Nghiên cứu tác dụng của tam thất hoang (Panax stipuleanatus) trên sự biểu hiện COX-2 và eNOS

Luận văn thạc sĩ phân tích nghiên cứu tác dụng của tam thất hoang panax stipuleanatus h t tsai et k m feng trên sự biểu hiện, đánh giá thực trạng, chỉ ra hạn chế, đề xuất giải

• Tác giả: Hồ Thị Thu Hà
• Người hướng dẫn: TS. Vũ Thị Thơm
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược học
• Đề tài: Nghiên cứu tác dụng của Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. Feng) trên sự biểu hiện COX-2, eNOS phosphoryl hóa và một số cơ trơn cô lập
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp đại học
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tổng quan về Tam thất hoang
• 1.2. Đặc điểm thực vật
• 1.3. Sinh thái và phân bố
• 1.4. Thành phần hóa học
• 1.5. Tổng quan về nội mạc mạch máu và eNOS
• 1.5.1. Nội mạc mạch máu
• 1.5.2. Tổng quan về viêm và COX-2
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Nguyên liệu và đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Đối tượng nghiên cứu
• 2.3. Dung môi, hóa chất và thiết bị
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4.1. Nghiên cứu tác dụng trên cơ trơn cô lập
• 2.4.2. Nghiên cứu sự biểu hiện của COX-2 và eNOS phosphoryl hóa
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Tác dụng trên cơ trơn cô lập
• 3.2. Tác dụng trên sự biểu hiện eNOS phosphoryl hóa
• 3.3. Tác dụng trên sự biểu hiện COX-2
• KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về tác dụng của tam thất hoang Panax stipuleanatus

Tam thất hoang (Panax stipuleanatus) là một loại thảo dược quý hiếm, nổi bật với nhiều tác dụng dược lý. Nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng cây này có khả năng tác động đến các enzym như COX-2 và eNOS, hai yếu tố quan trọng trong quá trình viêm và điều hòa mạch máu. Việc hiểu rõ về tác dụng của tam thất hoang không chỉ giúp nâng cao giá trị của loại thảo dược này mà còn mở ra hướng đi mới trong nghiên cứu và ứng dụng y học.

1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố của tam thất hoang

Tam thất hoang là cây thân thảo, thường mọc ở vùng núi cao. Cây ưa ẩm và có thể tìm thấy ở độ cao từ 1600 đến 2300 m. Đặc điểm sinh thái và phân bố của cây rất quan trọng trong việc bảo tồn và phát triển nguồn nguyên liệu cho nghiên cứu dược lý.

1.2. Thành phần hóa học của tam thất hoang

Nghiên cứu cho thấy tam thất hoang chứa nhiều saponin, một thành phần có tác dụng chống viêm và giãn mạch. Các hợp chất này không chỉ có giá trị dược lý mà còn có thể được ứng dụng trong điều trị các bệnh lý liên quan đến viêm và tim mạch.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu tác dụng của tam thất hoang

Mặc dù tam thất hoang có nhiều tiềm năng, nhưng nghiên cứu về tác dụng của nó vẫn còn hạn chế. Các thách thức bao gồm việc thiếu thông tin về cơ chế tác động của các hợp chất trong cây, cũng như việc xác định liều lượng và phương pháp sử dụng hiệu quả nhất. Điều này đặt ra yêu cầu cấp thiết cho các nghiên cứu sâu hơn.

2.1. Thiếu thông tin về cơ chế tác động

Nhiều nghiên cứu hiện tại chưa làm rõ được cơ chế tác động của tam thất hoang lên COX-2 và eNOS. Việc hiểu rõ cơ chế này sẽ giúp tối ưu hóa ứng dụng của cây trong y học.

2.2. Khó khăn trong việc xác định liều lượng

Việc xác định liều lượng tối ưu cho tam thất hoang là một thách thức lớn. Các nghiên cứu cần phải được thực hiện để tìm ra liều lượng an toàn và hiệu quả nhất cho người sử dụng.

III. Phương pháp nghiên cứu tác dụng của tam thất hoang trên COX 2 và eNOS

Để nghiên cứu tác dụng của tam thất hoang, các phương pháp như thí nghiệm trên cơ trơn cô lập và phân tích biểu hiện gen được áp dụng. Những phương pháp này giúp đánh giá chính xác tác động của các hợp chất trong tam thất hoang lên các enzym COX-2 và eNOS.

3.1. Thí nghiệm trên cơ trơn cô lập

Phương pháp này cho phép đánh giá tác dụng giãn mạch của tam thất hoang thông qua việc quan sát sự thay đổi của cơ trơn khi tiếp xúc với các phân đoạn chiết xuất từ cây.

3.2. Phân tích biểu hiện gen COX 2 và eNOS

Sử dụng kỹ thuật RT-PCR để phân tích sự biểu hiện của gen COX-2 và eNOS, từ đó xác định được tác động của tam thất hoang đến các enzym này.

IV. Kết quả nghiên cứu về tác dụng của tam thất hoang

Kết quả nghiên cứu cho thấy tam thất hoang có tác dụng tích cực lên sự biểu hiện của COX-2 và eNOS. Các phân đoạn chiết xuất từ cây đã chứng minh khả năng giảm viêm và giãn mạch, mở ra hướng đi mới trong điều trị các bệnh lý liên quan đến tim mạch.

4.1. Tác dụng chống viêm của tam thất hoang

Nghiên cứu cho thấy các hợp chất trong tam thất hoang có khả năng ức chế sự biểu hiện của COX-2, từ đó giảm thiểu tình trạng viêm trong cơ thể.

4.2. Tác dụng giãn mạch của tam thất hoang

Tam thất hoang đã được chứng minh có khả năng tăng cường sản xuất NO thông qua việc kích thích eNOS, giúp cải thiện lưu thông máu và bảo vệ tim mạch.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu về tam thất hoang

Nghiên cứu về tam thất hoang (Panax stipuleanatus) đã chỉ ra nhiều tiềm năng trong việc điều trị các bệnh lý viêm và tim mạch. Tuy nhiên, cần có thêm nhiều nghiên cứu để làm rõ cơ chế tác động và ứng dụng thực tiễn của cây trong y học.

5.1. Tương lai của nghiên cứu tam thất hoang

Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc phát triển các sản phẩm từ tam thất hoang, nhằm tối ưu hóa tác dụng dược lý của cây.

5.2. Ứng dụng thực tiễn trong y học

Tam thất hoang có thể trở thành một nguồn dược liệu quý giá trong điều trị các bệnh lý viêm và tim mạch, mở ra cơ hội cho các sản phẩm y tế mới.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Nội mạc mạch máu là lớp tế bào nội mô lót mặt trong lòng mạch, giữ vai trò sản xuất nitric oxide (NO) – một phân tử tín hiệu quan trọng tham gia điều hòa trương lực mạch, ức chế kết tập tiểu cầu, ngăn chặn sự kết dính bạch cầu và kiểm soát tăng sinh tế bào cơ trơn. NO được tổng hợp chủ yếu nhờ enzym endothelial nitric oxide synthase (eNOS), trong đó quá trình phosphoryl hóa eNOS tại các vị trí acid amin đặc hiệu (như Ser1177) là cơ chế điều hòa hoạt tính sau dịch mã then chốt. Sự suy giảm chức năng nội mạc mạch máu gắn liền với tình trạng viêm mạn tính và giảm tổng hợp NO, liên quan trực tiếp đến nhiều bệnh lý tim mạch như xơ vữa động mạch, tăng huyết áp và nhồi máu cơ tim. Bên cạnh đó, cyclooxygenase-2 (COX-2) là enzym cảm ứng xúc tác cho các giai đoạn đầu tổng hợp prostaglandin (đặc biệt là PGE2), đóng vai trò trung tâm trong đáp ứng viêm và tổn thương mô.

Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. Feng), thuộc chi Panax L., họ Ngũ gia bì (Araliaceae), là loài dược liệu quý mọc tự nhiên ở vùng núi cao Hoàng Liên Sơn (Việt Nam) và tỉnh Vân Nam (Trung Quốc). Các nghiên cứu hóa thực vật bước đầu cho thấy thân rễ Tam thất hoang chứa hàm lượng saponin khung oleanan cao cùng một lượng nhỏ saponin khung dammaran. Mặc dù saponin từ các loài cùng chi như Nhân sâm (Panax ginseng) đã được chứng minh có tác dụng giãn cơ trơn, hoạt hóa eNOS và kháng viêm, các dữ liệu khoa học về tác dụng dược lý của Tam thất hoang phân bố tại Việt Nam vẫn còn hạn chế. Nhằm làm sáng tỏ hoạt tính sinh học của nguồn dược liệu này, khóa luận đặt ra 3 mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

1. Bước đầu đánh giá tác dụng của các phân đoạn dịch chiết Tam thất hoang trên cơ trơn cô lập của khí quản, bàng quang và thể hang chuột cống trắng.
2. Đánh giá tác dụng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự tổng hợp NO và sự biểu hiện của protein eNOS phosphoryl hóa trên tế bào nội mô tĩnh mạch rốn người (HUVEC).
3. Đánh giá tác dụng của các phân đoạn Tam thất hoang trên mức độ biểu hiện gen (mARN) COX-2 và protein COX-2 trên tế bào đại thực bào chuột (RAW 264.7).

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Các phân đoạn chiết từ thân rễ Tam thất hoang; mô cơ trơn cô lập (khí quản, bàng quang, thể hang) của chuột cống trắng Wistar; dòng tế bào nội mô HUVEC và dòng tế bào đại thực bào RAW 264.7.
• Phạm vi không gian và địa điểm thực hiện: Dược liệu thu hái tại huyện Hoàng Su Phì, tỉnh Hà Giang (tháng 08/2016). Thí nghiệm trên cơ trơn cô lập thực hiện tại Bộ môn Sinh lý học, Học viện Quân Y. Các thí nghiệm sinh học phân tử và tế bào (RT-PCR, Western blot, định lượng NO) thực hiện tại Bộ môn Khoa học Y học thực nghiệm, Khoa Y, Đại học Lund, Thụy Điển.
• Phạm vi thời gian: Đề tài hoàn thành vào tháng 5 năm 2018, thuộc khuôn khổ đề tài nghiên cứu khoa học công nghệ cấp nhà nước mã số KHCN-TB.07C/13-18.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận được xây dựng dựa trên cơ sở sinh lý bệnh học tim mạch và sinh học phân tử liên quan đến trục tín hiệu eNOS/NO và con đường viêm phụ thuộc COX-2:

• Hệ thống Nitric Oxide Synthase (NOS): Gồm 3 đồng dạng chính: nNOS (NOS-1, thần kinh), iNOS (NOS-2, cảm ứng) và eNOS (NOS-3, nội mạc). eNOS là enzym homodimer nặng 133 kDa (1203 acid amin), gồm domain oxygenase gắn hem, tetrahydrobiopterin (BH4), L-arginin và domain reductase gắn NADPH, FAD, FMN. Hoạt tính eNOS được điều hòa bởi nồng độ ion Ca2+/Calmodulin và quá trình phosphoryl hóa tại gốc Ser1177 (hoạt hóa) hoặc Thr495 (ức chế).
• Con đường tổng hợp Prostaglandin: Phospholipid màng chuyển hóa thành acid arachidonic nhờ phospholipase A2, sau đó được COX-1 (cơ định) hoặc COX-2 (cảm ứng bởi LPS, cytokin) oxy hóa thành PGH2 rồi chuyển thành các prostanoid (PGE2, PGI2, PGD2, PGF2α, TXA2).

Nhóm phương pháp	Mô hình / Kỹ thuật thực nghiệm	Chi tiết thông số và hóa chất
Chiết xuất và phân đoạn	Chiết ngấm kiệt, chiết phân bố lỏng - lỏng, sắc ký cột	Dung môi ethanol 70%, n-hexan, diclomethan, n-butanol, thu được 5 phân đoạn: PST, PSnH, PS DCM, PSBt, PS27.
Dược lý thực nghiệm ex vivo	Đo trương lực cơ trơn cô lập trên hệ thống bình nuôi nội tạng	Chuột Wistar (150–250 g), dung dịch Tyrode (37 °C, sục O2), tiền co cơ bằng Acetylcholin (1:10³ – 1:10⁵), ghi lực co bằng đầu đo áp lực hệ thống PowerLab 8.0. Nồng độ dịch chiết: 0,5; 1,0; 2,0 mg/ml.
Đo quang xác định sản phẩm NO	Phản ứng so màu Griess gián tiếp qua nitrit ($NO_2^-$)	Tế bào HUVEC ủ với mẫu thử 30 µg/ml trong 24h; khử $NO_3^-$ thành $NO_2^-$ bằng nitrit reductase (1h, 37 °C); đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm trên máy Multiskan GO.
Phân tích biểu hiện gen mARN COX-2	Real-time RT-PCR bán định lượng	Tế bào RAW 264.7 kích thích bằng LPS 1 µg/ml; tách ARN bằng miRNeasy Mini Kit; huỳnh quang SYBR Green, máy StepOnePlus. Cặp mồi Ptgs2 (F: 5'-GCCCAGCACTTCACGCATCAG-3', R: 5'-GACCAGGCACCAGACCAAAGACC-3') và mồi chuẩn Mm_GAPDH.
Phân tích biểu hiện protein p-eNOS và COX-2	Western blotting	Điện di gel SDS-PAGE 10%, chuyển màng nitrocellulose; ủ kháng thể đơn dòng kháng p-eNOS, COX-2 và kháng thể chứng nội β-actin; phát hiện phát quang hóa học trên máy Odyssey Fc Imager; định lượng mật độ quang bằng phần mềm ImageJ 1.49u.
Xử lý số liệu	Thống kê sinh học	Phần mềm SPSS 20; kiểm định One-way ANOVA; hậu kiểm Tukey hoặc Dunnett's T3 ($p < 0,05$).

---

Nội dung chính theo từng chương

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

Chương tổng quan hệ thống hóa tài liệu học thuật theo 3 nhóm nội dung chính:

• Đặc điểm sinh học và thành phần hóa học của Tam thất hoang: Mô tả hình thái thực vật, vùng sinh thái (độ cao 1600–2300 m dưới tán rừng kín ẩm Hoàng Liên Sơn). Tổng hợp các công trình phân lập hợp chất: 2 saponin dẫn chất acid oleanolic (stipuleanosid R1, R2) bởi Yang Chongren (1985); các ginsenosid khung dammaran (Rb1, Rc, Rb3, Rd) bởi Zou Kun (2002); 15 saponin khung oleanan (trong đó có spinasaponin A methyl ester) và 2 polyacetylen (stipudiol, stipuol) bởi Chun Liang và cộng sự (2010, 2011, 2013). Nêu các dữ liệu dược lý tiền lâm sàng như độc tính cấp đường uống ($LD_{50} = 8,8$ g/kg), tác dụng chống oxy hóa, an thần giảm stress và ức chế ngưng tập tiểu cầu in vitro.
• Sinh lý nội mạc mạch máu, eNOS và Nitric Oxide: Phân tích giải phẫu mô học thành mạch, cấu trúc dimer và cơ chế điều hòa hoạt hóa eNOS qua chuỗi phosphoryl hóa các vị trí Ser1177, Ser617, Ser633 và ức chế qua Thr495, Ser114. Trình bày vai trò giãn mạch qua con đường tín hiệu sGC/cGMP/PKG, ức chế kết dính bạch cầu qua MCP-1, CD11/CD18, ức chế kết tập tiểu cầu và ức chế tăng sinh cơ trơn mạch máu.
• Sinh lý bệnh phản ứng viêm và enzym COX-2: Phân biệt đặc tính sinh học giữa enzym cấu trúc COX-1 và enzym cảm ứng COX-2. Mô tả vai trò của PGE2 trong giãn mạch, tăng tính thấm thành mạch, gây đau và sốt, cùng các bằng chứng về sự biểu hiện quá mức của COX-2 trong xơ vữa động mạch, ung thư và suy thận.

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương phương pháp mô tả chi tiết quy trình chuẩn bị mẫu, động vật thí nghiệm và kỹ thuật phân tích:

• Quy trình điều chế mẫu thử: Từ thân rễ Tam thất hoang thu hái tại Hoàng Su Phì (Hà Giang), tiến hành chiết kiệt bằng cồn 70% thu được cao tổng (PST). Phân đoạn dịch chiết cồn bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần thu được phân đoạn n-hexan (PSnH), diclomethan (PS DCM), n-butanol (PSBt) và quy trình điều chế phân đoạn cao giàu saponin (PS27).
• Mô hình cơ trơn cô lập: Chuột cống trắng Wistar được gây mê bằng ketamin (25 mg/kg), phẫu tích lấy đoạn khí quản, cổ bàng quang và thể hang, bộc lộ tổ chức liên kết và gắn vào bình nuôi Tyrode 15 ml ở 37 °C, sục khí liên tục. Thiết lập tải trọng nghỉ 2 g, ổn định 30 phút, gây co bằng Acetylcholin, sau đó bổ sung dịch chiết dược liệu ở các dải nồng độ 0,5; 1; 2 mg/ml để ghi nhận biên độ giãn cơ.
• Quy trình nuôi cấy tế bào và kỹ thuật sinh học phân tử: Nuôi cấy tế bào nội mô HUVEC và đại thực bào RAW 264.7 trong môi trường bổ sung 10% FBS, penicillin (100 units/ml) và streptomycin (100 µg/ml) ở 37 °C, 5% $CO_2$. Trình bày chi tiết giao thức định lượng nitrit bằng thuốc thử Griess sau khi xử lý enzym nitrit reductase, quy trình tách chiết ARN tổng số, phiên mã ngược, chạy Real-time PCR khuếch đại gen Ptgs2 và quy trình ly giải protein, điện di SDS-PAGE, thẩm tách Western blot với kháng thể đặc hiệu p-eNOS và COX-2.

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Chương này công bố số liệu thực nghiệm và biện luận cơ chế tác dụng:

• Tác dụng trên trương lực cơ trơn cô lập: Khảo sát 4 phân đoạn (PST, PSBt, PSnH, PS DCM). Kết quả cho thấy PST và PSBt gây giãn cơ trơn khí quản và bàng quang chuột phụ thuộc nồng độ (xuất hiện từ 1 mg/ml và giãn rõ ở 2 mg/ml). Phân đoạn PSnH và PS DCM hầu như không thể hiện tác dụng giãn cơ.
• Tác dụng trên sự tổng hợp NO và phosphoryl hóa eNOS: Trên tế bào HUVEC ở nồng độ 30 µg/ml, cao tổng PST làm tăng sản sinh NO lên $1,83 \pm 0,24$ lần ($p < 0,05$) và cao giàu saponin PS27 làm tăng NO lên $2,11 \pm 0,36$ lần ($p < 0,01$) so với lô đối chứng. Định lượng Western blot xác nhận tỷ lệ p-eNOS/β-actin tăng 6,73 lần ở lô PST và 9,61 lần ở lô PS27 so với đối chứng.
• Tác dụng trên biểu hiện gen và protein COX-2: Trên đại thực bào RAW 264.7 được kích thích bằng LPS (1 µg/ml), cả 5 phân đoạn thử nghiệm ở nồng độ 30 µg/ml đều không ức chế có ý nghĩa thống kê mức biểu hiện mARN COX-2 ($p > 0,05$) và không làm suy giảm rõ rệt hàm lượng protein COX-2 trên bản điện di Western blot.
• Thảo luận khoa học: Tác giả đối chiếu kết quả với các nghiên cứu trên Panax ginseng và saponin tinh khiết phân lập từ Tam thất hoang của Chun Liang (2013). Đưa ra giả thiết về sự đóng góp chủ đạo của nhóm saponin trong hoạt tính kích hoạt eNOS và giãn cơ trơn, đồng thời giải thích kết quả âm tính trên COX-2 là do sử dụng phân đoạn chiết thô thay vì đơn chất tinh khiết và sự khác biệt về dòng tế bào thử nghiệm (RAW 264.7 so với HepG2).

---

Kết quả và đóng góp

Bảng tổng hợp kết quả thực nghiệm của các phân đoạn Tam thất hoang

Phân đoạn thử nghiệm	Giãn cơ trơn khí quản (2 mg/ml)	Giãn cơ trơn bàng quang (2 mg/ml)	Mức tăng sản xuất NO trên HUVEC (lần so với chứng)	Mức tăng tỷ lệ p-eNOS/β-actin (lần so với chứng)	Tác dụng ức chế mARN và protein COX-2 (30 µg/ml)
Cao tổng (PST)	Giãn rõ (++)	Giãn nhẹ (+)	$1,83 \pm 0,24$ ($p < 0,05$)	6,73 lần	Không ức chế ($p > 0,05$)
Cao n-butanol (PSBt)	Giãn nhẹ (+)	Giãn rõ (++)	Tăng không có ý nghĩa ($p > 0,05$)	Tăng nhẹ	Không ức chế ($p > 0,05$)
Cao giàu saponin (PS27)	Không thử nghiệm ex vivo	Không thử nghiệm ex vivo	$2,11 \pm 0,36$ ($p < 0,01$)	9,61 lần	Không ức chế ($p > 0,05$)
Cao n-hexan (PSnH)	Giãn nhẹ (+)	Không rõ ràng ($\pm$)	Tăng không có ý nghĩa ($p > 0,05$)	Tăng nhẹ	Không ức chế ($p > 0,05$)
Cao diclomethan (PS DCM)	Không rõ ràng ($\pm$)	Không rõ ràng ($\pm$)	Tăng không có ý nghĩa ($p > 0,05$)	Tăng nhẹ	Không ức chế ($p > 0,05$)

Đóng góp khoa học và giải pháp đề xuất

• Đóng góp mới của tác giả: Khóa luận là công trình đầu tiên tại Việt Nam chứng minh bằng phương pháp sinh học phân tử rằng cao chiết Tam thất hoang (đặc biệt là cao tổng PST và cao giàu saponin PS27) có khả năng kích thích tổng hợp NO nội mạc thông qua con đường tăng cường phosphoryl hóa enzym eNOS trên tế bào HUVEC. Đồng thời, bước đầu xác định phân đoạn phân cực cao n-butanol (PSBt) và PST sở hữu hoạt tính làm giãn cơ trơn khí quản, bàng quang và thể hang cô lập.
• Đề xuất của tác giả:
  1. Tiếp tục mở rộng nghiên cứu tác dụng của PST, PSBt và PS27 trực tiếp trên mô hình cơ trơn thành mạch máu cô lập để thiết lập đường cong liều - đáp ứng và làm sáng tỏ cơ chế giãn mạch qua trung gian NO.
  2. Triển khai phân tích định tính, định lượng chi tiết các hợp chất saponin đơn lẻ hiện diện trong phân đoạn n-butanol, cao tổng và cao giàu saponin nhằm xác định chính xác hoạt chất có tác dụng sinh học chính.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận tự chỉ ra một số hạn chế kỹ thuật trong quá trình thực nghiệm:

• Đánh giá tác dụng trên cơ trơn cô lập mới dừng lại ở mức định tính sơ bộ, dải nồng độ thử nghiệm còn hẹp (0,5–2,0 mg/ml) và số lần lặp lại thí nghiệm còn ít.
• Chưa khảo sát trực tiếp trên cơ trơn thành mạch máu – vị trí đích có mối liên hệ mật thiết nhất với cơ chế giải phóng NO nội mạc và hoạt tính eNOS.
• Thành phần hóa học chi tiết trong từng phân đoạn dịch chiết chưa được định lượng đầy đủ, gây khó khăn trong việc xác định chính xác hoạt chất chủ đạo tạo ra tác dụng.
• Dải băng protein đối chứng nội β-actin trong phép phân tích Western blot của thí nghiệm COX-2 chưa đạt độ đồng đều và sắc nét lý tưởng giữa các lô thí nghiệm.

---

Giá trị tham khảo

Công trình là tài liệu tham khảo thực nghiệm cho:

• Sinh viên và học viên ngành Dược học, Dược lý học, Hóa thực vật: Tham khảo thiết kế thí nghiệm sàng lọc hoạt tính sinh học kết hợp giữa mô hình dược lý cơ quan cô lập (ex vivo) và kỹ thuật sinh học phân tử tế bào (in vitro).
• Nhà nghiên cứu phát triển thuốc từ hợp chất tự nhiên: Cung cấp quy trình chiết xuất phân đoạn Tam thất hoang, giao thức chuẩn đo quang NO bằng thuốc thử Griess, phương pháp Real-time RT-PCR định lượng mARN COX-2 và kỹ thuật Western blot xác định mức độ phosphoryl hóa enzym eNOS.
• Nghiên cứu ứng dụng dược liệu chi Panax: Cung cấp cơ sở khoa học định hướng khai thác nhóm cao giàu saponin từ Tam thất hoang phục vụ nghiên cứu hỗ trợ điều trị các bệnh lý tim mạch, co thắt phế quản và rối loạn chức năng mạch máu.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tam thất hoang trong nghiên cứu được thu hái ở đâu và gồm những phân đoạn chiết nào?
Dược liệu thân rễ Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. Feng) được thu hái tại huyện Hoàng Su Phì, tỉnh Hà Giang vào tháng 08/2016. Các phân đoạn dịch chiết nghiên cứu gồm: cao tổng chiết bằng cồn 70% (PST), phân đoạn n-hexan (PSnH), phân đoạn diclomethan (PS DCM), phân đoạn n-butanol (PSBt) và cao giàu saponin (PS27).

2. Phân đoạn nào của Tam thất hoang thể hiện tác dụng làm tăng tổng hợp NO và hoạt hóa eNOS mạnh nhất?
Cao giàu saponin (PS27) và cao tổng (PST) thể hiện tác dụng mạnh nhất trên tế bào HUVEC ở nồng độ 30 µg/ml. Cụ thể, PS27 làm tăng lượng NO lên $2,11 \pm 0,36$ lần ($p < 0,01$) và tăng tỷ lệ p-eNOS/β-actin lên 9,61 lần; PST làm tăng lượng NO lên $1,83 \pm 0,24$ lần ($p < 0,05$) và tăng tỷ lệ p-eNOS/β-actin lên 6,73 lần so với nhóm đối chứng.

3. Tác dụng của các phân đoạn Tam thất hoang trên cơ trơn cô lập được ghi nhận như thế nào?
Trên các mô cơ trơn khí quản, bàng quang và thể hang chuột cống trắng Wistar bị gây co bởi Acetylcholin ($1:10^4$), phân đoạn tổng PST và phân đoạn n-butanol PSBt thể hiện tác dụng làm giãn cơ trơn phụ thuộc nồng độ. Tác dụng giãn bắt đầu xuất hiện từ liều 1 mg/ml và thể hiện rõ rệt ở liều 2 mg/ml. Hai phân đoạn PSnH và PS DCM hầu như không có tác dụng.

4. Kết quả khảo sát tác dụng chống viêm qua ức chế biểu hiện COX-2 của Tam thất hoang ra sao?
Ở nồng độ thử nghiệm 30 µg/ml trên tế bào đại thực bào RAW 264.7 bị kích thích gây viêm bởi LPS (1 µg/ml), tất cả các phân đoạn dịch chiết của Tam thất hoang đều không làm giảm có ý nghĩa thống kê mức độ biểu hiện mARN COX-2 ($p > 0,05$) và không làm thay đổi đáng kể lượng protein COX-2 trên bản điện di Western blot.

5. Các kỹ thuật sinh học phân tử chính nào đã được áp dụng trong khóa luận và thực hiện tại đâu?
Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật Real-time RT-PCR (với cặp mồi đặc hiệu Ptgs2 và thuốc nhuộm SYBR Green trên hệ máy StepOnePlus) để đo mARN COX-2; kỹ thuật Western blot (sử dụng kháng thể đơn dòng và hệ thống chụp Odyssey Fc Imager) để xác định p-eNOS, COX-2; và phương pháp đo quang Griess ở bước sóng 540 nm để xác định NO. Các thí nghiệm này được thực hiện tại Khoa Y, Đại học Lund, Thụy Điển.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp đã chứng minh thực nghiệm dịch chiết cao tổng (PST) và cao giàu saponin (PS27) từ thân rễ Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. Feng) có tác dụng kích thích giải phóng NO thông qua cơ chế tăng cường biểu hiện của eNOS phosphoryl hóa trên tế bào nội mô HUVEC, đồng thời ghi nhận tác dụng giãn cơ trơn khí quản, bàng quang và thể hang cô lập của phân đoạn PST và phân đoạn n-butanol (PSBt). Ở nồng độ 30 µg/ml, các phân đoạn dịch chiết thô chưa thể hiện hoạt tính ức chế sự biểu hiện mARN và protein COX-2 trên đại thực bào RAW 264.7 kích thích bởi LPS. Kết quả nghiên cứu cung cấp dữ liệu dược lý ban đầu quan trọng, khẳng định vai trò của nhóm hoạt chất saponin và mở ra hướng nghiên cứu sâu hơn về tiềm năng ứng dụng của Tam thất hoang trong hỗ trợ điều trị các bệnh lý tim mạch và hô hấp.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Nội mạc mạch máu là một lớp tế bào nội mô mỏng nằm lót mặt trong của lòng mạch [1]. Các tế bào này có khả năng sản xuất ra nitric oxid (NO), một chất giãn mạch quan trọng và có nhiều vai trò trong điều hòa chức năng sinh lý của mạch máu như trương lực mạch, sự kết tập tiểu cầu, sinh mạch, sự kết dính bạch cầu – nội mô… Tại nội mạc mạch máu, NO được tổng hợp nhờ các enzym nitric oxide synthase ở nội mạc (eNOS - Endothelial nitric oxide synthase). Hoạt động của enzym này được điều khiển bởi nhiều cơ chế trong đó có quá trình phosphoryl hóa eNOS [41,69]. Viêm là một trong những nguyên nhân gây rối loạn chức năng nội mạc [67].

Rối loạn chức năng nội mạc có liên quan đến NO, phosphoryl hóa eNOS và quá trình viêm đã được báo cáo trong nhiều bệnh lý tim mạch như xơ vữa động mạch, cao huyết áp…[24,37]. Trong những năm gần đây, sự điều hòa eNOS thông qua quá trình phosphoryl hóa đang là một mục tiêu y học triển vọng trong điều trị nhiều bệnh lý [41]. Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. Feng ) thuộc chi Panax L., ở nước ta cây chỉ có ở vùng núi cao thuộc dãy Hoàng Liên Sơn [9].

Nghiên cứu bước đầu về thành phần hóa học cho thấy trong rễ và lá của Tam thất hoang có chứa saponin với hàm lượng cao [6]. Đặc biệt, saponin trong các loài thuộc chi Panax L. đã được chứng minh có tác dụng giãn cơ trơn, tăng tổng hợp NO, tăng biểu hiện của eNOS phosphoryl hóa [39,73] và chống viêm [32,45,58]. Tuy nhiên, đến nay các nghiên cứu về loài này vẫn còn hạn chế.

Điều này đặt ra câu hỏi liệu với thành phần giàu saponin, Tam thất hoang có những tác dụng kể trên hay không? Để làm sáng tỏ điều đó, tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tác dụng của Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. Feng) trên sự biểu hiện COX-2, eNOS phosphoryl hóa và một số cơ trơn cô lập” với ba mục tiêu: 1. Bước đầu đánh giá được tác dụng của các phân đoạn Tam thất hoang trên cơ trơn cô lập của khí quản, bàng quang và thể hang. Đánh giá được tác dụng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự biểu hiện của eNOS phosphoryl hóa và sự tổng hợp NO.

Đánh giá được tác dụng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự biểu hiện của gen COX-2 và protein COX-2. 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Tổng quan về Tam thất hoang Tam thất hoang có tên khoa học là Panax stipuleanatus H. Feng, thuộc họ Ngũ gia bì (Araliaceae), chi Panax L.; hay còn được gọi với các tên khác như Tam thất rừng, Bình biên tam thất, Thổ tam thất [2,8].

Đặc điểm thực vật Cây thân thảo cao 25 – 75 cm; thẫn rễ mập, nằm ngang, có nhiểu vết lõm do vết thân để lại, ít phân nhánh. Mỗi khóm thường có 1 thân mang lá, ít khi 2 – 3 lá. Lá kép chân vịt, gồm 1 – 3 cái, mọc vòng ở ngọn; cuống dài 5 – 10 cm. Lá chét 5, có cuống ngắn, hình thuôn hay mác thuôn, dài 5 – 13 cm, rộng 2 – 4 cm, nhọn hai đầu, cuống hoa dài 1 – 1,5 cm.

Hoa màu vàng xanh với 5 lá đài nhỏ, 5 cánh hoa, 5 nhị và bầu 2 ô. Quả mọng, gần hình cầu dẹp, đường kính 0,6 – 1,2 cm, khi chín màu đỏ. Hạt gồm 1 hoặc 2 hạt màu xám trắng (Hình 1. Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.

Sinh thái và phân bố Tam thất hoang (TTH) ưa ẩm và sáng. Cây mọc rải rác trên đất có nhiều mùn, dưới tán rừng kín thường xanh, ở độ cao 1600 – 2300 m. Tái sinh bằng hạt. Ra hoa tháng 4 – 5, có quả tháng 5 – 9.

Cho đến nay, trên toàn thế giới, loài này mới chỉ tìm thấy ở tỉnh Vân Nam (Trung Quốc) và một vài điểm ở Vườn Quốc gia Hoàng Liên Sơn thuộc tỉnh Lào Cai, Việt Nam [2,9]. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Thành phần hóa học Trong thân rễ của TTH chứa các saponin khung oleanan (hầu hết đều là saponin dẫn chất acid oleanolic) với hàm lượng tương đối cao cùng một số saponin khung dammaran với hàm lượng thấp [19]. Năm 1985, từ dịch chiết methanol của thân rễ TTH đã phân lập được 2 saponin dẫn chất của acid oleanolic là stipuleanosid R1và stipuleanosid R2 [19].

Năm 2002, nhóm nghiên cứu của Đại học Toyama, Nhật Bản phân tích thành phần dịch chiết ethanol của TTH thu hái ở Trung Quốc đã xác định được một hàm lượng nhỏ các saponin khung dammaran gồm các ginsenosid Rb1, Rc, Rb3 và Rd [43]. Năm 2010, nhóm nghiên cứu của Chun Liang và cộng sự đã phân lập được 11 hợp chất saponin là dẫn chất của acid oleanolic, trong đó có một chất mới là spinasaponin A methyl ester từ rễ TTH thu hái ở Việt Nam [15]. Năm 2013, nhóm tiếp tục xác định được thêm 4 hợp chất saponin khung oleanan khác [45]. Ngoài ra 3 polyacetylen, 1 sesquiterpen và 1 acid béo cũng được phân lập [15] (Hình 1.

Cấu trúc hóa học của 15 chất phân lập từ P. 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Tác dụng dƣợc lý Trên thế giới, năm 2010, từ 11 hợp chất saponin phân lập được từ TTH (1 – 11, hình 1.2) nhóm nghiên cứu của Chun Liang đã tiến hành thử tác dụng gây độc trên các tế bào ung thư bạch cầu cấp tiền tủy bào (HL-60) và ung thư ruột kết người (HCT-116) thu được kết quả: Chất 1 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào đáng kể với giá trị IC50 lần lượt là 4,44 và 0,63 µM trên 2 dòng tế bào HL-60 và HCT-116 [15]. Năm 2013, Chun Liang và cộng sự tiếp tục đánh giá hoạt tính của 15 chất (1 – 15, hình 1.2) lên yếu tố nhân kappa B (NF-κB) trên tế bào HepG2 cho kết quả: Các chất từ 6 – 11 ức chế NF-κB với IC50 từ 3,1 – 18,9 µM.

Các chất 8, 10 và 11 ức chế sự biểu hiện của mARN iNOS (inducible nitric oxide synthase) và COX-2 (cyclooxygenase-2) phụ thuộc nồng độ. Điều này đem lại tiềm năng trong điều trị như là chất chống viêm, chống xơ vữa động mạch và chống loạn thần [45]. Năm 2011, 2 polyacetylen mới được phân lập từ TTH là stipudiol và stipuol ức chế đáng kể sự tăng sinh của tế bào ung thư HL-60 và HCT-116 thông qua kích hoạt quá trình apotosis của tế bào [46]. Tại Việt Nam, nghiên cứu của Trần Công Luận năm 2002 cho thấy: Cao TTH có tác dụng phục hồi thời gian ngủ do stress, đưa về trạng thái bình thường ở các mức liều thử 44; 88 và 176 mg/kg.

Ở các nồng độ 25; 50 và 100 μg/ml cao saponin toàn phần của TTH có tác dụng chống oxy hóa, ức chế sự hình thành malonyl dialdehyd. Cao thân rễ và rễ củ TTH thể hiện độc tính cấp đường uống với liều LD50 = 8,8 g/kg [5]. Nghiên cứu của Lê Thị Tâm và Nguyễn Thị Tuyết Trinh (2016) cho kết quả TTH có tác dụng chống đông và ức chế ngưng tập tiểu cầu in vitro [7,11]. Công dụng Sách đỏ Việt Nam (2007) có ghi “Tất cả các bộ phận của cây đều có công dụng làm thuốc; thân rễ thường được dùng làm thuốc bổ, cầm máu, tăng cường sinh dục, chống stress.

Lá, nụ hoa dùng làm trà uống có tác dụng kích thích tiêu hóa, an thần”. TTH có tác dụng tán ứ, định thống. Bộ phận dùng là thân rễ Rhizoma Panacis Stipuleanati [2]. 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.

Tổng quan về nội mạc mạch máu và eNOS 1. Nội mạc mạch máu 1.1 Đặc điểm cấu trúc Về giải phẫu học từ trong ra ngoài, thành động mạch có cấu tạo gồm 3 lớp áo đồng tâm: Lớp áo ngoài là lớp vỏ xơ, có các sợi thần kinh chi phối; lớp áo giữa gồm những sợi cơ trơn và sợi đàn hồi; lớp áo trong là lớp tế bào nội mô (Hình 1. Cấu trúc thành động mạch [1] Tương tự như thành động mạch, thành tĩnh mạch, mao mạch và mạch bạch huyết cũng có một lớp tế bào nội mô lợp mặt trong lòng mạch. Lớp nội mô thuộc biểu mô lát đơn, gồm một hàng tế bào nội mô hình đa giác dẹt, có phần bào tương chứa nhân lồi vào trong lòng mạch, phần bào tương ở ngoại vi tỏa thành lá mỏng.

Các tế bào nội mô liên kết với nhau bằng những dải bịt hoặc liên kết khe [1]. Ở người trưởng thành, nội mạc mạch máu gồm khoảng mười ngàn tỷ (1013) tế bào, bao phủ một diện tích khoảng 1 - 7 m2 hình thành nên một tổ chức nặng khoảng 1 kg [27,52]. Chức năng của nội mạc mạch máu Nội mạc mạch máu có vai trò quan trọng trong việc kiểm soát sự lưu thông dòng máu, trương lực mạch máu, sự kết tập tiểu cầu cũng như tham gia điều hòa các quá trình viêm, miễn dịch, sinh mạch, chuyển hóa và duy trì sự hằng định nội môi [30]. Các tế bào nội mô thực hiện cả hai chức năng trao đổi chất và tổng hợp [52].

Nội mạc mạch máu hình thành nên một hàng rào bán thấm kiểm soát sự di chuyển của các chất hòa tan, các đại phân tử và cả các tế bào giữa dòng máu với các mô xung quanh [27,30]. Irie và Tavassoli gọi đó là hàng rào máu – mô [65]. Rối loạn tính thấm nội mạc có thể gây ra nhiều bệnh lý như phù, sốc, xung huyết. 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Các tế bào nội mô có khả năng sản xuất ra nhiều phân tử khác nhau như các chất giãn mạch: nitric oxide (NO), prostacyclin (PGI2), EDHF (yếu tố cường phân cực có nguồn gốc nội mô/ endothelium-derived hyperpolarizing factor); các chất co mạch: Endothelin, thromboxan A2, angiotensin II; các phần tử kết dính: E-selectin, P-selectin, ICAM -1 (phân tử kết dính liên bào/ intercellular adhesion molecule) và VCAM-1 (phân tử kết dính tế bào mạch/ vascular cell adhesion molecule); cytokin và yếu tố tăng trưởng: GM-CSF (Yếu tố kích thích quần thể bạch cầu hạt – đại thực bào/ Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), interleukin (IL-1, IL-6) và SCF (Yếu tố tế bào gốc/ Stem cell factor); các chemokin: α và β chemokin, fractalkin; các yếu tố liên quan đến quá trình cầm máu: t-PA (yếu tố hoạt hóa plasminogen mô), PAI-1 (chất ức chế yếu tố hoạt hóa plasminogen), yếu tố Willebrand, thromboxan A2, NO, PGI2, TF (yếu tố mô), TFPI (chất ức chế con đường yếu tố mô); hay các yếu tố liên quan đến sự tăng sinh cơ trơn và sinh mạch: VEGF (yếu tố tăng trưởng nội mạc mạch/ vascular endothelial growth factor), PDGF (yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu/ platelet derived growth factor) [17,26,27,38].