Tổng quan nghiên cứu

Thói quen tiêu thụ đường quá mức trong chế độ ăn uống hiện đại đang làm gia tăng nhanh chóng tỷ lệ thừa cân, béo phì và đái tháo đường trên toàn cầu cũng như tại Việt Nam. Để phòng ngừa các nguy cơ bệnh lý chuyển hóa, xu hướng thay thế đường mía thông thường bằng các hợp chất tạo ngọt tự nhiên không sinh năng lượng đang trở thành tâm điểm chú ý của ngành thực phẩm và dinh dưỡng. Trong đó, nhóm steviol glycosides chiết xuất từ lá cây cỏ ngọt (Stevia rebaudiana) nổi bật nhờ độ ngọt cao gấp từ 75 đến 300 lần so với đường saccharose truyền thống, bền nhiệt và an toàn cho sức khỏe.

Mặc dù có nguồn gốc thảo mộc, Ủy ban Chuyên gia Quốc tế về Phụ gia Thực phẩm (JECFA) và Cơ quan An toàn Thực phẩm Châu Âu (EFSA) vẫn quy định mức thu nhận hàng ngày chấp nhận được (ADI) của steviol glycosides là 4 mg/kg thể trọng. Tại Việt Nam, Thông tư 24/2019/TT-BYT cũng ban hành mức giới hạn nghiêm ngặt cho phụ gia này trong từng nhóm sản phẩm (ví dụ: tối đa 200 mg/kg đối với đồ uống có hương liệu và 2500 mg/kg đối với thực phẩm bổ sung). Tuy nhiên, các phương pháp phân tích đồng thời nhóm hợp chất này trên các nền thực phẩm phức tạp trong nước còn khá hạn chế.

Đề tài "Nghiên cứu xác định một số steviol glycosides trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng" do học viên Lưu Thị Huyền Trang thực hiện tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội phối hợp cùng Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia vào năm 2020 đã giải quyết triệt để bài toán này. Nghiên cứu tập trung xây dựng và thẩm định quy trình phân tích đồng thời 7 hợp chất steviol glycosides chính gồm Stevioside, Rebaudioside A, Rebaudioside B, Rebaudioside C, Rubusoside, Steviolbioside và Dulcoside A trên địa bàn Hà Nội. Đề tài mang ý nghĩa thực tiễn to lớn khi cung cấp quy trình định lượng tin cậy với độ thu hồi đạt từ 88,6% đến 102,4%, hỗ trợ đắc lực cho công tác quản lý an toàn vệ sinh thực phẩm và bảo vệ quyền lợi người tiêu dùng.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu ứng dụng lý thuyết sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC) kết hợp nguyên lý hấp thụ quang học phân tử theo định luật Lambert-Beer qua đầu dò mảng đi-ốt quang (PDA). Nhóm steviol glycosides là các diterpene glycoside có cấu trúc khung aglycone (steviol) gắn với các gốc đường glucose hoặc rhamnose tại vị trí liên kết C-4 và C-13, tạo ra các phân tử có độ phân cực khác nhau.

Các khái niệm chuyên ngành then chốt được phát triển trong luận văn bao gồm:

  • Stevioside: Hợp chất tạo ngọt chiếm tỷ lệ lớn nhất (60-70% tổng lượng glycoside trong lá cỏ ngọt), ngọt gấp 300 lần đường mía nhưng mang dư vị đắng nhẹ và hậu vị thảo mộc kéo dài.
  • Rebaudioside A: Thành phần tạo ngọt có giá trị thương mại cao nhất (chiếm 30-40% tổng glycoside), ngọt gấp 250-450 lần saccharose với hương vị thanh mát tự nhiên, không để lại vị đắng.
  • Mức tiêu thụ chấp nhận được hàng ngày (ADI): Ngưỡng an toàn 4 mg/kg thể trọng/ngày do JECFA thiết lập nhằm kiểm soát lượng phụ gia nạp vào cơ thể.
  • Giới hạn phát hiện (MDL) và giới hạn định lượng (MQL): Các thước đo độ nhạy của phương pháp phân tích hóa học hiện đại.

Phương pháp nghiên cứu

Cỡ mẫu và phương pháp chọn mẫu: Nghiên cứu thực hiện thu thập ngẫu nhiên 30 mẫu thực tế đại diện cho các nhóm sản phẩm tiêu dùng phổ biến trên thị trường Hà Nội, bao gồm nguyên liệu lá cỏ ngọt khô, đường ăn kiêng, nước giải khát đóng chai và trà giảm cân. Phương pháp lấy mẫu phân tầng đảm bảo tính đại diện cao cho các nền mẫu thực phẩm từ dạng lỏng đồng nhất đến dạng rắn giàu chất xơ và polyphenol.

Lý do lựa chọn phương pháp phân tích: Đầu dò PDA quét dải bước sóng rộng từ 190 nm đến 800 nm được lựa chọn thay thế cho đầu dò UV thông thường vì cho phép so sánh độ tương đồng quang phổ tại bước sóng hấp thụ cực đại 210 nm. Điều này giúp loại trừ hoàn toàn các hiện tượng dương tính giả do tạp chất nền thực phẩm gây ra, nâng cao độ chọn lọc và tính chính xác cho phép đo.

Quy trình xử lý mẫu: Mẫu phân tích được đồng nhất hóa, cân chính xác từ 0,5 đến 5,0 g, sau đó chiết siêu âm với dung môi metanol 50% trong 20 phút để hòa tan hoàn toàn các diterpene glycoside. Dịch chiết tiếp tục được làm sạch qua cột chiết pha rắn (SPE) C18 và HLB dung tích 3 mL nhằm loại bỏ lipid, protein và các chất màu gây tắc nghẽn cột sắc ký.

Điều kiện vận hành sắc ký: Phân tích thực hiện trên hệ thống sắc ký lỏng cao áp Shimadzu, sử dụng cột phân tích C18 (kích thước 250 mm x 4,6 mm x 5 µm). Pha động đẳng dòng gồm đệm phosphat NaH2PO4 10 mM (điều chỉnh về pH 2,6 bằng axit orthophosphoric 85%) và dung môi axetonitril theo tỷ lệ thể tích 68:32. Tốc độ dòng duy trì 1,0 mL/phút, nhiệt độ buồng cột ổn định ở 40°C và thể tích tiêm mẫu là 20 µL. Toàn bộ quy trình thẩm định phương pháp được hoàn thành trong timeline 12 tháng theo đúng hướng dẫn tiêu chuẩn của Hiệp hội các Cộng đồng Phân tích Chính thức (AOAC).

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình khảo sát thực nghiệm đã xác định được các thông số tối ưu để phân tách hoàn toàn 7 hợp chất steviol glycosides trong thời gian chạy sắc ký dưới 25 phút. Tại điều kiện pH 2,6 và nhiệt độ cột 40°C, độ phân giải giữa hai pic chính là Stevioside và Rebaudioside A đạt giá trị tối ưu vượt ngưỡng 1,5, loại bỏ triệt để hiện tượng dính pic hoặc biến tính phân hủy ở môi trường pH trung tính (pH 7,0).

Khảo sát hệ dung môi chiết xuất cho thấy dung dịch metanol 50% trong nước mang lại hiệu quả chiết vượt trội nhất. Lượng hoạt chất thu hồi cao hơn từ 18% đến 25% so với việc chỉ sử dụng nước cất hoặc cồn nguyên chất, do tối ưu hóa được độ phân cực phù hợp với cả nhóm aglycone thân dầu và các mạch đường thân nước.

Phương pháp HPLC-PDA đạt độ tuyến tính tuyệt vời trong khoảng nồng độ làm việc từ 1 mg/L đến 100 mg/L với hệ số tương quan tuyến tính R2 của cả 7 chất đều đạt trên 0,999. Giới hạn phát hiện (MDL) của phương pháp nằm trong khoảng 0,05-0,15 mg/kg và giới hạn định lượng (MQL) dao động từ 0,15-0,45 mg/kg, đáp ứng hoàn hảo yêu cầu phân tích vết phụ gia thực phẩm.

Đánh giá độ lặp lại và độ đúng theo tiêu chuẩn AOAC trên 3 nền mẫu (lá cỏ ngọt, đường ăn kiêng, nước ngọt) ghi nhận độ lệch chuẩn tương đối (RSD) đều nhỏ hơn 3,5% qua 6 lần phân tích lặp lại. Hiệu suất thu hồi đạt mức cao ấn tượng từ 88,6% đến 102,4%, chứng minh độ tin cậy và tính ổn định vượt bậc của quy trình.

Thảo luận kết quả

Các kết quả thực nghiệm được mô hình hóa trực quan qua đồ thị hồi quy tuyến tính nồng độ - diện tích pic và biểu đồ cột biểu diễn hiệu suất chiết xuất giữa các hệ dung môi. Việc duy trì nhiệt độ buồng cột ở 40°C giúp giảm độ nhớt của pha động, tăng số đĩa lý thuyết của cột C18 và làm sắc nét chân pic phân tích so với khi chạy ở nhiệt độ phòng 20°C.

Phân tích trên các mẫu thương mại thực tế tại Hà Nội chỉ ra rằng: hàm lượng tổng steviol glycosides trong lá cỏ ngọt khô đạt từ 85 mg/g đến 120 mg/g (tương đương 8,5-12% khối lượng chất khô), trong đó Stevioside chiếm tỷ lệ chủ đạo khoảng 65% và Rebaudioside A chiếm khoảng 28%. Đối với các mẫu nước giải khát và trà thảo mộc đóng chai, hàm lượng phát hiện dao động từ 45 mg/L đến 165 mg/L, hoàn toàn tuân thủ giới hạn tối đa 200 mg/kg theo Thông tư 24/2019/TT-BYT.

So với các kỹ thuật sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) hoặc điện di mao quản (CE) trước đây vốn có độ lệch chuẩn RSD từ 5% đến 8%, phương pháp HPLC-PDA trong luận văn này có giới hạn định lượng thấp hơn gấp 5 lần, thao tác chuẩn bị mẫu tinh gọn và bảo vệ tuổi thọ đầu dò tối đa nhờ bước làm sạch qua cột SPE chuyên dụng.

Đề xuất và khuyến nghị

  1. Chuẩn hóa quy trình kiểm nghiệm quốc gia: Cục An toàn Thực phẩm phối hợp cùng Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia ban hành quy trình HPLC-PDA này thành phương pháp thử nghiệm chuẩn quốc gia trong quý 2 năm 2021, hướng tới áp dụng đồng bộ tại 100% các trung tâm kiểm nghiệm trên toàn quốc.
  2. Tăng cường giám sát thị trường thực phẩm ăn kiêng: Thanh tra Bộ Y tế cùng Chi cục An toàn vệ sinh thực phẩm các địa phương định kỳ lấy mẫu kiểm nghiệm tối thiểu 500 mẫu nước giải khát, bánh kẹo và thực phẩm bảo vệ sức khỏe mỗi năm, đảm bảo 100% sản phẩm lưu hành kiểm soát chặt chẽ mức dư lượng dưới ngưỡng 200 mg/kg theo luật định.
  3. Chuyển giao công nghệ chiết xuất xanh cho doanh nghiệp: Các nhà máy chế biến nông sản và dược liệu nên ứng dụng quy trình chiết siêu âm với dung môi cồn thực phẩm ở nhiệt độ 40-50°C trong vòng 6 tháng tới, nhằm tăng tỷ lệ thu hồi Rebaudioside A lên trên 35%, giúp nâng cao phẩm cấp hương vị và hạn chế vị đắng của cỏ ngọt thương phẩm.
  4. Minh bạch thông tin ghi nhãn hàng hóa: Các doanh nghiệp sản xuất thực phẩm bổ sung và đồ uống ăn kiêng cần hoàn thành việc ghi rõ định lượng thành phần Steviol glycosides (mã INS 960) trên bao bì sản phẩm trước tháng 12 năm 2021, tạo điều kiện thuận lợi cho bệnh nhân đái tháo đường tính toán chính xác khẩu phần dinh dưỡng hàng ngày.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

  1. Cán bộ phân tích và kiểm soát chất lượng (QA/QC): Các chuyên viên tại các viện kiểm nghiệm thực phẩm và phòng thí nghiệm nhà máy chế biến đồ uống có thể ứng dụng ngay bộ thông số sắc ký chuẩn xác (RSD < 3,5%, độ thu hồi > 88%) để xây dựng chỉ tiêu kiểm nghiệm đạt chứng chỉ ISO/IEC 17025.
  2. Giảng viên, học viên cao học và sinh viên chuyên ngành Hóa học, Công nghệ thực phẩm: Tài liệu là nguồn tham khảo chuyên sâu về kỹ thuật tối ưu hóa pha động đệm phosphat nồng độ thấp và phương pháp chiết pha rắn SPE trên các nền mẫu sinh học phức tạp.
  3. Đơn vị nghiên cứu và phát triển sản phẩm (R&D) ngành thực phẩm: Các kỹ sư phát triển công thức đồ uống ăn kiêng có thể khai thác các dữ liệu về tỷ lệ Stevioside/Rebaudioside A và độ ổn định nhiệt để thiết kế các dòng sản phẩm có vị ngọt tự nhiên, không calo và đạt độ hài hòa cảm quan tối ưu.
  4. Chuyên gia dinh dưỡng và bác sĩ nội tiết: Cung cấp cơ sở khoa học định lượng chuẩn xác về mức độ an toàn của đường cỏ ngọt, hỗ trợ thiết lập chế độ ăn kiêng khoa học và kiểm soát năng lượng nạp vào cho bệnh nhân béo phì, tim mạch và đái tháo đường.

Câu hỏi thường gặp

  1. Đường cỏ ngọt steviol glycosides có an toàn cho người bệnh đái tháo đường không? Hoàn toàn an toàn. Steviol glycosides không bị thủy phân qua con đường đường phân trong cơ thể người, không sinh năng lượng và không làm gia tăng chỉ số đường huyết. EFSA và JECFA đã thiết lập mức thu nhận an toàn ADI là 4 mg/kg thể trọng/ngày, giúp người bệnh thỏa mãn vị giác mà vẫn kiểm soát đường huyết hiệu quả.

  2. Tại sao nghiên cứu lại ưu tiên sử dụng đầu dò PDA thay vì đầu dò UV đơn bước sóng? Đầu dò PDA cho phép ghi nhận toàn bộ phổ hấp thụ từ 190 nm đến 800 nm tại từng thời điểm rửa giải. Trong nền mẫu thực phẩm chứa nhiều chất màu và acid hữu cơ cùng hấp thụ tại bước sóng 210 nm, việc đối chiếu phổ PDA chuẩn giúp khẳng định chính xác 100% cấu trúc chất phân tích, loại trừ hoàn toàn nguy cơ nhận định sai pic.

  3. Giới hạn hàm lượng Steviol glycosides trong nước giải khát tại Việt Nam là bao nhiêu? Căn cứ Thông tư 24/2019/TT-BYT về quản lý phụ gia thực phẩm, mức sử dụng tối đa của nhóm Steviol glycosides (INS 960) trong các loại đồ uống có hương liệu, nước ngọt có ga hoặc không ga là 200 mg/kg sản phẩm, đảm bảo tuyệt đối không gây tích lũy độc tính khi sử dụng thường xuyên.

  4. Cột chiết pha rắn SPE giữ vai trò gì trong quy trình phân tích thực phẩm? Cột SPE (đặc biệt là dòng cột C18 và HLB 3 mL) đóng vai trò giữ chọn lọc các diterpene glycoside và loại bỏ triệt để các tạp chất nền phân cực cao như đường đơn, protein, khoáng chất và chất béo. Bước này giúp nâng cao độ thu hồi lên trên 88% và bảo vệ cột sắc ký không bị giảm hiệu năng phân tách.

  5. Vì sao Rebaudioside A được ưa chuộng hơn Stevioside trong công nghệ đồ uống? Mặc dù Stevioside chiếm tỷ lệ cao hơn trong tự nhiên, hợp chất này thường có hậu vị đắng nhẹ và cảm giác chát kéo dài. Ngược lại, Rebaudioside A sở hữu độ ngọt đậm đà gấp 250-450 lần đường mía, vị ngọt thanh mát, trong trẻo và không để lại vị lạ, giúp sản phẩm thực phẩm đạt chất lượng cảm quan xuất sắc nhất.

Kết luận

  • Đề tài đã xây dựng thành công phương pháp định lượng đồng thời 7 hợp chất steviol glycosides bằng kỹ thuật HPLC-PDA với thời gian phân tích tối ưu dưới 25 phút.
  • Phương pháp đạt độ tin cậy vượt trội với khoảng tuyến tính rộng 1-100 mg/L (R2 > 0,999), độ thu hồi đạt từ 88,6% đến 102,4% và độ lặp lại RSD dưới 3,5%.
  • Tối ưu hóa thành công quy trình tiền xử lý mẫu bằng phương pháp chiết siêu âm với metanol 50% kết hợp làm sạch qua cột SPE trên đa dạng nền mẫu phức tạp.
  • Kết quả khảo sát các sản phẩm thương mại trên thị trường Hà Nội chứng minh hàm lượng phụ gia cỏ ngọt đều nằm trong giới hạn an toàn theo quy định y tế.
  • Cung cấp cơ sở khoa học thực chứng vững chắc phục vụ công tác quản lý an toàn thực phẩm và hỗ trợ ngành công nghiệp thực phẩm phát triển các sản phẩm dinh dưỡng lành mạnh.

Đóng góp lớn nhất của luận văn là hoàn thiện một công cụ kiểm nghiệm phụ gia tạo ngọt đạt chuẩn mực quốc tế, tạo tiền đề mở rộng ứng dụng phân tích trên hệ thống sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS/MS) trong lộ trình 12 tháng tiếp theo. Hãy tham khảo và ứng dụng ngay quy trình kỹ thuật này để nâng cao năng lực phân tích cho phòng thử nghiệm của đơn vị bạn!