MỞ ĐẦU Sự kiện toàn bộ hệ gen của con ngƣời đƣợc giải trình tự và công bố trên 2 tạp chí khoa học danh tiếng nhất là Nature, Anh [54] và Science, Mỹ [79] vào tháng 2 năm 2001 đã tạo ra một cột mốc vô cùng quan trọng trong sinh học. Trình tự hệ gen sau đó đã đƣợc công khai để các nhà khoa học trên khắp thế giới có thể tiếp cận và cùng sử dụng tạo ra một điều kiện mới, thuận lợi hơn rất nhiều cho các nghiên cứu sinh học, đặc biệt là sinh học phân tử. Tuy nhiên, để hiểu đƣợc hoàn toàn cấu trúc, tổ chức, sự điều hòa và chức năng chi tiết của hệ gen ngƣời vẫn là một công việc lớn và hết sức khó khăn. Do đó, trình tự đầu tiên đƣợc xem là “trình tự chuẩn” hay “trình tự tham chiếu” giúp chúng ta tiếp tục đến với những nghiên cứu sâu hơn.
Kết quả quan trọng nhất sau khi có bản đồ gen ngƣời cho chúng ta thấy rằng, các chủng tộc, các cá thể ngƣời giống nhau đến 99,9% và chỉ khác nhau một tỷ lệ rất nhỏ (0,1%) về cấu trúc hệ gen. Tuy nhiên, phần khác biệt rất nhỏ này lại có có ý nghĩa quyết định đối với đặc điểm nhân chủng học của một dân tộc, là yếu tố di truyền liên quan đến sức khỏe của cả dân tộc và mỗi cá thể.1% khác biệt giữa hai ngƣời thì có đến hơn 80% là các đa hình nucleotide đơn (SNP). Do đó, việc nghiên cứu các SNP là vô cùng quan trọng, cụ thể đã có nhiều SNP đang đƣợc sử dụng làm công cụ hữu ích trong những lĩnh vực nhƣ y dƣợc học, hình sự, và nghiên cứu di truyền tiến hóa… [85] Kể từ những năm 80 của thế kỷ trƣớc, các SNP của DNA ty thể và nhiễm sắc thể Y đã đƣợc sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau của sinh học và y học. Chúng ta có thể dễ dàng nhận thấy, với các đặc tính nhƣ di truyền đơn dòng, rất ít trao đổi chéo, đồng thời lại lƣu giữ nhiều chỉ thị quạn trọng, những SNP này đặc biệt hữu ích đối với việc nghiên cứu quá trình tiến hóa của con ngƣời.
Hơn nữa, do số lƣợng bản sao lớn trong mỗi tế bào và ít bị phân hủy theo thời gian DNA ty thể thích hợp cho việc nghiên cứu các mẫu DNA cổ đại, trong khi gần đây hƣớng nghiên cứu liên quan đến nhiễm sắc thể Y cũng rất phát triển. Trong một số công bố gần đây, các nghiên cứu liên quan đến DNA ty thể và nhiễm sắc thể Y đã cung cấp những kiến thức hữu ích về các vấn đề chủ chốt trong quá trình tiến hóa và làm sáng 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn Đỗ Mạnh Hưng tỏ lịch sử di truyền của các quần thể ngƣời ở các vùng địa lý trong các bối cảnh và khoảng thời gian khác nhau [46]. Việc nghiên cứu di truyền tiến hóa đối với các dân tộc Việt Nam là hết sức thiết thực, tuy nhiên việc tiến hành các nghiên cứu này vẫn còn là một vấn đề mới ở nƣớc ta và chƣa có nhiều công trình đƣợc công bố. Nhận thức rõ đƣợc tầm quan trọng của việc nghiên cứu nguồn gốc tiến hóa và tìm hiểu dữ liệu di truyền của các dân tộc Việt Nam, chúng tôi định hƣớng nghiên cứu đặc điểm đa hình nucleotide đơn ở cả DNA ty thể và nhiễm sắc thể Y.
Theo hƣớng nghiên cứu này, đề tài luận văn thạc sĩ: “Nghiên cứu đặc điểm đa hình nucleotide đơn (SNPs) của một số vùng DNA ty thể và nhiễm sắc thể Y ở người Mường và người Katu” đã đƣợc thực hiện. Các nội dung chính của đề tài luận văn gồm: - Tách chiết DNA tổng số từ mẫu máu của 108 cá thể ngƣời Việt thuộc hai dân tộc Mƣờng và Katu. Nhân vùng điều khiển D-loop của DNA ty thể và một số chỉ thị trên nhiễm sắc thể Y. - Xác định trình tự nucleotide của các trình tự đƣợc nhân từ các mẫu nghiên cứu.
- Phân tích đa hình nucleotide đơn (SNP) trình tự các mẫu nghiên cứu thuộc hai dân tộc Mƣờng và Katu. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn Đỗ Mạnh Hưng Chƣơng 1. NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH NUCLEOTIDE ĐƠN (SNP) Việc nghiên cứu đa hình nucleotide đơn (SNP) không còn mới lạ gì đối với các nhà sinh học, đặc biệt là các nhà nghiên cứu sinh học phân tử [46]. Tuy nhiên, với tính chất đặc trƣng cho từng cá thể đồng thời lại nắm giữ vai trò vô cùng quan trọng trong sinh học, y học, nhân chủng học, hình sự… việc nghiên cứu các đa hình nucleotide đơn hầu nhƣ là không có giới hạn.
Một SNP đƣợc định nghĩa là một biến thể trình tự DNA xảy ra khi một nucleotide đơn A, T, C hay G trong hệ gen khác biệt so với các cá thể khác trong cùng một loài sinh học hoặc so với sợi nhiễm sắc thể còn lại trong cặp nhiễm sắc thể tƣơng đồng. Ví dụ, hai đoạn trình tự tƣơng ứng của hai cá thể khác nhau, AAGCCTA với AAGCTTA, chứa một sự khác biệt trong các nucleotide đó là hai alen C và T. Sự phân bố của các SNP trong hệ gen không đồng nhất, SNP thƣờng xảy ra trong các vùng không mã hóa hơn các vùng mã hóa [9] và hầu hết các SNP đều ở dạng hai alen [18]. Các dạng SNP Các SNP có thể nằm trong trình tự mã hóa của các gene, các trình tự không mang mã hay trong vùng xen giữa các gene.
Các SNP trong một trình tự mã hóa không nhất thiết sẽ làm thay đổi trình tự các amino acid trong protein đƣợc tạo ra do tính chất thoái hóa của mã di truyền. Một SNP trong đó mà các alen cùng sản xuất ra một trình tự polypeptide đƣợc gọi là đa hình đồng nghĩa (đôi khi gọi là đột biến câm). Nếu một chuỗi polypeptide khác đƣợc tạo ra thì đa hình đó đƣợc gọi là một đa hình thay thế. Một sự thay đổi đa hình thay thế có thể tạo ra một sản phẩm vô nghĩa.
Cụ thể, những kết quả đó có thể tạo ra một amino acid khác, một bộ ba vô nghĩa, một codon dừng quá sớm. Hơn nửa trong số những đột biến bệnh đã đƣợc xác định có nguồn gốc từ các đa hình thay thế [70]. 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn Đỗ Mạnh Hưng Các SNP không nằm trong vùng mã hóa protein vẫn có thể gây ảnh hƣởng đến sự ghép nối các gene, tác động lên các yếu tố phiên mã, làm suy thoái RNA thông tin… Sự biểu hiện gene bị ảnh hƣởng bởi dạng này của SNP đƣợc gọi là một eSNP (sự biểu hiện SNP) và có thể biểu hiện tăng hoặc giảm trong gen. Ứng dụng và tầm quan trọng Các biến thể trong trình tự DNA của con ngƣời có thể ảnh hƣởng đến cách cơ thể phát triển bệnh, cách cơ thể đáp ứng với các tác nhân gây bệnh, các hóa chất, thuốc, vaccine và các loại tác nhân khác.
Các SNP đƣợc cho là chìa khóa tiềm năng trong việc tiến hành y học cá nhân. Tuy nhiên, vai trò quan trọng nhất của chúng trong các nghiên cứu y học là để so sánh các vùng của hệ gen giữa các nhóm ngƣời (có thể là giữa bệnh nhân và ngƣời khỏe mạnh) trong các nghiên cứu ở mức toàn bộ hệ gen (genome-wide association studies - GWAS). Nghiên cứu về các SNP cũng rất quan trọng trong nông nghiệp đặc biệt là trong các chƣơng trình nhân giống cây trồng và vật nuôi. Một SNP đơn có thể là nguyên nhân gây ra một bệnh di truyền.
Đối với các bệnh phức tạp, các SNP thƣờng không hoạt động đơn lẻ, đúng hơn, chúng hoạt động trong một sự kết hợp với các SNP khác để biểu hiện một tình trạng bệnh nhƣ chúng ta thấy trong bệnh loãng xƣơng [67]. Tính đến ngày 26 tháng 6 năm 2012, dbSNP liệt kê đƣợc có 187.828 SNP ở ngƣời [87]. Phát hiện gần đây về các SNP trong các nghiên cứu so sánh ở mức toàn bộ hệ gen (GWAS) tạo ra một điều kiện thuận lợi hơn rất nhiều không chỉ cho quá trình phát hiện các biến thể di truyền và bệnh di truyền mà còn phát triển nghiên cứu nhằm tìm ra cách phòng ngừa và chữa bệnh trong tƣơng lai. Trên thực tế, mỗi ngƣời có những đặc điểm riêng và rất phức tạp.
Các SNP có thể mang lại những phản ứng khác nhau đối với thuốc điều trị thậm chí có trƣờng hợp dẫn đến tử vong. Nhiều SNP đã đƣợc sử dụng nhƣ chỉ thị giúp cho việc lập bản đồ gen liên quan đến 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn Đỗ Mạnh Hưng bệnh hoặc một đặc điểm đặc trƣng nào đó. Các SNP có liên hệ với các bệnh trên ngƣời nhƣ ung thƣ, các bệnh truyền nhiễm (AIDS, phong, viêm gan…) các bệnh tự miễn, bệnh thần kinh và nhiều bệnh khác có thể đƣợc sử dụng để tìm ra đích tác dụng của thuốc và các liệu pháp chữa trị [22]. Là kiểu đa hình phổ biến nhất, ƣớc tính chiếm 80% sự biến đổi trong hệ gen ngƣời, các đa hình SNP nắm giữ chìa khóa phân tử quan trọng nhất đối với cơ thể sống [18].
Chính vì lý do đó, các SNP nhanh chóng đƣợc nghiên cứu và ứng dụng thành công trong việc tìm hiểu các bệnh di truyền, mối quan hệ di truyền, pháp y … Đối tƣợng nghiên cứu phù hợp cho các nghiên cứu này là DNA ty thể và nhiễm sắc thể Y. Với kích thƣớc nhỏ nhất trong bộ gen ngƣời (nhiễm sắc thể Y 60 Mb, DNA ty thể 16,569 bp) đồng thời với đặc tính di truyền theo dòng đơn và nhiều đặc điểm ƣu việt khác, nghiên cứu SNP trên nhiễm sắc thể Y và DNA ty thể đã, đang và sẽ tiếp tục đem lại những thành quả quan trọng cho nhân loại. ĐẶC ĐIỂM ĐA HÌNH CỦA DNA TY THỂ Một trong những nghiên cứu phổ biến nhất đối với hệ thống di truyền ở ngƣời là nghiên cứu DNA ty thể (mitochondrial DNA - mtDNA) [52]. Rất nhiều SNP đã đƣợc xác định trong vùng mã hóa có liên quan với một loạt các rối loạn ty thể làm ảnh hƣởng đến nhiệm vụ sản sinh năng lƣợng và gây ra nhiều loại bệnh khác nhau.
Bên cạnh vùng mã hóa, những biến thể trên vùng điều khiển D-loop lại nắm giữ chìa khóa quan trọng đối với lịch sử tiến hóa và các mỗi quan hệ di truyền quần thể. Cấu trúc của DNA ty thể DNA ty thể là một phân tử dạng tròn có kích thƣớc 16569 bp nằm bên trong ty thể. Tuy nhiên, kích thƣớc này có thể sai khác đôi chút do có những đoạn chèn vào, do mất đoạn, hoặc có những trình tự lặp lại nối tiếp.