Chương 1 – Tổng quan 1. KỸ THUẬT LAI HUỲNH QUANG TẠI CHỖ (FISH) 1. Nguyên lý Cũng như các kỹ thuật lai acid nucleic khác, kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (Fluorescence In Situ Hybryzation – FISH) dựa trên đặc tính biến tính và hoàn nguyên của acid nucleic [85]. Trong phản ứng lai, sự tương đồng trình tự giữa đầu dò và ADN đích cho phép chúng kết hợp chính xác với nhau tạo thành phức hệ lai.
Tín hiệu huỳnh quang gắn trên đầu dò được phân tích dưới kính hiển vi huỳnh quang, cho phép phát hiện và xác định vị trí của gen đích trên mẫu nghiên cứu (Hình 3) [94]. Quy trình của kỹ thuật FISH Nguyễn Tiến Lung 12 K20 Sinh học thực nghiệm LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Chương 1 – Tổng quan Mẫu phân tích (máu ngoại vi, tế bào nuôi cấy, tiêu bản cố định mô,.) được biến tính ADN và ủ với đầu dò đánh dấu có trình tự đặc hiệu. ADN cạnh tranh (thường sử dụng ADN tinh trùng cá hồi) và thêm vào hỗn hợp lai nhằm giảm liên kết không đặc hiệu giữa đầu dò và ADN đích. Sau khi lai và rửa nguyên liệu thừa, mẫu được phát hiện trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua kháng thể thứ cấp đặc hiệu gắn huỳnh quang [15, 94].
Đầu dò cho phản ứng lai 1. Đầu dò đánh dấu trực tiếp và gián tiếp Những nghiên cứu đầu tiên về kỹ thuật lai tại chỗ được công bố vào cuối những năm 1960, đều sử dụng đầu dò đánh dấu phóng xạ (32P, 35S, 3H), tuy nhiên các chất phóng xạ có nhiều nhược điểm về độ an toàn, thời gian và chi phí tiến hành. Từ những năm 1980, sau thí nghiệm lai sử dụng đầu dò ADN gắn biotin và kháng thể đánh dấu huỳnh quang của Langer và Safer, các chất đánh dấu huỳnh quang đã dần thay thế các chất phóng xạ. Đầu dò huỳnh quang thể hiện một số ưu điểm nổi bật hơn hẳn so với loại đầu dò phóng xạ: độ bền và độ an toàn cao, ít gây hại với môi trường và con người, kết quả lai thu được chính xác, đánh dấu được với nhiều loại thuốc nhuộm phát xạ tại những bước sóng khác nhau cho phép phát hiện nhiều trình tự đích chỉ với một lần lai.
Đặc biệt, sử dụng chất đánh dấu huỳnh quang thu được tín hiệu ở chính xác vị trí bắt cặp, trong khi các đầu dò phóng xạ có thể chỉ cho phép quan sát được tín hiệu trong ảnh chụp nhiễu xạ cách vị trí bắt cặp một khoảng nhất định. Có hai loại đầu dò huỳnh quang theo phương pháp phát hiện vị trí lai: trực tiếp và gián tiếp [59]. Trong phương pháp gián tiếp, các phân tử đánh dấu (như biotin, digoxigenin – DIG, dinitrophenol) được gắn vào đầu dò, sau đó mẫu lai được phát hiện bằng kháng thể thứ cấp đánh dấu huỳnh quang tương ứng. Hệ thống phổ biến nhất hiện nay sử dụng biotin (Hình 4), được phát triển bởi David Ward và cộng sự từ năm 1981 [44].
Đầu dò gắn biotin sau phản ứng lai được phát hiện bởi nhiều thuốc thử khác nhau, thường sử dụng nhất là streptavidin và avidin do chúng có khả năng liên Nguyễn Tiến Lung 13 K20 Sinh học thực nghiệm LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Chương 1 – Tổng quan kết với biotin tốt nhất (trong đó streptavidin được ưa thích hơn do điểm đẳng điện gần như trung tính giúp giảm liên kết không đặc hiệu [59]. Ngoài hệ thống sử dụng biotin, các đầu dò gắn DIG (Hình 4) cũng thường xuyên được sử dụng. DIG là steroid có nguồn gốc duy nhất từ hoa và lá của một số thực vật chi Digitalis (như D. lanata), do đó kháng thể kháng DIG hầu như không gắn kết với các vật liệu sinh học khác.
Trong lai FISH, các kháng thể kháng DIG có thể được kết hợp với alkaline phosphatase, peroxydase, Rhodamine,… [31]. Phương pháp sử dụng đầu dò gián tiếp có ưu điểm là tạo ra các tín hiệu huỳnh quang cường độ cao, nhưng chúng gặp bất lợi khi cần thêm bước ủ để liên kết phức hệ lai và kháng thể thứ cấp gắn huỳnh quang [59]. Cấu trúc một số chất đánh dấu huỳnh quang thường được sử dụng Đối với phương pháp trực tiếp, các phân tử báo cáo được gắn trực tiếp vào đầu dò và từ đó có thể quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang ngay sau phản ứng lai mà không cần thêm bước ủ kháng thể thứ cấp. Những chất huỳnh quang thường được sử dụng trong trường hợp này là các hợp chất thuộc các nhóm coumarin, fluorescein, rhodamine và cyanine (Bảng 1).
Ưu điểm của phương pháp này là thao tác đơn giản hơn phương pháp gián tiếp, hiện tượng nhiễu nền thấp. Tuy nhiên, tín Nguyễn Tiến Lung 14 K20 Sinh học thực nghiệm LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Chương 1 – Tổng quan hiệu thu được có cường độ yếu hơn. Người ta có thể cái tiến bằng cách sử dụng thêm kháng thể thứ cấp gắn chất phát huỳnh quang mạnh, khi đó nó không khác phương pháp phát hiện gián tiếp như đã trình bày ở trên [59]. Một số chất đánh dấu huỳnh quang và thuốc nhuộm sử dụng trong FISH Huỳnh quang Ex (nm) Em (nm) Các chất đánh dấu 7–Amino–4–methylcoumarin–3–acetic acid, NHS (AMCA) 354 411 7–Diethylaminocoumarin–3–carboxylic acid, NHS 432 472 Pacific Blue™ , NHS 416 451 Fluorescein–5/6–isothiocyanate (FITC) 494 519 Tetramethylrhodamine–5/6–isothiocyanate (TRITC) 544 572 Oregon Green® 488 isothiocyanate 493 520 Rhodamine Green™ carboxylic acid, NHS 504 532 Alexa Fluor® 488 494 519 Alexa Fluor® 568 577 602 Alexa Fluor® 594 590 615 Texas Red® sulfonyl chloride 587 602 Cy3™ 550 570 Cy5™ 649 670 Các thuốc nhuộm ADN 4',6–Diamidino–2–phenylindole (DAPI) 367 452 Propidium iodide (PI) 543 614 Ex: đỉnh hấp thụ; Em: đỉnh phát quang; NHS: N–Hydroxysuccinimidyl Ester Gần đây, người ta có thể sử dụng kết hợp nhiều đầu dò gắn các chất huỳnh quang khác nhau, từ đó thu được nhiều tín hiệu khác nhau trên cùng một mẫu lai.
Phương pháp này được ứng dụng hiệu quả khi phân tích kiểu nhân sinh vật [59]. Nguyễn Tiến Lung 15 K20 Sinh học thực nghiệm LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Chương 1 – Tổng quan 1. Các phương pháp đánh dấu đầu dò Ba phương pháp thông dụng được sử dụng để đánh dấu đầu dò là dịch chuyển điểm đứt (nick translation), kéo dài mồi ngẫu nhiên (random primed) và PCR. Cả ba phương pháp này đều sử dụng hoạt tính enzyme để gắn deoxyribo– nucleotide triphosphate đánh dấu lên phân tử đầu dò.
Phương pháp dịch chuyển điểm đứt Phương pháp dịch chuyển điểm đứt sử dụng đồng thời hoạt tính của hai loại enzyme là ADN polymerase và DNase. Đầu tiên, DNase I tạo ra một điểm đứt trên phân tử ADN làm bộc lộ đầu 3’–OH. Điểm đứt được dịch chuyển dần nhờ hoạt tính 5’ – 3’ exonuclease của enzyme ADN polymerase I. Trong khi đó, enzyme ADN polymerase I bám vào đầu 3’–OH và tổng hợp kéo dài chuỗi nhờ hoạt tính 5’ – 3’ polymerase Klenow của nó.
Trong suốt quá trình tổng hợp, nucleotide đánh dấu được bổ sung vào hỗn hợp phản ứng sẽ thay thế một trong số các phân tử dNTP và được cài nhập vào sợi ADN đang được tổng hợp, kết quả là tạo thành phân tử đầu dò được đánh dấu. Đây là phương pháp được sử dụng phổ biến trong đánh dấu đầu dò cho FISH, với ưu điểm là tạo ra được đầu dò có kích thước tối ưu bằng cách điều chỉnh nồng độ DNase. Phản ứng đánh dấu thực hiện tối ưu trong 60–90 phút, với kích thước đầu dò khoảng 200–500 bp [21, 22, 59]. Phương pháp tổng hợp kéo dài mồi ngẫu nhiên Phương pháp tổng hợp kéo dài mồi ngẫu nhiên (còn được gọi là đánh dấu oligo) dựa trên phản ứng lai của hexanucleotide với sợi ADN khuôn nhờ hoạt tính kéo dài chuỗi của tiểu đơn vị Klenow thuộc enzyme ADN polymerase I.
Bước đầu tiên của phương pháp là gây biến tính ADN tạo ra sợi đơn, sau đó cho các đoạn hexanucleotide bắt cặp ngẫu nhiên với ADN khuôn, các đoạn này được dùng như mồi cho đoạn Klenow của ADN polymerase I tổng hợp kéo dài ADN, với nguyên liệu là các nucleotide đánh dấu [22, 93]. Đầu dò thu được có kích thước tối ưu trong khoảng 200–1000 bp, với lượng từ 30–70 ng (với 10 ng mẫu ban đầu, ủ trong 1 giờ) đến 2,10–2,65 mg (3 mg mẫu ban đầu, ủ 20 giờ). Nhược điểm lớn của phương pháp Nguyễn Tiến Lung 16 K20 Sinh học thực nghiệm LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Chương 1 – Tổng quan này là khó kiểm soát kích thước đầu dò, do đó tín hiệu thu được yếu và thường bị nhiễu. Tuy nhiên, phương pháp này vẫn được lựa chọn với mục đích phát hiện các gen đơn bản trong hệ gen bằng kỹ thuật Southern blot [22, 59, 93].
Phương pháp PCR Các deoxynucleotide gắn huỳnh quang có thể được enzyme ADN Taq polymerase sử dụng như một cơ chất phản ứng trong PCR, tạo ra các phân tử ADN được đánh dấu. Phương pháp này vừa có độ đặc hiệu, độ nhạy cao hơn các phương pháp đánh dấu khác, vừa cho phép tạo ra đầu dò với hiệu suất lớn (lên tới một triệu bản sao sau 20 chu kỳ phản ứng). Hơn nữa, với phương pháp PCR, người sử dụng có thể kiểm soát kích thước đầu dò thông qua vị trí đầu 5’ của cặp mồi dùng trong phản ứng, nhờ đó tạo ra đầu dò có kích thước tối ưu phù hợp với mục đích thí nghiệm (thông thường kích thước đầu dò tổng hợp theo phương pháp này khoảng 200–600 bp) [19, 59]. Các loại đầu dò Một số loại đầu dò thường sử dụng là đầu dò đặc hiệu locus, đầu dò trình tự lặp lại và đầu dò toàn bộ nhiễm sắc thể.
Đầu dò đặc hiệu locus được tạo ra từ một phần của gen và được sử dụng để phát hiện một vùng nhất định trên nhiễm sắc thể. Vị trí của gen đích trên nhiễm sắc thể được xác định thông qua phản ứng lai của nhiễm sắc thể với đầu dò [23]. Kích thước đầu dò thay đổi thùy theo tính chất của vector nhân bản, từ plasmid (1 – 10 kb) cho đến PAC, BAC, YAC (80 kb – 1 Mb). Đầu dò này đặc biệt hiệu quả cho việc phát hiện các tái cấu trúc nhiễm sắc thể như chuyển đoạn, đảo đoạn hay mất đoạn.
Sử dụng các đầu dò cho các vị trí khác nhau với các màu huỳnh quang khác nhau, người ta dễ dàng phát hiện các hiện tượng bất thường này [26, 37]. Đầu dò trình tự lặp lại trên nhiễm sắc thể được tạo thành từ các trình tự lặp lại ở tâm động hoặc đầu mút.