MỞ ĐẦU Cây Nghệ vàng (Curcuma longa L.) thuộc họ gừng (Zingiberaceae), được trồng nhiều ở những v ng khí hậu nóng âm như Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia, Jamaica, Peru.và Việt Nam. Củ Nghệ vàng từ lâu đã được su dụng rộng rãi làm gia vi, chất bảo quản và chat tao màu trong thực phẩm. Ngoài ra, củ Nghệ vàng c ng là một trong những phương thuốc dân gian hiệu quả trong chữa trỊ nhiều loại bệnh như vàng da, các bệnh về gan, dạ dày, u nhọt, viêm khớp.Trong những thập kỷ gần đây có rất nhiều nghiên cứu đã được công bố về hoạt tính sinh hoc và được học của củ Nghệ vàng c ng như các thành phan chiết xuất từ củ Nghệ vàng, trong đó curcuminoid và tinh dau đã được chứng minh là những thành phần chính tạo nên dược tính cao của củ Nghệ vàng. Việt Nam có nguồn Nghệ vàng phong phú, phân bố ở nhiều tỉnh thành như V nh Phúc, Hải Dương, Hưng Yên, Nghệ An, Quảng Nam, Đồng Nai, Bình Dương.
Thanh phân, hàm lượng curcuminoid và tinh dầu trong củ Nghệ vàng ở các v ng khác nhau có sự thay đổi lớn do ảnh hưởng của điều kiện khí hậu, thé như ng, điều kiện trồng trọt, chăm sóc.Việc nghiên cứu về đặc trưng củ Nghệ vàng của mỗi v ng sẽ giúp đánh giá đầy đủ hơn giá trị sử dụng, từ đó có được sự định hướng tốt hơn cho việc phát triển nguồn Nghệ vàng trong nước. Các nghiên cứu về Nghệ vàng ở trong nước cho đến nay chủ yếu mới chỉ tập trung ở một số v ng Nghệ vàng phía Bắc như ở H a Binh, V nh Phúc, Hưng Yên. Chính vì vậy, để góp phan vào việc tìm hiểu thêm về các nguôn Nghệ vàng khác trong nước, trong dé tài nay, chúng tôi chọn đối tượng nghiên cứu là củ Nghệ vàng (Curcuma longa L.) thu hái tại Bình Dương, với đề tài “Nghiên cứu quy trình tách chiết, tong hợp dan xuất và xác định tinh chất, hoạt tinh của tinh dau và curcumin trích từ cây Nghệ vàng (Curcuma longa L. Quy trình phân lập curcuminoid từ củ Nghệ vàng được định hướng khảo sát là trích ly curcuminoid kết hợp tách tinh dầu va không qua giai đoạn loại béo.
So với những quy trình hiện sử dụng để tách curcuminoid từ củ Nghệ vàng, quy trình này sẽ giúp tận thu được nguôn tỉnh dầu từ củ Nghệ, giảm lượng dung môi hữu cơ sử dụng mà vẫn đảm bảo thu được curcuminoid từ củ Nghệ vàng với hiệu suất và độ tinh khiết cao. Với mục tiêu trên, chúng tôi hy vọng sẽ góp phần tìm ra một quy trình mới có tính ứng dụng cao đề có thê mở rộng ở quy mô sản xuât lớn hơn. Một hướng nghiên cứu thứ hai quan trọng và trọng tâm của công trình này là tong hợp dẫn xuất của curcuminoid và khảo sát hoạt tinh sinh học. Curcumin mặc dù đã được chứng minh có rất nhiều hoạt tính mạnh và đa dạng, một trong những nhược điểm lớn của curcumin là tính khả dụng sinh hoc (bioavailability) thấp thể hiện ở sự hap thu kém, sự chuyền hóa nhanh và sự dao thai lớn khi vào cơ thé.
Chính những yếu tố trên đã làm ảnh hưởng lớn đến dược Ì của curcumin. Phương pháp biến đổi cau trúc curcumin nhằm cải thiện hoạt tính và tính khả dung sinh học là hướng nghiên cứu đang rất được quan tâm hiện nay. Mặc d chưa có nhiều nghiên cứu về mối quan hệ giữa sự biến đối cấu trúc curcumin với sự cải thiện tính khả dụng sinh học của curcumin, rất nhiều dẫn xuất c ng đã được chứng minh in vitro và in vivo có hoạt tinh sinh học cao hon curcumin. Đặc biệt trong số đó, các dẫn xuất isoxazole, pyrazole curcumin va dẫn xuất của pyrazole curcumin được chứng minh có nhiều hoạt tính sinh học mạnh hơn so với curcumin như hoạt tính kháng oxy hóa, kháng viêm, ức chế chọn loc enzyme COX-2 và đặc biệt là hoạt tính kháng ung thư.
Việc bién đổi cau trúc B- diketone của curcumin thành các dị v ng isoxazole, pyrazole đã được chứng minh giúp tăng hoạt tính gây độc tế bào ung thư của curcumin với nhiều d ng tế bào khác nhau. Chính vi vậy trong dé tài nghiên cứu này, các dan xuất isoxazole và pyrazole curcuminoid được định hướng tong hop, dong thời khảo sát một số hoạt tính sinh hoc của các dân xuất này so với curcumin như hoạt tính kháng khuẩn, kháng oxy hóa và kháng ung thư.1 Tông quan về curcumin Cây Nghệ vàng có tên khoa hoc là Curcuma longa L. thuộc họ gừng (Zingiberaceae). Trên thé gidi, Nghé vang phan bố ở các v ng nhiệt đới, cận nhiệt đới và được trồng chủ yếu ở các nước châu Á như Ấn Độ, Trung Quốc, Pakistan, Bangladesh, Indonesia.
và Việt Nam [1]. Thanh phan hóa học chính quan trọng nhất của thân rễ Nghệ vàng là curcuminoid (~ 2-8 %), thành phần tạo màu vàng cho củ Nghệ. Hỗn hợp curcuminoid bao gồm 3 thành phần chính : curcumin (Cur), demethoxycurcumin (DMC) và bisdemethoxycurcumin (BDMC) (hình 1.1) chiếm lần lượt khoảng 77 %, 17 %, 3 % [1-4]. HO Oy Ô OH ann, O O (I) R,=R,=OCH; (Curcumin) (2) R,;=OCH3, R;=H (Demethoxycurcumin) (3) R,=R,=H (Bisdemethoxycurcumin) Hình 1.
Cấu trúc của các thành phần curcuminoid [1] Curcumin, danh pháp quốc tế 1,7-bis-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-hepta- 1 ,6- diene-3,5-dione, chiếm hàm lượng cao nhất trong 3 thành phan và c ng được chứng minh có nhiều hoạt tính sinh học mạnh va đa dạng hơn so với 2 thành phan c n lại.2 Một số tính chat hóa lý của curcumin Curcumin là chất ran kết tinh màu vàng cam, tan trong chất béo, ethanol, methanol, dichloromethane, acetone, acetic acid băng và hầu như không tan trong nước ở môi trường acid hay trung tính (độ tan < 10 pg/ml ở 25°C). Trong môi trường kiềm, curcumin tạo dung dịch màu đỏ [1, 4, 5|. Dung dịch cureumin trong dung môi hữu cơ có độ hấp thu cực đại ở bước sóng từ 420-430 nm (bảng 1. Các thông số hoa! của các thành phần curcuminoid [6].
Đặc trưng Thông sô Curcumin DMC BDMC Diém chay (°C) 184 172 222 UV-Vis Amax trong ethanol (nm) 429 424 419 1.1 Sự phân huy curcumin trong môi trường kiểm Dung dịch curcumin có màu không ổn định do sự phân hủy của curcumin hoặc do thay đối dung môi. Trong môi trường acid, dung dịch có mau vàng và chuyển sang đỏ nâu và đỏ đậm trong môi trường kiềm. Phố hap thu trong môi trường acid, base thé hiện trong hình 1.6 3 ® 424 = 124 = = if = = 1 S an sử z2 ¬ 2 081) Ÿ E 0. 0 0 T T T T T T = T 20 260 300 340 380 420 460 590 540 220 260 300 340 380 420 460 500 540 , Wavelenctt Wavelength [nm] a) avelength [nm] b) Time[hours| 0.
a) Phố UV-Vis của curcumin. — dung dich curcumin 3,09 x 10° M trong NaOH 0,5M, --- dung dich curcumin 3,04 x 10°M trong acetic acid bang; b) Phé UV- Vis cua dung dich curcumin 4,99 x 10°M trong NaOH 0,091M theo thoi gian [7] Độ bén của curcumin phụ thuộc vào pH môi trường [8, 9], phản ứng phân hủy xảy ra nhanh hơn trong môi trường trung tính — kiểm [9]. Khi tiếp xúc liên tục với môi trường kiềm sẽ có sự thay đổi mau rất rõ rệt sang mau vàng nâu hoặc vang nhạt (gần như không mau). OCH; /' OCH, OH ' AS OH radical O Y O CHO Sản phẩm ngưng tụ oO S HO~ ~~ HO + AY HO OH OCH 3 OCH 3 OCH; vanillin acetone feruloylmethane ferulic acid Hình 1.
Các sản phẩm phân hủy curcumin trong môi trường kiềm [8] Nghiên cứu của Tonnesen và cộng sự [8] cho thay, phan ứng phân hủy curcumin trong dung dịch pH 8,5 xảy ra nhanh ngay sau 5 phút. SKBM của dung dich curcumin bị phân hủy hoàn toàn cho 8-17 vết, phụ thuộc vào thời gian phản ứng và pH môi trường. Các sản phẩm phân hủy của curcumin được nhóm tác giả xác định thông qua HPLC — MS bao gồm ferulic acid, feruloylmethane và các sản phẩm phân hủy của feruloylmethane là vanilin và acetone (hình 1. Màu vàng đến vàng nâu của dung dịch được dự đoán là do các sản phẩm ngưng tụ từ thành phân feruloylmethane.
Trong môi trường giả sinh | (đệm phosphate, pH 7.2, 37°C ) không có huyết thanh, 90 % curcumin phân hủy trong 30 phút. Tuy nhiên khi có mặt huyết thanh, curcumin bén hơn: trong môi trường nuôi cấy tế bao chứa 10 % huyết thanh bao thai b_ và trong máu người, sau 1 giờ chỉ ít hơn 20 % curcumin bị phân hủy va sau 8 giờ, chỉ khoảng 50 % curcumin bi phân hủy. Sản phẩm chính trong phan ứng phân hủy được xác định là trans-6-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2,4-dioxo-5-hexenal, vanilin, ferulic acid và feruloylmethane [9].2 Dé bên quang hóa của curcumin Curcumin đã được WHO thông qua là chất màu trong thực phẩm [10]. Tuy nhiên curcumin không thích hợp cho mọi loại sản phẩm do nó mat màu rất nhanh khi tồn trữ trong môi trường kiềm.
Ngoài ra, curcumin c ng dễ bị quang phân dưới tác dụng của bức xạ UV-Vis cả ở dạng h a tan và dạng mang ran [11]. SKBM của dung dich curcumin trong isopropanol (1 mg/100 ml) sau khi chiếu xạ dưới ánh sáng 400-510 nm trong 245 phút cho 1 sản phẩm phân hủy chính có R; gan với curcumin, được xác định (bang phương pháp MS, NMR) là do sự v ng hóa của curcumin (sản phẩm I, hình 1. Phản ứng đóng v ng dé xuất cho curcumin khi phơi sáng (A > 400 nm) [11] Ngoài sản phẩm chính v ng hóa, có 6 sản phẩm phụ khác được xác định băng MS va HPLC, gồm có vanillin, vanillic acid, ferulic aldehyde, ferulic acid va 4- vinyl guaiacol (hình 1. O O HO OH hv hv hv HạCO CHO HạCO S HạCO N CH -~----- OH | Con, HO HO HO HạCO 0 eee.
màRate le OH Hinh 1. Su phan huy cua curcumin trong isopropanol (A > 400 nm) [11] Dưới tac dung cua bức xa liên tục ở 240-600 nm, curcumin phan hủy nhanh hon. Sau 100 phút dung dịch mat màu hoàn toàn. Kết qua GC-MS cho nhiều sản phẩm phân hủy khác chứng tỏ tác động của tia UV đã gây sự thay đổi đáng ké trong cấu trúc curcumin.
Sự quang phan curcumin chịu ảnh hưởng của dung môi [11]. Trong methanol tốc độ quang phân của curcumin chậm nhất so với trong ethyl acetate, chloroform, va acetonitrile, có thé do dung môi hỗ trợ sự hình thành các liên kết hydro nội phân tử và liên phân tử trong curcumin và khả năng lọc sáng (inner-filter) của dung môi. Tốc độ mat mau của curcumin ở 400-750 nm chậm lại khi có mặt các tác nhân dập tắt oxygen singlet như B-carotene hoặc DABCO (1 4-diazabicylco-(2,2,2)octane), trong khi đó các tác nhân nhạy sáng như methylene blue xúc tác, lam tăng tốc cho phản ứng quang phân curcumin.