Tính ưu việt của giám định ADN là truy nguyên được cá thể người, xác định quan hệ huyết thống cha - mẹ - con, xác định hài cốt. Tháng 10 năm 1990, tại Mỹ, Dự án hệ gen người (Human Genome Project-HGP) chính thức được bắt đầu. Đến ngày 12 tháng 02 năm 2001, HGP và Celera đã công bố trình tự đầy đủ của hệ gen người - một sự kiện trọng đại trong sự phát triển của sinh học phân tử nói chung và trong việc nghiên cứu gen người nói riêng.

Theo công bố này, số lượng gen trong bộ gen người có khoảng 35 000 gen, trong đó có hàng chục gen được nghiên cứu ứng dụng để xác định huyết thống và truy nguyên cá thể [25]. Cũng như ADN ở sinh vật nhân chuẩn khác, ADN nhân ở người gồm những trình tự mã hoá (các exon) xen kẽ với những trình tự không mã hoá (các intron) [10, 12]. Tuỳ mức độ hiện diện của chúng trong nhân, các trình tự ADN được chia làm 3 loại: 6 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] - Các trình tự duy nhất: là các gen mã hoá cho các protein có trình tự đặc trưng cho từng gen. - Các trình tự có số lần lặp lại trung bình: chiếm khoảng 25- 40% bộ gen người, chúng có kích thước từ 100-1000 kb, đa dạng hơn các trình tự lặp lại nhiều lần.

Các trình tự này không tập trung mà phân tán trên toàn bộ hệ gen. Chúng có thể là những trình tự không mã hoá với chức năng chưa rõ hoặc còng cã thÓ lµ nh÷ng tr×nh tù m· ho¸ (c¸c gen m· ho¸ cho ARN riboxom, ARN vËn chuyÓn. - Các trình tự lặp lại nhiều lần: Chiếm 10-15% bộ gen. Đó là những trình tự ADN ngắn (10-200 kb), không mã hoá, thường tập trung ở những vùng chuyên biệt trên nhiễm sắc thể (vùng tâm động, vùng đầu nhiễm sắc thể).

Các gen được sử dụng trong giám định hình sự là các gen nằm ở vùng không mã hoá (intron) của ADN. Ở giai đoạn phát triển đầu tiên của giám định gen, người ta áp dụng các kỹ thuật phân tích các gen có đoạn lặp trung bình (Variable Number of Tandem Repeat-VNTR hay Minisatellite). Nhưng những kỹ thuật này chỉ áp dụng được với từng gen riêng lẻ (single locus) và phụ thuộc vào thao tác kỹ thuật của người giám định nên dễ xảy ra sai sót. Từ năm 1990 tới nay các nhà Khoa học hình sự sử dụng các kỹ thuật phân tích các gen có trình tự lặp ngắn (Short Tandem Repeat-STR hay Microsatellite) vì chúng khá bền vững, có khả năng phân tích đồng thời nhiều gen, ít phụ thuộc vào thao tác kỹ thuật của người giám định.

Các cấu trúc VNTR hay STR đều mang tính bảo thủ cao, được di truyền qua các thế hệ và mang tính đặc trưng cho cá thể. Đó là nền tảng khoa học cho giám định gen. Các gen này thường có tính đa hình cao, ít đột biến, tương đối bền vững và cho phép đồng thời thực hiện được phản ứng nhân gen của nhiều gen khác nhau [25]. 7 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Tính đa hình của các gen này được thể hiện ở hai dạng: đa hình về trình tự các nucleotid và đa hình về chiều dài.

- Đa hình về trình tự: các gốc nucleotide ngẫu nhiên trong đoạn ADN không theo một trình tự nào. Ví dụ: tại locus A, Ở cá thể thứ nhất có trình tự: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 - AGACTGCTAG- Ở cá thể thứ hai có trình tự: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 - AGCCTGCGAG- Như vậy tại vị trí số 3 và vị trí số 8 của dãy thứ nhất đã được thay thế A bằng C và T bằng G ở dóy thứ 2 - Đa hình về chiều dài: Một số gốc nucleotid được lặp đi lặp lại nhiều lần trên chiều dài của đoạn ADN. Ví dụ: tại locus D7S820, Cá thể thứ nhất: GATA GATA.GATA  7 đoạn lặp GATA Cá thể thứ hai: GATA GATA GATA. GATA 12 đoạn lặp GATA 1.

Mƣời lăm (15) locus gen hệ Identifiler trờn các nhiễm sắc thể 1.1 Các tiêu chuẩn cho locus STR dùng trong giám định ADN Giám định ADN hiện nay chủ yếu sử dụng các locus STR. Phương pháp giám định ADN có độ tin cậy rất cao bởi các locus STR có tính đa alen (tính đa hình) rất cao, mỗi alen chỉ xuất hiện trong quần thể với tần số rất thấp [17, 31]. Locus STR ngắn nên có thể đồng thời phân tích được nhiều STR trong cùng một thời điểm. Việc phân tích đa hệ rất có giá trị vì chúng có kết quả phân biệt lớn và thành công ngay cả một số trường hợp mẫu lẫn hoặc đó bị phân hủy phần nào [10, 12].

Một locus STR được sử dụng cho mục đích nhận dạng và xác định cá thể phải đảm bảo các thông số sau: 8 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] - Có tính bền vững cao (tần suất đột biến thấp) - Locus STR phải có tính đa hình và mức độ dị hợp tử cao. Điều này giúp các nhà phân tích chỉ sử dụng một số locus tối thiểu đó đạt được sự phân biệt cá thể một cách tốt nhất. - Các locus STR có kích thước ngắn, trung bình từ 100 - 400 bp. Các đoạn ADN ngắn có độ bền vững cao, ít bị đứt gẫy dưới tác động của điều kiện ngoại cảnh.

- Các locus chứa đoạn STR phải đảm bảo yếu tố di truyền độc lập, do vậy nên lựa chọn tổ hợp các locus nằm trên các nhiễm sắc thể khác nhau là rất quan trọng. Nhiều đoạn đa hình có trình tự lặp lại chứa các đơn vị lặp lại từ 4 nucleotide đã được nghiên cứu và đáp ứng được yêu cầu của quy trình phân tích cá thể người. Các đoạn này có đặc tính như sau: - Có tính đa hình và mức độ dị hợp tử cao (>70%). - Dễ dàng phối hợp thành bộ phức khi thực hiện PCR.

- Sản phẩm PCR ổn định, ít xảy ra trường hợp khi PCR đoạn lặp bị thiếu. Năm 2006, Viện Khoa học hình sự đưa vào triển khai giám định ADN bằng bộ kit Identifiler (15 locus gen: D8S1179, D21S11, D7S820, CSF1PO, D3S1358, THO1, D13S317, D16S539, D2S1338, D19S433, vWA, TPOX, D18S51, D5S818 và FGA). Với bộ kit mới này, công tác giám định đạt hiệu quả cao hơn so với bộ kit 9 locus gen Nineplex II được sử dụng trước đây.1: Các locus gen hệ Identifiler [20] Tên locus Vị trí trên NST Trình tự đoạn lặp Các alen D8S1179 8q24.13 phức hợp TCTA/TCTG 6 - 20 D21S11 21q21.1 phức hợp TCTA/TCTG 12 - 43.11 GATA 5 - 16 9 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] CSF1PO 5q33.31 phức hợp TCTA/TCTG 6 - 26 TH01 11p15.1 GATA 4 - 17 D2S1338 2q35 phức hợp TGCC/TTCC 10 - 31 D19S433 19q12 phức hợp AAGG/TAGG 5.2 - 20 vWA 12p12-pter phức hợp TCTA/TCTG 10 - 25 TPOX 2p23-2per AATG 4 - 16 D18S51 18q21.2 D5S818 5q21-31 AGAT 4 - 29 FGA 4q28 phức hợp CTTT/TTCC 12. Ý nghĩa của cơ sở dữ liệu tần suất alen của các locus STR Mỗi cá thể người có cấu trúc di truyền riêng biệt, trừ những trường hợp sinh ra cùng một trứng [5].

Nếu xét rộng trong cả một quần thể thì một số đặc điểm di truyền (ADN) ở các cá thể khác nhau vẫn có thể giống nhau (trùng lặp).