Nghiên cứu sự hình thành màng sinh học (biofilm) và tính đề kháng kháng sinh của vi khuẩn

Nghiên cứu sự hình thành màng sinh học biofilm và tính đề kháng kháng sinh của vi khuẩn sản sinh biofilm trong luận văn thạc sĩ VNUA.

• Tác giả: Nguyễn Thị Đức Hạnh
• Người hướng dẫn: Pgs. Nguyễn Bá Hiên
• Trường học: Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Thú Y
• Đề tài: Nghiên Cứu Sự Hình Thành Màng Sinh Học (Biofilm) Và Tính Đề Kháng Kháng Sinh Của Vi Khuẩn Sản Sinh Biofilm
• Loại tài liệu: Luận Văn
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỤC LỤC
• 2. TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
• 3. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
• 4. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
• 5. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 5.1. KHÁI NIỆM VỀ MÀNG SINH HỌC (BIOFILM)
• 5.2. CÁC DẠNG MÀNG SINH HỌC TRONG TỰ NHIÊN
• 5.3. QUÁ TRÌNH HÌNH THÀNH MÀNG SINH HỌC
• 6. NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 6.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
• 6.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
• 6.3. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
• 6.4. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
• 6.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 7. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 7.1. KẾT QUẢ PHÂN LẬP VÀ THUẦN KHIẾT VI KHUẨN
• 7.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG CỦA VI KHUẨN
• 7.3. KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG KHẢ NĂNG SẢN SINH MÀNG SINH HỌC
• 7.4. BIẾN ĐỘNG CỦA QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT MÀNG SINH HỌC
• 7.5. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN HÌNH THÀNH MÀNG SINH HỌC
• 8. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về sự hình thành màng sinh học vi khuẩn và kháng sinh

Màng sinh học vi khuẩn là một cấu trúc phức tạp, bao gồm các tế bào vi khuẩn bám dính trên bề mặt và được bao bọc bởi một lớp polysaccharide. Sự hình thành màng sinh học không chỉ giúp vi khuẩn tồn tại lâu dài mà còn tạo ra khả năng đề kháng với kháng sinh. Theo Costerton (1999), vi khuẩn trong màng sinh học có thể chịu được nồng độ kháng sinh cao gấp nhiều lần so với vi khuẩn không có màng sinh học. Điều này đặt ra thách thức lớn trong việc điều trị nhiễm trùng do vi khuẩn gây ra.

1.1. Khái niệm và cấu trúc của màng sinh học vi khuẩn

Màng sinh học (biofilm) là tập hợp các tế bào vi khuẩn bám dính trên bề mặt và được bao bọc bởi chất ngoại bào. Cấu trúc này giúp vi khuẩn duy trì sự sống và phát triển trong môi trường khắc nghiệt. Các nghiên cứu cho thấy rằng màng sinh học có thể hình thành trên nhiều bề mặt khác nhau, từ tự nhiên đến nhân tạo.

1.2. Vai trò của màng sinh học trong khả năng đề kháng kháng sinh

Màng sinh học tạo ra một môi trường bảo vệ cho vi khuẩn, giúp chúng chống lại tác động của kháng sinh. Vi khuẩn trong màng sinh học có thể sống sót ngay cả khi tiếp xúc với nồng độ kháng sinh cao, điều này làm tăng nguy cơ kháng thuốc trong điều trị nhiễm trùng.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu màng sinh học vi khuẩn

Nghiên cứu về màng sinh học vi khuẩn gặp nhiều thách thức, đặc biệt là trong việc xác định các yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành và tính đề kháng kháng sinh. Việc lạm dụng kháng sinh trong điều trị nhiễm trùng đã dẫn đến sự gia tăng tình trạng kháng thuốc, làm cho việc điều trị trở nên khó khăn hơn. Các nghiên cứu hiện tại cần tập trung vào việc hiểu rõ hơn về cơ chế hình thành màng sinh học và cách thức vi khuẩn phát triển khả năng đề kháng.

2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành màng sinh học

Sự hình thành màng sinh học phụ thuộc vào nhiều yếu tố như loại bề mặt, điều kiện môi trường, và sự hiện diện của các chất dinh dưỡng. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng vi khuẩn có thể thay đổi hành vi của mình tùy thuộc vào các yếu tố này, từ đó ảnh hưởng đến khả năng hình thành màng sinh học.

2.2. Tác động của kháng sinh đến màng sinh học

Kháng sinh có thể ảnh hưởng đến sự phát triển của màng sinh học, nhưng không phải lúc nào cũng tiêu diệt được vi khuẩn trong màng. Một số nghiên cứu cho thấy rằng vi khuẩn trong màng sinh học có thể phát triển khả năng đề kháng với kháng sinh, làm cho việc điều trị trở nên phức tạp.

III. Phương pháp nghiên cứu sự hình thành màng sinh học vi khuẩn

Để nghiên cứu sự hình thành màng sinh học, các nhà khoa học sử dụng nhiều phương pháp khác nhau, bao gồm phương pháp nuôi cấy vi khuẩn, phân tích di truyền và sinh học phân tử. Những phương pháp này giúp xác định khả năng sản sinh màng sinh học và đánh giá tính đề kháng kháng sinh của vi khuẩn.

3.1. Phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn

Việc nuôi cấy và phân lập vi khuẩn là bước đầu tiên trong nghiên cứu màng sinh học. Các nhà nghiên cứu thường sử dụng môi trường nuôi cấy đặc biệt để kích thích sự phát triển của vi khuẩn và quan sát quá trình hình thành màng sinh học.

3.2. Phân tích di truyền và sinh học phân tử

Các phương pháp phân tích di truyền và sinh học phân tử giúp xác định các gen liên quan đến khả năng hình thành màng sinh học và tính đề kháng kháng sinh. Những nghiên cứu này cung cấp cái nhìn sâu sắc về cơ chế hoạt động của vi khuẩn trong màng sinh học.

IV. Ứng dụng thực tiễn của nghiên cứu màng sinh học vi khuẩn

Nghiên cứu về màng sinh học vi khuẩn không chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn có ứng dụng thực tiễn trong lĩnh vực y tế và thú y. Kết quả nghiên cứu có thể giúp cải thiện các phương pháp điều trị nhiễm trùng và nâng cao hiệu quả sử dụng kháng sinh.

4.1. Cải thiện phương pháp điều trị nhiễm trùng

Hiểu rõ về màng sinh học vi khuẩn có thể giúp phát triển các phương pháp điều trị mới, hiệu quả hơn trong việc tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh. Các nghiên cứu hiện tại đang tìm kiếm các hợp chất có khả năng phá vỡ màng sinh học để tăng cường hiệu quả của kháng sinh.

4.2. Nâng cao ý thức sử dụng kháng sinh trong thú y

Kết quả nghiên cứu cũng có thể giúp nâng cao ý thức của người chăn nuôi về việc sử dụng kháng sinh hợp lý, từ đó giảm thiểu tình trạng kháng thuốc trong vi khuẩn gây bệnh. Việc giáo dục và nâng cao nhận thức là rất quan trọng trong việc kiểm soát sự phát triển của màng sinh học vi khuẩn.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu màng sinh học vi khuẩn

Nghiên cứu về màng sinh học vi khuẩn và tính đề kháng kháng sinh đang trở thành một lĩnh vực quan trọng trong vi sinh vật học. Những hiểu biết mới về cơ chế hình thành màng sinh học và khả năng đề kháng của vi khuẩn sẽ mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả hơn. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho y tế và thú y.

5.1. Hướng nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực màng sinh học

Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc phát triển các phương pháp mới để kiểm soát sự hình thành màng sinh học và tính đề kháng kháng sinh. Việc tìm kiếm các hợp chất tự nhiên có khả năng phá vỡ màng sinh học cũng là một hướng đi tiềm năng.

5.2. Tầm quan trọng của nghiên cứu liên ngành

Nghiên cứu màng sinh học vi khuẩn cần sự hợp tác giữa các lĩnh vực khác nhau như vi sinh vật học, y học, và công nghệ sinh học. Sự kết hợp này sẽ giúp tạo ra những giải pháp toàn diện hơn trong việc kiểm soát vi khuẩn gây bệnh.

Trích đoạn nội dung tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ ĐỨC HẠNH NGHIÊN CỨU SỰ HÌNH THÀNH MÀNG SINH HỌC (BIOFILM) VÀ TÍNH ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN SẢN SINH BIOFILM Ngành: Thú Y Mã số: 60640101 Người hướng dẫn khoa học: PGS. Nguyễn Bá Hiên NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2017 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Đức Hạnh i LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình.

Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Khoa Thú Y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn. Đặc biệt tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy hướng dẫn khoa học PGS. Nguyễn Bá Hiên đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô, anh chị trong bộ môn Vi Sinh Vật - Truyền Nhiễm đã giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện đề tài.

Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn. Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Đức Hạnh ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] MỤC LỤC Lời cam đoan. ii Mục lục. iii Danh mục chữ viết tắt.

v Danh mục bảng. vi Danh mục hình. vii Trích yếu luận văn. viii Thesis abstract.

Tính cấp thiết của đề tài. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài. TỔNG QUAN TÀI LIỆU. Khái niệm về màng sinh học (BIOFILM).

Các dạng màng sinh học trong tự nhiên. Qúa trình hình thành màng sinh học. Cấu trúc của màng sinh học. Vai trò của màng sinh học đối với vi sinh vật trong tự nhiên.

Các phương pháp nghiên cứu sự hình thành màng sinh học. Các yếu tố ảnh hưởng đến hình thành màng sinh học. Tác hại của màng sinh học. Biện pháp kiểm soát sự hình thành màng sinh học.

Ứng dụng có lợi của màng sinh học. NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Đối tượng nghiên cứu. Nội dung nghiên cứu.

Địa điểm nghiên cứu. Thời gian nghiên cứu. Phương pháp nghiên cứu. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.

32 iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Kết quả phân lập và thuần khiết vi khuẩn. Kết quả nghiên cứu khả năng sinh trưởng của vi khuẩn. Kết quả định lượng khả năng sản sinh màng sinh học.

Biến động của quá trình sản xuất màng sinh học. Kết quả nghiên cứu khả năng đề kháng kháng sinh của vi khuẩn hình thành màng sinh học. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 46 Tài liệu tham khảo.

55 iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt CRA Congo Red Agar MIC Minimum inhibitory concentration OD Optical density PBS Phosphate buffered saline PW Peptone water TCP Tissue Culture Plate TM Tube method TSB Tryptic soy broth TW Tryptone water Y Yeast extract v LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC BẢNG Bảng 4. Kết quả phân lập và thuần khiết vi khuẩn 35 Bảng 4. Kết quả xác định khả năng đề kháng kháng sinh 44 vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC HÌNH Hình 2. Màng sinh học (biofilm) của vi khuẩn 4 Hình 2.

Một số ví dụ về màng sinh học 6 Hình 2. Mô hình phát triển của màng sinh học 7 Hình 2.Mô hình cấu trúc của màng sinh học hoàn chỉnh 11 Hình 2. Cấu trúc phân lớp của màng sinh học 12 Hình 2. Cấu trúc phân lớp của màng sinh học 13 Hình 2.Vai trò của vi khuẩn không hoạt động trong lớp biofilm 14 Hình 2.

Khả năng đề kháng với hiện tượng thực bào của biofilm 15 Hình 2. Phương pháp ống nghiệm nghiên cứu sự hình thành biofilm 17 Hình 2. Phương pháp bổ sung đỏ Congo nghiên cứu sự hình thành biofilm 18 Hình 2. Mức độ sản sinh biofilm trên thạch bổ sung đỏ Congo 18 Hình 2.

Dụng cụ cải tiến dùng trong nghiên cứu biofilm 19 Hình 2. Phương pháp slide- band xác định sự hình thành biofilm 19 Hình 3. Các bước nghiên cứu biến động biofilm theo thời gian 30 Hình 3. Tóm tắt các bước nghiên cứu khả năng đề kháng kháng sinh 31 Hình 4.

Kết quả phân lập vi khuẩn từ mẫu swab 32 Hình 4. Kết quả thuần khiết tụ cầu khuẩn từ mẫu swab. Hình thái của chủng tụ cầu khuẩn thuần khiết. Đường cong sinh trưởng của tụ cầu khuẩn ở môi trường TSB-Y.

Kết quả kiểm tra khả năng tạo màng sinh học. Màng sinh học nhuộm bằng tím kết tinh 1% (200X). Mức tạo màng sinh học của tụ cầu khuẩn 39 Hình 4. Biến động về lượng biofilm sản sinh theo thời gian.

Biến động màu thuốc nhuộm giữ lại bởi lớp biofilm 41 Hình 4. Kết quả thử tính mẫn cảm với kháng sinh. 43 vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Nguyễn Thị Đức Hạnh Tên Luận văn: Nghiên cứu sự hình thành màng sinh học (biofilm) và tính đề kháng kháng sinh của vi khuẩn sản sinh biofilm. Ngành: Thú y Mã số: 60.01 Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam.

Mục đích nghiên cứu Xác định khả năng hình thành màng sinh học (biofilm) của vi khuẩn Gram dương phân lập được. Nghiên cứu khả năng đề kháng kháng sinh của vi khuẩn sản sinh biofilm. Phương pháp nghiên cứu * Đối tượng nghiên cứu Vi khuẩn Staphylococcus spp phân lập được ở đường hô hấp của gà nuôi tại huyện Gia Lâm, Hà Nội và một số tỉnh lân cận như Bắc Giang, Vĩnh Phúc và Hải Dương. * Nội dung nghiên cứu  Phân lập và thuần khiết vi khuẩn.

 Nghiên cứu khả năng sinh trưởng của vi khuẩn.  Định lượng khả năng sản sinh màng sinh học của vi khuẩn.  Nghiên cứu biến động của quá trình sản sinh màng sinh học theo thời gian.  Nghiên cứu khả năng đề kháng kháng sinh của vi khuẩn hình thành màng sinh học.

* Nguyên liệu + Môi trường lỏng: tryptone water, tryptic soy broth, peptone water (Merck). + Giấy tẩm kháng sinh, kháng sinh bột. + Đĩa nhựa 96 giếng vô trùng (SPL Life Sciences). viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] + Hóa chất dùng trong định lượng màng sinh học: methanol, đệm PBS 1x, dung dịch 1% tím kết tinh (crystal violet), dung dịch cồn 80% có bổ sung 5% sodium dodecyl sulfate.

* Phương pháp nghiên cứu. + Phương pháp phân lập, thuần khiết vi khuẩn. + Phương pháp xác định khả năng sản sinh màng biofilm. + Phương pháp nghiên cứu biến động lượng biofilm sản sinh theo thời gian.

+ Phương pháp xác định khả năng đề kháng kháng sinh. Kết quả chính và kết luận - Có 51,61% số chủng tụ cầu khuẩn phân lập từ đường hô hấp của gà có khả năng sản sinh màng sinh học (biofilm) ở mức mạnh, trung bình và yếu. - Quá trình hình thành biofilm có đặc điểm: lớp biofilm sản sinh tăng trong khoảng 4 giờ đến 20 giờ, sau đó giảm từ 24 giờ đến 40 giờ. - Vi khuẩn nằm trong màng sinh học đề kháng với nồng độ kháng sinh cao gấp 10 lần và 100 lần nồng độ MIC.

ix LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] THESIS ABSTRACT Master candidate: Nguyen Thi Duc Hanh Thesis title: Research of the formation of biofilm and antibiotic tolerance of biofilm- producing bacteria. Major: Veterinary Medicine Code: 60.01 Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA). Research Objectives To determine the ability to formation the biofilm of isolated gram-positive bacteria. To research the antibiotic tolerance of biofilm-producing bacteria.

Research Methods * Research subjects The gram-positive bacteria is isolated in the respiratory tract of chickens which are raised in Gia Lam district, Ha Noi capital and some neighboring provinces such as Bac Giang, Vinh Phuc and Hai Duong. * Research content + Isolattion and purification bacteria. + Quantify the biofilm production ability of bacteria. + Research the characteristics of biofilm production by time.

+ Research antibiotic resistance ability of biofilm-producing bacteria. * Research materials + Liquid environment: tryptone water, tryptic soy broth, peptone water (Merck). + Antibiotic impregnated paper, antibiotic powder. + 96 wells aseptic plastic disk.

+ Chemicals used in quantifying biofilm membrane: methanol, 1x PBS buffer, 1% crystal violet solution, 80% alcohol solution with additional 5% sodium dodecyl sulfate. x LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] + ELISA reader (Biotek, ELx808). Research method + Method of isolating and purifying aerobic bacteria. + Method of determining the biofilm production ability of bacteria.

+ Method of research the variation of biofilm amount produced by time. + Method of determining the antibiotic resistance ability. Main findings and conclusions - There were 51.61% of Staphylococcus spp isolated from the respiratory tract of chickens produced biofilm at strong, medium and weak level. - Biofilm formation process has characteristics: biofilm production increased from 4 to 20 hours, then reduced from 24 hours to 40 hours.

- Antibiotic concentration of 100 times higher and 10 times minimum inhibitory concentration only reduced the attenuation of bacteria respectively 7.2 times compared with the bacterial attenuation concentration in the absence of antibiotics. xi LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Màng sinh học (biofilm) là một dạng sống tồn tại phổ biến trong tự nhiên của vi sinh vật, đó là tập hợp các tế bào vi khuẩn của một hoặc một số loài phát triển trên một bề mặt vật chất và được cấu tạo từ sự liên kết của các tế bào với các polysaccharide, protein và nucleic acid của chính các tế bào đó. Do được lớp polysaccharide bao bọc nên những vi khuẩn này có khả năng bám dính, tồn tại lâu dài trên bề mặt, đề kháng tốt với hiện tượng thực bào và sự tác động của kháng sinh (Costerton, 1999).