ĐẶT VẤN ĐỀ Nội mạc mạch máu là một lớp tế bào nội mô mỏng nằm lót mặt trong của lòng mạch [1]. Các tế bào này có khả năng sản xuất ra nitric oxid (NO), một chất giãn mạch quan trọng và có nhiều vai trò trong điều hòa chức năng sinh lý của mạch máu như trương lực mạch, sự kết tập tiểu cầu, sinh mạch, sự kết dính bạch cầu – nội mô… Tại nội mạc mạch máu, NO được tổng hợp nhờ các enzym nitric oxide synthase ở nội mạc (eNOS - Endothelial nitric oxide synthase). Hoạt động của enzym này được điều khiển bởi nhiều cơ chế trong đó có quá trình phosphoryl hóa eNOS [41,69]. Viêm là một trong những nguyên nhân gây rối loạn chức năng nội mạc [67].
Rối loạn chức năng nội mạc có liên quan đến NO, phosphoryl hóa eNOS và quá trình viêm đã được báo cáo trong nhiều bệnh lý tim mạch như xơ vữa động mạch, cao huyết áp…[24,37]. Trong những năm gần đây, sự điều hòa eNOS thông qua quá trình phosphoryl hóa đang là một mục tiêu y học triển vọng trong điều trị nhiều bệnh lý [41]. Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. Feng ) thuộc chi Panax L., ở nước ta cây chỉ có ở vùng núi cao thuộc dãy Hoàng Liên Sơn [9].
Nghiên cứu bước đầu về thành phần hóa học cho thấy trong rễ và lá của Tam thất hoang có chứa saponin với hàm lượng cao [6]. Đặc biệt, saponin trong các loài thuộc chi Panax L. đã được chứng minh có tác dụng giãn cơ trơn, tăng tổng hợp NO, tăng biểu hiện của eNOS phosphoryl hóa [39,73] và chống viêm [32,45,58]. Tuy nhiên, đến nay các nghiên cứu về loài này vẫn còn hạn chế.
Điều này đặt ra câu hỏi liệu với thành phần giàu saponin, Tam thất hoang có những tác dụng kể trên hay không? Để làm sáng tỏ điều đó, tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tác dụng của Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. Feng) trên sự biểu hiện COX-2, eNOS phosphoryl hóa và một số cơ trơn cô lập” với ba mục tiêu: 1. Bước đầu đánh giá được tác dụng của các phân đoạn Tam thất hoang trên cơ trơn cô lập của khí quản, bàng quang và thể hang. Đánh giá được tác dụng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự biểu hiện của eNOS phosphoryl hóa và sự tổng hợp NO.
Đánh giá được tác dụng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự biểu hiện của gen COX-2 và protein COX-2. 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Tổng quan về Tam thất hoang Tam thất hoang có tên khoa học là Panax stipuleanatus H. Feng, thuộc họ Ngũ gia bì (Araliaceae), chi Panax L.; hay còn được gọi với các tên khác như Tam thất rừng, Bình biên tam thất, Thổ tam thất [2,8].
Đặc điểm thực vật Cây thân thảo cao 25 – 75 cm; thẫn rễ mập, nằm ngang, có nhiểu vết lõm do vết thân để lại, ít phân nhánh. Mỗi khóm thường có 1 thân mang lá, ít khi 2 – 3 lá. Lá kép chân vịt, gồm 1 – 3 cái, mọc vòng ở ngọn; cuống dài 5 – 10 cm. Lá chét 5, có cuống ngắn, hình thuôn hay mác thuôn, dài 5 – 13 cm, rộng 2 – 4 cm, nhọn hai đầu, cuống hoa dài 1 – 1,5 cm.
Hoa màu vàng xanh với 5 lá đài nhỏ, 5 cánh hoa, 5 nhị và bầu 2 ô. Quả mọng, gần hình cầu dẹp, đường kính 0,6 – 1,2 cm, khi chín màu đỏ. Hạt gồm 1 hoặc 2 hạt màu xám trắng (Hình 1. Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.
Sinh thái và phân bố Tam thất hoang (TTH) ưa ẩm và sáng. Cây mọc rải rác trên đất có nhiều mùn, dưới tán rừng kín thường xanh, ở độ cao 1600 – 2300 m. Tái sinh bằng hạt. Ra hoa tháng 4 – 5, có quả tháng 5 – 9.
Cho đến nay, trên toàn thế giới, loài này mới chỉ tìm thấy ở tỉnh Vân Nam (Trung Quốc) và một vài điểm ở Vườn Quốc gia Hoàng Liên Sơn thuộc tỉnh Lào Cai, Việt Nam [2,9]. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Thành phần hóa học Trong thân rễ của TTH chứa các saponin khung oleanan (hầu hết đều là saponin dẫn chất acid oleanolic) với hàm lượng tương đối cao cùng một số saponin khung dammaran với hàm lượng thấp [19]. Năm 1985, từ dịch chiết methanol của thân rễ TTH đã phân lập được 2 saponin dẫn chất của acid oleanolic là stipuleanosid R1và stipuleanosid R2 [19].
Năm 2002, nhóm nghiên cứu của Đại học Toyama, Nhật Bản phân tích thành phần dịch chiết ethanol của TTH thu hái ở Trung Quốc đã xác định được một hàm lượng nhỏ các saponin khung dammaran gồm các ginsenosid Rb1, Rc, Rb3 và Rd [43]. Năm 2010, nhóm nghiên cứu của Chun Liang và cộng sự đã phân lập được 11 hợp chất saponin là dẫn chất của acid oleanolic, trong đó có một chất mới là spinasaponin A methyl ester từ rễ TTH thu hái ở Việt Nam [15]. Năm 2013, nhóm tiếp tục xác định được thêm 4 hợp chất saponin khung oleanan khác [45]. Ngoài ra 3 polyacetylen, 1 sesquiterpen và 1 acid béo cũng được phân lập [15] (Hình 1.
Cấu trúc hóa học của 15 chất phân lập từ P. 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Tác dụng dƣợc lý Trên thế giới, năm 2010, từ 11 hợp chất saponin phân lập được từ TTH (1 – 11, hình 1.2) nhóm nghiên cứu của Chun Liang đã tiến hành thử tác dụng gây độc trên các tế bào ung thư bạch cầu cấp tiền tủy bào (HL-60) và ung thư ruột kết người (HCT-116) thu được kết quả: Chất 1 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào đáng kể với giá trị IC50 lần lượt là 4,44 và 0,63 µM trên 2 dòng tế bào HL-60 và HCT-116 [15]. Năm 2013, Chun Liang và cộng sự tiếp tục đánh giá hoạt tính của 15 chất (1 – 15, hình 1.2) lên yếu tố nhân kappa B (NF-κB) trên tế bào HepG2 cho kết quả: Các chất từ 6 – 11 ức chế NF-κB với IC50 từ 3,1 – 18,9 µM.
Các chất 8, 10 và 11 ức chế sự biểu hiện của mARN iNOS (inducible nitric oxide synthase) và COX-2 (cyclooxygenase-2) phụ thuộc nồng độ. Điều này đem lại tiềm năng trong điều trị như là chất chống viêm, chống xơ vữa động mạch và chống loạn thần [45]. Năm 2011, 2 polyacetylen mới được phân lập từ TTH là stipudiol và stipuol ức chế đáng kể sự tăng sinh của tế bào ung thư HL-60 và HCT-116 thông qua kích hoạt quá trình apotosis của tế bào [46]. Tại Việt Nam, nghiên cứu của Trần Công Luận năm 2002 cho thấy: Cao TTH có tác dụng phục hồi thời gian ngủ do stress, đưa về trạng thái bình thường ở các mức liều thử 44; 88 và 176 mg/kg.
Ở các nồng độ 25; 50 và 100 μg/ml cao saponin toàn phần của TTH có tác dụng chống oxy hóa, ức chế sự hình thành malonyl dialdehyd. Cao thân rễ và rễ củ TTH thể hiện độc tính cấp đường uống với liều LD50 = 8,8 g/kg [5]. Nghiên cứu của Lê Thị Tâm và Nguyễn Thị Tuyết Trinh (2016) cho kết quả TTH có tác dụng chống đông và ức chế ngưng tập tiểu cầu in vitro [7,11]. Công dụng Sách đỏ Việt Nam (2007) có ghi “Tất cả các bộ phận của cây đều có công dụng làm thuốc; thân rễ thường được dùng làm thuốc bổ, cầm máu, tăng cường sinh dục, chống stress.
Lá, nụ hoa dùng làm trà uống có tác dụng kích thích tiêu hóa, an thần”. TTH có tác dụng tán ứ, định thống. Bộ phận dùng là thân rễ Rhizoma Panacis Stipuleanati [2]. 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.
Tổng quan về nội mạc mạch máu và eNOS 1. Nội mạc mạch máu 1.1 Đặc điểm cấu trúc Về giải phẫu học từ trong ra ngoài, thành động mạch có cấu tạo gồm 3 lớp áo đồng tâm: Lớp áo ngoài là lớp vỏ xơ, có các sợi thần kinh chi phối; lớp áo giữa gồm những sợi cơ trơn và sợi đàn hồi; lớp áo trong là lớp tế bào nội mô (Hình 1. Cấu trúc thành động mạch [1] Tương tự như thành động mạch, thành tĩnh mạch, mao mạch và mạch bạch huyết cũng có một lớp tế bào nội mô lợp mặt trong lòng mạch. Lớp nội mô thuộc biểu mô lát đơn, gồm một hàng tế bào nội mô hình đa giác dẹt, có phần bào tương chứa nhân lồi vào trong lòng mạch, phần bào tương ở ngoại vi tỏa thành lá mỏng.
Các tế bào nội mô liên kết với nhau bằng những dải bịt hoặc liên kết khe [1]. Ở người trưởng thành, nội mạc mạch máu gồm khoảng mười ngàn tỷ (1013) tế bào, bao phủ một diện tích khoảng 1 - 7 m2 hình thành nên một tổ chức nặng khoảng 1 kg [27,52]. Chức năng của nội mạc mạch máu Nội mạc mạch máu có vai trò quan trọng trong việc kiểm soát sự lưu thông dòng máu, trương lực mạch máu, sự kết tập tiểu cầu cũng như tham gia điều hòa các quá trình viêm, miễn dịch, sinh mạch, chuyển hóa và duy trì sự hằng định nội môi [30]. Các tế bào nội mô thực hiện cả hai chức năng trao đổi chất và tổng hợp [52].
Nội mạc mạch máu hình thành nên một hàng rào bán thấm kiểm soát sự di chuyển của các chất hòa tan, các đại phân tử và cả các tế bào giữa dòng máu với các mô xung quanh [27,30]. Irie và Tavassoli gọi đó là hàng rào máu – mô [65]. Rối loạn tính thấm nội mạc có thể gây ra nhiều bệnh lý như phù, sốc, xung huyết. 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Các tế bào nội mô có khả năng sản xuất ra nhiều phân tử khác nhau như các chất giãn mạch: nitric oxide (NO), prostacyclin (PGI2), EDHF (yếu tố cường phân cực có nguồn gốc nội mô/ endothelium-derived hyperpolarizing factor); các chất co mạch: Endothelin, thromboxan A2, angiotensin II; các phần tử kết dính: E-selectin, P-selectin, ICAM -1 (phân tử kết dính liên bào/ intercellular adhesion molecule) và VCAM-1 (phân tử kết dính tế bào mạch/ vascular cell adhesion molecule); cytokin và yếu tố tăng trưởng: GM-CSF (Yếu tố kích thích quần thể bạch cầu hạt – đại thực bào/ Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), interleukin (IL-1, IL-6) và SCF (Yếu tố tế bào gốc/ Stem cell factor); các chemokin: α và β chemokin, fractalkin; các yếu tố liên quan đến quá trình cầm máu: t-PA (yếu tố hoạt hóa plasminogen mô), PAI-1 (chất ức chế yếu tố hoạt hóa plasminogen), yếu tố Willebrand, thromboxan A2, NO, PGI2, TF (yếu tố mô), TFPI (chất ức chế con đường yếu tố mô); hay các yếu tố liên quan đến sự tăng sinh cơ trơn và sinh mạch: VEGF (yếu tố tăng trưởng nội mạc mạch/ vascular endothelial growth factor), PDGF (yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu/ platelet derived growth factor) [17,26,27,38].