Luận án tiến sĩ công nghệ hóa học nghiên cứu quy trình tách chiết tổng hợp dẫn xuất và xác định tính chất hoạt tính của tinh dầu và curcumin từ cây nghệ vàng curcuma longa l bình dương

Luận án tiến sĩ nghiên cứu công nghệ hóa học nghiên cứu quy trình tách chiết tổng hợp dẫn xuất và xác định tính chất hoạt tính, phát triển phương pháp mới, đánh giá hiệu quả ứng

• Tác giả: Phan Thị Hoàng Anh
• Người hướng dẫn: PGS. Trần Thị Việt Hoa
• Trường học: Đại học Bách Khoa, Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công nghệ hóa học các chất hữu cơ
• Đề tài: Nghiên cứu quy trình tách chiết, tổng hợp dẫn xuất và xác định tính chất, hoạt tính của tinh dầu và curcumin từ cây Nghệ vàng (Curcuma longa L.) Bình Dương
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: TP. Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tổng quan về Curcumin
• 1.2. Một số tính chất hóa học của curcumin
• 1.3. Hoạt tính sinh học của Curcumin
• 1.4. Tính khả dụng sinh học của Curcumin
• 1.5. Các phương pháp cải thiện tính khả dụng sinh học của curcumin
• 1.6. Các nghiên cứu về tổng hợp và hoạt tính sinh học của dẫn xuất curcumin
• 1.6.1. Các phương pháp tổng hợp một số dẫn xuất của curcumin
• 1.6.2. Hoạt tính sinh học của các dẫn xuất curcuminoid
• 1.7. Giới thiệu về tinh dầu và các phương pháp trích ly curcuminoid và tinh dầu từ củ Nghệ vàng
• 1.7.1. Giới thiệu về tinh dầu củ Nghệ vàng (Curcuma longa L.)
• 1.7.2. Tổng quan một số nghiên cứu về trích ly curcuminoid từ củ Nghệ
• 2. CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Mục tiêu nghiên cứu
• 2.2. Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị
• 2.3. Nội dung thực hiện
• 2.3.1. Nghiên cứu trích ly curcuminoid và tinh dầu từ củ Nghệ vàng (Curcuma longa L.)
• 2.3.2. Nghiên cứu phân lập 3 thành phần curcumin, DMC và BDMC từ hỗn hợp curcuminoid
• 2.3.3. Tổng hợp dẫn xuất pyrazole và isoxazole của curcuminoid
• 2.3.4. Xác định hoạt tính sinh học của tinh dầu, curcuminoid và các dẫn xuất curcuminoid tổng hợp được
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - BÀN LUẬN
• 3.1. Kết quả nghiên cứu trích ly curcuminoid và tinh dầu từ củ Nghệ vàng
• 3.1.1. Kết quả khảo sát quy trình trích ly curcuminoid và tinh dầu từ củ Nghệ vàng
• 3.1.2. Kết quả phân tích hàm lượng và thành phần tinh dầu, curcuminoid thu được bằng phương pháp GC-MS, HPLC và LC-MS
• 3.1.3. Kết quả khảo sát trích ly curcuminoid bằng phương pháp đun hồi lưu trực tiếp có sự hỗ trợ của vi sóng
• 3.2. Kết quả nghiên cứu phân lập 3 thành phần curcumin, DMC và BDMC từ hỗn hợp curcuminoid
• 3.2.1. Kết quả quá trình kết tinh lại
• 3.2.2. Kết quả sắc cột phân lập 3 thành phần curcuminoid
• 3.2.3. Kết quả xác định một số tính chất hóa học các thành phần curcuminoid
• 3.2.4. Kết quả nhận dạng và xác định cấu trúc các thành phần curcuminoid
• 3.3. Kết quả tổng hợp dẫn xuất của curcuminoid
• 3.3.1. Nhận xét chung về quá trình tổng hợp
• 3.3.2. Kết quả định danh, xác định cấu trúc các dẫn xuất
• 3.4. Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học của tinh dầu, curcuminoid và dẫn xuất tổng hợp
• 3.4.1. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm và kháng oxy hóa của tinh dầu Nghệ vàng
• 3.4.2. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của curcuminoid và dẫn xuất
• 3.4.3. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của curcuminoid và dẫn xuất
• 3.4.4. Kết quả khảo sát hoạt tính gây độc tế bào của curcuminoid và dẫn xuất
• KẾT LUẬN
• CÁC TÀI LIỆU CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
• DANH MỤC BẢNG BIỂU
• DANH MỤC ĐỒ THỊ
• DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Tóm tắt

I. Nghiên cứu quy trình tách chiết tinh dầu và curcumin từ nghệ vàng Curcuma Longa L

Nghiên cứu này tập trung vào việc xác định quy trình tách chiết hiệu quả tinh dầu và curcumin từ củ nghệ vàng (Curcuma Longa L.) tại Bình Dương. Quy trình bao gồm các bước như trích ly, phân lập, và tinh chế các thành phần hoạt chất. Phương pháp chiết xuất kết hợp giữa đun hồi lưu và hỗ trợ vi sóng được áp dụng để tối ưu hóa hiệu suất thu hồi. Kết quả cho thấy quy trình này không chỉ giảm thiểu lượng dung môi hữu cơ mà còn đảm bảo độ tinh khiết cao của curcuminoid và tinh dầu. Đây là một bước tiến quan trọng trong việc phát triển các ứng dụng công nghiệp và y học từ thảo dược này.

1.1. Phương pháp trích ly và phân lập

Quy trình trích ly được thực hiện bằng cách sử dụng dung môi ethanol và nước, kết hợp với hỗ trợ vi sóng để tăng hiệu suất. Phân lập các thành phần curcumin, demethoxycurcumin, và bisdemethoxycurcumin được thực hiện thông qua sắc ký cột. Kết quả phân tích bằng HPLC và GC-MS cho thấy hàm lượng curcuminoid đạt khoảng 2-8%, trong đó curcumin chiếm tỷ lệ cao nhất (77%).

1.2. Tối ưu hóa quy trình

Quy trình được tối ưu hóa bằng cách điều chỉnh các thông số như nhiệt độ, thời gian, và tỷ lệ dung môi. Kết quả cho thấy việc sử dụng vi sóng giúp rút ngắn thời gian trích ly từ 6 giờ xuống còn 2 giờ, đồng thời tăng hiệu suất thu hồi lên 15%. Điều này chứng minh tính khả thi của quy trình trong việc áp dụng ở quy mô công nghiệp.

II. Hoạt tính sinh học của tinh dầu và curcumin

Hoạt tính sinh học của tinh dầu và curcumin từ nghệ vàng được đánh giá thông qua các thử nghiệm kháng khuẩn, kháng nấm, kháng oxy hóa, và kháng ung thư. Kết quả cho thấy curcumin và các dẫn xuất của nó thể hiện hoạt tính mạnh trong việc ức chế sự phát triển của tế bào ung thư tuyến tiền liệt PC3. Đặc biệt, dẫn xuất 19 có hoạt tính cao gấp 38 lần so với curcumin, với chỉ số chọn lọc SI = 26, đáp ứng quy tắc số 5 của Lipinski, mở ra tiềm năng lớn trong nghiên cứu phát triển dược phẩm.

2.1. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm

Các thử nghiệm kháng khuẩn và kháng nấm được thực hiện trên các chủng vi khuẩn và nấm phổ biến. Kết quả cho thấy tinh dầu và curcuminoid có khả năng ức chế sự phát triển của các chủng vi khuẩn như E. coli và nấm Candida albicans. Điều này khẳng định tiềm năng của nghệ vàng trong việc phát triển các sản phẩm kháng khuẩn tự nhiên.

2.2. Hoạt tính kháng oxy hóa và kháng ung thư

Curcumin và các dẫn xuất của nó được đánh giá về hoạt tính kháng oxy hóa thông qua phương pháp DPPH. Kết quả cho thấy curcumin có khả năng trung hòa gốc tự do mạnh, với giá trị IC50 thấp. Ngoài ra, các dẫn xuất như dẫn xuất 19 thể hiện hoạt tính kháng ung thư mạnh, đặc biệt là trên dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt PC3, mở ra hướng nghiên cứu mới trong điều trị ung thư.

III. Ứng dụng y học và công nghiệp

Nghiên cứu này không chỉ mang lại giá trị khoa học mà còn có tiềm năng ứng dụng cao trong y học và công nghiệp. Curcumin và tinh dầu từ nghệ vàng có thể được sử dụng trong sản xuất dược phẩm, thực phẩm chức năng, và mỹ phẩm. Đặc biệt, các dẫn xuất mới được tổng hợp trong nghiên cứu này có thể trở thành các hợp chất tiềm năng trong điều trị ung thư và các bệnh liên quan đến oxy hóa.

3.1. Ứng dụng trong dược phẩm

Các dẫn xuất của curcumin như dẫn xuất 19 có tiềm năng lớn trong việc phát triển các loại thuốc kháng ung thư. Với hoạt tính mạnh và độ chọn lọc cao, các hợp chất này có thể được nghiên cứu sâu hơn để ứng dụng trong điều trị các bệnh ung thư, đặc biệt là ung thư tuyến tiền liệt.

3.2. Ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm

Tinh dầu và curcumin từ nghệ vàng có thể được sử dụng làm chất bảo quản tự nhiên, chất tạo màu, và thành phần chống oxy hóa trong thực phẩm và mỹ phẩm. Điều này không chỉ nâng cao giá trị kinh tế của nghệ vàng mà còn góp phần phát triển các sản phẩm an toàn và thân thiện với môi trường.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Cây Nghệ vàng (Curcuma longa L.) thuộc họ Gừng (Zingiberaceae), là cây trồng nhiệt đới và cận nhiệt đới phổ biến tại châu Á, trong đó có Việt Nam. Thân rễ cây Nghệ vàng chứa hai nhóm hoạt chất chính có giá trị sinh học và dược lý cao là tinh dầu (hàm lượng khoảng 1–8%) và curcuminoid (hàm lượng khoảng 2–8%). Nhóm curcuminoid gồm 3 thành phần chính: curcumin (chiếm khoảng 77%), demethoxycurcumin (DMC, chiếm khoảng 17%) và bisdemethoxycurcumin (BDMC, chiếm khoảng 3%).

Mặc dù có nguồn Nghệ vàng phong phú phân bố tại nhiều tỉnh thành, các công trình nghiên cứu trong nước trước thời điểm thực hiện luận án chủ yếu tập trung vào nguồn nguyên liệu tại một số tỉnh phía Bắc (Hòa Bình, Vĩnh Phúc, Hưng Yên). Các vùng nguyên liệu phía Nam, đặc biệt là tỉnh Bình Dương, chưa được khảo sát toàn diện về hàm lượng, thành phần hóa học của tinh dầu cũng như tổ hợp curcuminoid. Bên cạnh đó, các quy trình tách chiết curcuminoid truyền thống thường phải qua giai đoạn loại béo bằng dung môi hữu cơ không phân cực (như hexane, ether dầu hỏa), dẫn đến việc loại bỏ và lãng phí nguồn tinh dầu quý, đồng thời tiêu tốn lượng lớn dung môi hữu cơ.

Về mặt hóa sinh và dược học, curcumin sở hữu nhiều hoạt tính sinh học giá trị (kháng oxy hóa, kháng viêm, kháng tế bào ung thư), nhưng hợp chất này có nhược điểm lớn là tính khả dụng sinh học (bioavailability) rất thấp. Curcumin kém bền trong môi trường kiềm và trung tính, dễ bị phân hủy quang hóa, khó hấp thu qua đường tiêu hóa, chuyển hóa nhanh tại gan/ruột và bị đào thải nhanh chóng ra ngoài cơ thể. Do đó, việc nghiên cứu quy trình trích ly kết hợp để thu nhận đồng thời curcuminoid và tinh dầu, kết hợp định hướng biến đổi cấu trúc phân tử của curcuminoid nhằm tạo ra các dẫn xuất có độ bền, hoạt tính sinh học và khả năng ứng dụng dược phẩm cao hơn là yêu cầu khoa học cấp thiết.

Luận án xác định 4 mục tiêu nghiên cứu cụ thể được đánh số theo văn bản như sau:

1. Nghiên cứu quy trình trích ly curcuminoid và tinh dầu từ củ Nghệ vàng (Curcuma longa L.) Bình Dương.
2. Phân lập 3 thành phần curcumin, demethoxycurcumin (DMC) và bisdemethoxycurcumin (BDMC) từ hỗn hợp curcuminoid.
3. Tổng hợp dẫn xuất của curcuminoid (tập trung vào các dị vòng pyrazole, isoxazole và dẫn xuất phenylpyrazole).
4. Khảo sát hoạt tính sinh học của tinh dầu, các curcuminoid và các dẫn xuất curcuminoid tổng hợp được.

Đối tượng nghiên cứu là củ Nghệ vàng (Curcuma longa L.) được thu hái tại tỉnh Bình Dương vào đúng chu kỳ thu hoạch (nghệ khoảng 9 tháng tuổi, thu hoạch vào tháng 9–10). Để đối chứng về thành phần hóa học của tinh dầu, tác giả thu thập thêm mẫu củ nghệ tại Đồng Nai (huyện Thống Nhất), Quảng Nam và Nghệ An. Bột hỗn hợp curcuminoid thương phẩm phục vụ cho nghiên cứu phân lập 3 thành phần sạch được cung cấp bởi Viện Dược liệu (Bộ Y tế, Hà Nội).

Phạm vi thực nghiệm được thực hiện tại Bộ môn Hóa Hữu cơ (Khoa Kỹ thuật Hóa học, Trường Đại học Bách Khoa – ĐHQG TP. Hồ Chí Minh), Viện Hóa học (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Hà Nội), Trung tâm Đào tạo và Phát triển Sắc ký TP. Hồ Chí Minh, và Viện Eskitis (Đại học Griffith, Queensland, Australia).

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Trong phần tổng quan tài liệu, luận án đã tổng hợp hệ thống các nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến cấu trúc hóa học, độ bền, dược động học, phương pháp trích ly và các hướng biến đổi cấu trúc của curcuminoid cùng tinh dầu nghệ vàng:

• Tính chất hóa lý và độ bền phân hủy của curcumin: Tác giả phân tích các công trình của Tønnesen và cộng sự (1985) về cơ chế phân hủy của curcumin trong môi trường kiềm (pH 8,5) tạo thành ferulic acid, feruloylmethane, vanillin và acetone; nghiên cứu của Wang và cộng sự (1997) về sự phân hủy trong môi trường giả sinh lý; nghiên cứu của Khurana và Ho (1988) về sự phân hủy quang hóa của curcumin dưới bức xạ UV-Vis tạo thành hợp chất đóng vòng nội phân tử và các sản phẩm cắt mạch.
• Cơ chế kháng oxy hóa: Luận án điểm lại các công bố của Slobodan và cộng sự (2001) về cơ chế chuyển nguyên tử hydro (HAT) tại nhóm methylene trung tâm $C_4$; nghiên cứu của Keishi Ohara và cộng sự (2005) cùng Priyadarsini (2003) khẳng định vai trò quyết định của nhóm OH phenol và liên kết hydro nội phân tử trong việc dập tắt gốc tự do DPPH, ABTS và gốc aryloxy; nghiên cứu của Tuba Ak và cộng sự (2008) so sánh năng lực chống oxy hóa của curcumin với BHA, BHT, $\alpha$-tocopherol và trolox; nghiên cứu của Chen và cộng sự (2006) trên 9 dẫn xuất của curcumin chỉ ra sự hiện diện của nhóm ortho-hydroxyphenol và ortho-methoxyphenol làm tăng đáng kể hoạt tính ức chế peroxy hóa lipid màng.
• Dược động học và chuyển hóa sinh học: Các công trình của Ravindranath và Chandrasekhara (1980), Wahlstrom và Blennow (1978), Pan và cộng sự (1999), Shoba và cộng sự (1998), Anand và cộng sự (2007), Cheng và cộng sự (2001) cùng Ireson và cộng sự (2001) đã chứng minh curcumin bị khử hóa nhanh bởi enzyme reductase nội sinh thành dihydrocurcumin, tetrahydrocurcumin (THC), hexahydrocurcumin và tiếp tục bị liên hợp tạo thành curcumin glucuronoside hoặc curcumin sulfate tại gan và ruột. Khi uống ở liều 1 g/kg trên chuột, 75% lượng curcumin bị đào thải qua phân; sinh khả dụng đường uống chỉ đạt xấp xỉ 1% ở liều 500 mg/kg.
• Các giải pháp cải thiện sinh khả dụng và biến tính dẫn xuất: Luận án tổng kết các hướng nghiên cứu sử dụng tá dược hỗ trợ như piperine (Shoba, 1998), quercetin (Cruz-Correa, 2006), genistein (Verma, 1997); các hệ mang nano và liposome (Bisht, 2007; Kunwar, 2008; Li, 2005; Letchford, 2008; Maiti, 2007); và đặc biệt là hướng tổng hợp hóa học biến đổi bộ khung $\beta$-diketone thành dị vòng pyrazole và isoxazole (Mishra, 2005, 2008; Selvam, 2005; Ishida, 2002; Lin, 2006; Shim, 2002; Narlawar, 2008; Zang, 2014). Trong nước, tác giả điểm lại công trình của Đào Hùng Cường và Lê Hải Lợi (2007) về tổng hợp pyrazole và isoxazole curcumin nhưng sản phẩm có sự sai khác về tính chất vật lý so với tài liệu quốc tế.
• Nghiên cứu về tinh dầu và kỹ thuật trích ly: Luận án điểm lại các công trình về thành phần tinh dầu nghệ của Phan Tống Sơn (1995), Đỗ Đình Rãng (1998) tại miền Bắc; các kỹ thuật chiết Soxhlet, chiết chất lỏng siêu tới hạn $CO_2$ (Braga, 2003; Gopalan, 2000), chiết có hỗ trợ vi sóng (Dandekar và Gaikar, 2002), cũng như các nghiên cứu chiết tách trong nước của Giang Thị Sơn (2003), Nguyễn Minh Chính (2006), Đào Hùng Cường (2003) và Phạm Thế Chính (2009).

Khoảng trống nghiên cứu mà luận án lựa chọn giải quyết bao gồm:

1. Thiếu hụt dữ liệu chuẩn xác và đầy đủ về đặc tính hóa lý, thành phần hóa học của tinh dầu và curcuminoid từ củ Nghệ vàng vùng Bình Dương.
2. Chưa có quy trình công nghệ tích hợp chiết xuất đồng thời curcuminoid và tinh dầu trực tiếp mà không cần công đoạn loại chất béo bằng dung môi không phân cực.
3. Cần mở rộng tổng hợp các dẫn xuất dị vòng pyrazole, isoxazole mới từ các thành phần curcuminoid tinh khiết (Curcumin, DMC, BDMC) và đánh giá chi tiết độc tính tế bào ung thư in vitro, đặc biệt là khả năng ức chế dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt PC3.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

Luận án dựa trên lý thuyết cấu trúc hóa học hữu cơ của hệ $\beta$-diketone liên hợp có khả năng hỗ biến keto-enol, tính chất acid-base của nhóm OH phenol và tính chất cộng hưởng của gốc tự do trung gian tạo thành trong các phản ứng oxy hóa khử. Đánh giá tính khả dụng sinh học và tiềm năng làm thuốc của các hợp chất tổng hợp dựa trên "Quy tắc số 5 của Lipinski" (Lipinski's Rule of Five), bao gồm các tiêu chí về khối lượng phân tử ($\le 500\text{ Da}$), hệ số phân bố octanol-nước ($\log P \le 5$), số lượng liên kết cho hydro ($\le 5$) và số lượng liên kết nhận hydro ($\le 10$).

Phương pháp thực nghiệm thực tế

Luận án kết hợp các phương pháp chiết tách hóa thực vật, tổng hợp hóa học hữu cơ và thử nghiệm hoạt tính sinh học in vitro:

• Quy trình chiết tách và phân lập:
  • Trích ly tinh dầu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước cổ điển và chưng cất hồi lưu.
  • Trích ly curcuminoid bằng phương pháp chiết Soxhlet và phương pháp đun hồi lưu trực tiếp có sự hỗ trợ của vi sóng (sử dụng lò vi sóng Whirpool gia dụng công suất 800 W đã được hiệu chỉnh kỹ thuật).
  • Tinh chế hỗn hợp curcuminoid bằng phương pháp kết tinh lại trong dung môi hữu cơ.
  • Phân lập 3 thành phần curcumin, DMC và BDMC bằng phương pháp sắc ký cột cổ điển sử dụng pha tĩnh silica gel 60 ($0{,}040\text{–}0{,}063\text{ mm}$ và $0{,}063\text{–}0{,}200\text{ mm}$) và aluminium oxide 60 trung tính ($0{,}063\text{–}0{,}200\text{ mm}$); kiểm tra độ sạch bằng sắc ký lớp mỏng (SKBM) trên bản mỏng silica gel $60\text{F}_{254}$ và $\text{Al}_2\text{O}3\ 60\text{F}{254}$.
• Quy trình tổng hợp hữu cơ:
  • Tổng hợp dẫn xuất dị vòng isoxazole thông qua phản ứng ngưng tụ đóng vòng giữa curcuminoid với hydroxylamine hydrochloride ($\text{NH}_2\text{OH}\cdot\text{HCl}$) trong môi trường acid acetic ($\text{CH}_3\text{COOH}$) hoặc ethanol hồi lưu.
  • Tổng hợp dẫn xuất dị vòng pyrazole và các dẫn xuất thế alkyl/hydroxyalkyl pyrazole bằng phản ứng giữa curcuminoid với hydrazine hydrate hoặc alkylhydrazine hydrochloride trong môi trường dung môi methanol bổ sung triethylamine ($\text{Et}_3\text{N}$) và xúc tác $\text{CH}_3\text{COOH}$.
  • Tổng hợp các dẫn xuất phenylpyrazole bằng phản ứng của curcuminoid với các dẫn xuất phenylhydrazine hydrochloride mang nhóm thế khác nhau (như $-H$, $-F$, $-Cl$, $-\text{NO}_2$, $-\text{COOH}$, $-\text{OCH}_3$, $-\text{CH}_3$) trong dung môi toluene hồi lưu hoặc acid acetic băng.
• Kỹ thuật phân tích cấu trúc và thiết bị đo đạc:

Phương pháp phân tích	Thiết bị / Thông số kỹ thuật	Cơ sở đo đạc
Đo nhiệt độ nóng chảy ($t_{\text{nc}}$)	Máy Electrothermal 9100	Bộ môn Hóa Hữu cơ, ĐHBK TP.HCM
Phổ tử ngoại - khả kiến (UV-Vis)	Máy JENWAY 6505 UV-Vis Spectrophotometer	Bộ môn Hóa Hữu cơ, ĐHBK TP.HCM
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)	Cột pha đảo C18 ($5\ \mu\text{m}, 250 \times 4{,}6\text{ mm}$), pha động $\text{Acetonitrile}/\text{H}_3\text{PO}_4\ 0{,}05%$ (55:45 v/v), tốc độ dòng $0{,}8\text{ mL/phút}$, đầu dò UV ở bước sóng $422\text{ nm}$	Trung tâm Đào tạo và Phát triển Sắc ký TP.HCM
Sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS)	Hệ thống GC-MS xác định thành phần tinh dầu	Viện Hóa học, Hà Nội
Sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS / MS)	Máy HP 5989 MS Engine và Mariner TOF biospectrometer (ESI-TOF-MS)	Viện Hóa học (Hà Nội) và Viện Eskitis (Australia)
Phổ khối lượng phân giải cao (HR-MS)	Máy Bruker Daltonics Apex II 4.7e FTICR-MS, nguồn Apollo API (ESI-FTICR-MS)	Viện Eskitis, Đại học Griffith (Australia)
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR)	Máy Bruker AV 500 ($500\text{ MHz}$ cho $^1\text{H}$ và $125\text{ MHz}$ cho $^{13}\text{C}$) và Varian Inova 500 MHz spectrometer	Viện Hóa học (Hà Nội) và Viện Eskitis (Australia)

• Phương pháp khảo sát hoạt tính sinh học:
  • Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC, tính theo $\mu\text{g/mL}$) trên các chủng vi khuẩn gram dương, gram âm và vi nấm kiểm định.
  • Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa: Thử nghiệm quét gốc tự do DPPH (xác định giá trị $\text{IC}_{50}$) và phương pháp ức chế peroxy hóa lipid màng tế bào theo mô hình MDA (malondialdehyde).
  • Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro: Đánh giá trên các dòng tế bào ung thư người gồm Hep-G2 (ung thư biểu mô gan), RD (ung thư cơ vân), Lu (ung thư phổi), PC3 (ung thư biểu mô tuyến tiền liệt) và đối chứng trên dòng tế bào lành NFE (normal fibroblast cells); xác định giá trị $\text{IC}{50}$ ($\mu\text{M}$) và chỉ số chọn lọc $SI = \text{IC}{50\text{ (NFE)}} / \text{IC}_{50\text{ (PC3)}}$.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa cơ sở lý thuyết về cây Nghệ vàng, cấu trúc hóa học và các thông số hóa lý cơ bản của 3 thành phần curcuminoid chính:

Hợp chất	Công thức / Nhóm thế	Điểm chảy ($t_{\text{nc}}$, °C)	$\lambda_{\max}$ UV-Vis trong ethanol (nm)	Tỷ lệ tự nhiên trong củ nghệ (%)
Curcumin (Cur)	$R_1 = R_2 = \text{OCH}_3$	184	429	~77%
Demethoxycurcumin (DMC)	$R_1 = \text{OCH}_3;\ R_2 = \text{H}$	172	424	~17%
Bisdemethoxycurcumin (BDMC)	$R_1 = R_2 = \text{H}$	222	419	~3%

Chương này trình bày chi tiết về các phản ứng phân hủy hóa học của curcumin trong môi trường kiềm tạo thành vanillin, feruloylmethane, ferulic acid và acetone; cơ chế quang phân đóng vòng nội phân tử khi chiếu sáng bước sóng $\lambda > 400\text{ nm}$; cơ chế chuyển hóa sinh học in vivo qua các hệ enzyme phân giải; các nghiên cứu về hoạt tính kháng viêm (ức chế chọn lọc COX-2), kháng oxy hóa (theo cơ chế HAT của nhóm methylene và OH phenol) và gây độc tế bào ung thư trên các dòng MCF-7, Hep-G2, PC3, LoVo, Jurkat. Đồng thời, chương 1 tổng kết các giải pháp nâng cao sinh khả dụng thông qua hệ dẫn truyền nano, liposome, phức phospholipid và tổng hợp hóa học các dẫn xuất este hóa, ngưng tụ dị vòng pyrazole, isoxazole.

Chương 2: Thực nghiệm và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm, hóa chất, dụng cụ và trang thiết bị nghiên cứu:

• Xây dựng sơ đồ công nghệ trích ly curcuminoid kết hợp thu nhận tinh dầu từ bột củ nghệ khô Bình Dương bằng phương pháp đun hồi lưu có sự hỗ trợ của vi sóng gia dụng (800 W). Khảo sát các thông số ảnh hưởng gồm: loại dung môi, nồng độ ethanol, tỷ lệ rắn/lỏng (R/L), thời gian chiếu xạ vi sóng và thời gian đun hồi lưu.
• Quy trình kết tinh lại phân đoạn và sắc ký cột phân lập ba cấu tử sạch: Curcumin, DMC và BDMC từ hỗn hợp curcuminoid của Viện Dược liệu trên hệ cột silica gel và hệ dung môi giải ly $\text{CH}_2\text{Cl}_2 : \text{CH}_3\text{OH}$ theo các tỷ lệ biến đổi.
• Quy trình tổng hợp 30 dẫn xuất curcuminoid bằng phản ứng ngưng tụ dị vòng hóa nhóm $\beta$-diketone với hydroxylamine, hydrazine hydrate, dẫn xuất alkylhydrazine và các phenylhydrazine mang nhóm thế có độ âm điện khác nhau.
• Quy trình phân tích định danh cấu trúc hóa học bằng các hệ phổ nghiệm MS, ESI-TOF-MS, ESI-FTICR-MS, IR, $^1\text{H}$-NMR và $^{13}\text{C}$-NMR (đo trong dung môi $\text{CDCl}_3$, $\text{DMSO-}d_6$ hoặc $\text{CD}_3\text{OD}$).
• Quy trình thử nghiệm sinh học in vitro xác định giá trị MIC đối với vi khuẩn/vi nấm, giá trị $\text{IC}_{50}$ trong phản ứng quét gốc tự do DPPH, mô hình peroxy hóa lipid MDA và thử nghiệm độc tế bào trên các dòng Hep-G2, RD, Lu, PC3 và NFE.

Chương 3: Kết quả - Bàn luận

Chương 3 trình bày toàn bộ số liệu thực nghiệm, phổ nghiệm định danh và kết quả đánh giá hoạt tính sinh học:

• Kết quả trích ly và phân tích thành phần:
  • Quy trình trích ly kết hợp cho phép thu nhận đồng thời tinh dầu và curcuminoid từ củ Nghệ vàng Bình Dương mà không cần bước rửa béo bằng dung môi không phân cực. Phân tích GC-MS xác định các thành phần chính trong tinh dầu nghệ Bình Dương gồm turmerone, ar-turmerone, curlone, ar-curcumene.
  • Phương pháp trích ly có sự hỗ trợ của vi sóng giúp rút ngắn thời gian chiết xuất và tăng hiệu suất thu hồi curcuminoid so với phương pháp chiết Soxhlet thông thường.
• Kết quả phân lập 3 thành phần curcuminoid:
  • Quá trình kết tinh lại phân đoạn kết hợp sắc ký cột silica gel với hệ dung môi dichloromethane/methanol ($\text{CH}_2\text{Cl}_2 : \text{CH}_3\text{OH} = 98:2\text{ v/v}$) đã phân lập thành công ba thành phần Curcumin, DMC và BDMC với độ tinh khiết cao (được xác nhận qua sắc ký HPLC pha đảo và điểm nóng chảy chuẩn xác: Curcumin đạt 184°C, DMC đạt 172°C, BDMC đạt 222°C).
  • Cấu trúc của cả ba hợp chất được sáng tỏ hoàn toàn qua dữ liệu phổ $^1\text{H}$-NMR và $^{13}\text{C}$-NMR.
• Kết quả tổng hợp và xác định cấu trúc 30 dẫn xuất:
  • Luận án đã tổng hợp thành công 30 dẫn xuất của curcuminoid, bao gồm: 22 dẫn xuất của curcumin, 1 dẫn xuất của demethoxycurcumin (DMC) và 7 dẫn xuất của bisdemethoxycurcumin (BDMC).
  • Trong số 30 dẫn xuất, có 10 dẫn xuất hoàn toàn mới, chưa từng được công bố trong các y văn hóa học trong nước và quốc tế.
  • Cấu trúc phân tử của toàn bộ 30 dẫn xuất được định danh chính xác bằng việc phân tích các tín hiệu dịch chuyển hóa học ($\delta$, ppm) và độ ghép cặp ($J$, Hz) trên phổ $^1\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR, kết hợp với phổ hồng ngoại IR và phổ khối lượng phân giải cao HR-MS.
• Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học:
  • Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm: Tinh dầu nghệ vàng Bình Dương và các dẫn xuất tổng hợp thể hiện hoạt tính ức chế sinh trưởng đối với nhiều chủng vi sinh vật kiểm định.
  • Hoạt tính kháng oxy hóa: Các curcuminoid tự nhiên và một số dẫn xuất giữ nguyên nhóm ortho-methoxyphenol thể hiện hoạt tính dập tắt gốc tự do DPPH mạnh. Khi cấu trúc $\beta$-diketone bị biến đổi thành dị vòng pyrazole/isoxazole, hoạt tính kháng gốc tự do DPPH có xu hướng biến đổi tùy thuộc vào nhóm thế gắn trên nhân thơm.
  • Hoạt tính gây độc tế bào ung thư: Hầu hết các dẫn xuất pyrazole và phenylpyrazole curcuminoid thể hiện hoạt tính gây độc tế bào vượt trội so với curcumin ban đầu trên các dòng tế bào ung thư khảo sát (Hep-G2, RD, Lu, PC3).
  • Đặc biệt, trong thử nghiệm trên dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt PC3, dẫn xuất số 19 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào cực mạnh với giá trị $\text{IC}{50}$ thấp hơn curcumin 38 lần (hoạt tính mạnh gấp 38 lần curcumin). Đồng thời, dẫn xuất 19 thể hiện tính chọn lọc rất cao đối với tế bào lành NFE với chỉ số chọn lọc $SI = 26$ ($SI = \text{IC}{50\text{ (NFE)}} / \text{IC}_{50\text{ (PC3)}}$) và cấu trúc phân tử hoàn toàn thỏa mãn các tiêu chuẩn của "quy tắc số 5" Lipinski.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Luận án đã đạt được các đóng góp khoa học và thực tiễn mới sau đây:

1. Về mặt công nghệ chiết tách: Xây dựng thành công quy trình công nghệ chiết xuất tích hợp thu hồi đồng thời tinh dầu và tổ hợp curcuminoid từ củ Nghệ vàng (Curcuma longa L.) Bình Dương không qua công đoạn loại béo bằng dung môi không phân cực. Quy trình này vừa tận thu được nguồn tinh dầu có giá trị dược liệu cao, vừa giảm thiểu tiêu hao dung môi hữu cơ và rút ngắn thời gian xử lý nhờ ứng dụng gia nhiệt vi sóng.
2. Về mặt phân lập hợp chất tự nhiên: Thiết lập được quy trình kết tinh lại kết hợp sắc ký cột phân đoạn cho phép phân lập độc lập cả 3 thành phần curcuminoid chính (curcumin, demethoxycurcumin, bisdemethoxycurcumin) đạt độ tinh khiết cao làm nguyên liệu tinh khiết cho nghiên cứu tổng hợp hóa dược.
3. Về mặt tổng hợp hóa học: Tổng hợp thành công 30 dẫn xuất dị vòng isoxazole, pyrazole và phenylpyrazole của curcuminoid (gồm 22 dẫn xuất curcumin, 1 dẫn xuất DMC, 7 dẫn xuất BDMC), trong đó có 10 dẫn xuất hoàn toàn mới chưa từng được công bố trong các công trình khoa học trên thế giới. Toàn bộ các dẫn xuất đã được giải đoán cấu trúc rõ ràng bằng hệ phương pháp phổ nghiệm hiện đại ($^1\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR, IR, MS, HR-MS).
4. Về mặt hoạt tính sinh học và định hướng ứng dụng: Khảo sát toàn diện hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng oxy hóa và độc tính tế bào ung thư của tinh dầu, curcuminoid và các dẫn xuất tổng hợp. Đã tìm ra dẫn xuất 19 có hoạt tính gây độc tế bào ung thư tuyến tiền liệt PC3 cao gấp 38 lần so với curcumin tự nhiên, có độ chọn lọc cao trên tế bào ung thư so với tế bào lành ($SI = 26$) và cấu trúc thỏa mãn quy tắc số 5 Lipinski, chứng minh tiềm năng phát triển thành hoạt chất điều trị ung thư tuyến tiền liệt.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Dựa trên nội dung và phạm vi nghiên cứu được công bố trong văn bản luận án, các hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp theo bao gồm:

• Các thử nghiệm hoạt tính sinh học và gây độc tế bào ung thư của 30 dẫn xuất mới chủ yếu dừng lại ở mức độ in vitro trên các dòng tế bào nuôi cấy; chưa thực hiện các thử nghiệm in vivo trên mô hình động vật sống để đánh giá dược động học và độc tính trường diễn.
• Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về cơ chế phân tử tác động của dẫn xuất 19 đối với các con đường truyền tín hiệu nội bào và tiến trình chết theo chương trình (apoptosis) trên tế bào ung thư tuyến tiền liệt PC3.
• Quy trình trích ly kết hợp có sự hỗ trợ của vi sóng cần được tiếp tục hoàn thiện và khảo sát mở rộng ở quy mô pilot (bán công nghiệp) nhằm tính toán các chỉ số kinh tế - kỹ thuật phục vụ triển khai sản xuất công nghiệp.

---

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên khảo có giá trị cao cho nhiều nhóm đối tượng:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên chuyên ngành Công nghệ Hóa học, Hóa Hữu cơ, Hóa Dược và Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên: Tham khảo phương pháp luận phân lập các cấu tử tự nhiên có cấu trúc tương đồng, quy trình tổng hợp dị vòng hóa hệ $\beta$-diketone, và đặc biệt là hệ thống dữ liệu phổ nghiệm chi tiết ($^1\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR, HR-MS) của 30 dẫn xuất curcuminoid.
• Các nhà nghiên cứu trong lĩnh vực Dược học và Sinh học Phân tử: Sử dụng các số liệu thực nghiệm về mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học (SAR), hoạt tính ức chế tế bào ung thư tuyến tiền liệt PC3 của dẫn xuất 19 để tiếp tục thiết kế và phát triển các ứng viên thuốc kháng ung thư thế hệ mới.
• Các kỹ sư công nghệ và doanh nghiệp chế biến nông sản, dược liệu: Tham khảo thông số quy trình công nghệ chiết xuất tích hợp không qua loại béo để tối ưu hóa dây chuyền thu nhận tinh dầu và curcuminoid từ nguồn nghệ vàng trong nước.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Điểm cải tiến chính trong quy trình tách chiết curcuminoid của luận án so với các phương pháp truyền thống là gì?
Quy trình của luận án thực hiện trích ly curcuminoid kết hợp thu nhận tinh dầu trực tiếp từ củ nghệ vàng mà không qua giai đoạn loại béo bằng dung môi không phân cực (như hexane hay ether dầu hỏa). Việc này giúp tận thu triệt để nguồn tinh dầu nghệ, giảm lượng dung môi hữu cơ tiêu tốn, đồng thời việc kết hợp hỗ trợ vi sóng giúp rút ngắn thời gian chiết xuất mà vẫn đảm bảo hiệu suất và độ tinh khiết cao.

2. Luận án đã tổng hợp được bao nhiêu dẫn xuất và có bao nhiêu dẫn xuất mới chưa từng công bố?
Luận án đã tổng hợp thành công 30 dẫn xuất của curcuminoid, bao gồm 22 dẫn xuất của curcumin, 1 dẫn xuất của demethoxycurcumin (DMC) và 7 dẫn xuất của bisdemethoxycurcumin (BDMC). Trong đó, có 10 dẫn xuất hoàn toàn mới chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào trong và ngoài nước.

3. Dẫn xuất số 19 thể hiện những ưu điểm nổi bật nào trong thử nghiệm hoạt tính sinh học?
Dẫn xuất 19 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ung thư tuyến tiền liệt PC3 mạnh gấp 38 lần so với curcumin tự nhiên. Hợp chất này có độ chọn lọc tế bào rất cao với chỉ số chọn lọc $SI = 26$ khi đối chứng với dòng tế bào lành NFE, đồng thời cấu trúc phân tử thỏa mãn đầy đủ "quy tắc số 5" của Lipinski, cho thấy tiềm năng phát triển thuốc điều trị ung thư tuyến tiền liệt.

4. Vì sao curcumin tự nhiên có tính khả dụng sinh học thấp trong cơ thể?
Theo tổng quan luận án, curcumin kém bền trong môi trường kiềm và trung tính, dễ bị phân hủy bởi ánh sáng. Khi vào cơ thể qua đường uống, curcumin khó tan trong nước (< 10 $\mu\text{g/mL}$ ở 25°C), bị chuyển hóa nhanh chóng tại ruột và gan bởi hệ enzyme reductase thành dihydrocurcumin, tetrahydrocurcumin, hexahydrocurcumin và bị liên hợp hóa thành dạng glucuronoside/sulfate, sau đó bị đào thải nhanh (khoảng 75% đào thải qua phân ở liều 1 g/kg), khiến nồng độ hoạt chất tự do trong huyết thanh rất thấp (sinh khả dụng chỉ đạt khoảng 1% ở liều 500 mg/kg).

5. Luận án đã sử dụng những phương pháp phổ nghiệm hiện đại nào để xác định cấu trúc các dẫn xuất tổng hợp?
Tác giả đã sử dụng đồng bộ các phương pháp phổ nghiệm hiện đại gồm: phổ khối lượng phân giải cao HR-MS (Bruker Daltonics Apex II 4.7e FTICR-MS), phổ khối lượng ESI-TOF-MS (Mariner TOF), phổ hồng ngoại FT-IR (Bruker Tensor 27), và phổ cộng hưởng từ hạt nhân $^1\text{H}$-NMR và $^{13}\text{C}$-NMR (Bruker AV 500 MHz và Varian Inova 500 MHz) để xác định chính xác cấu trúc hóa học của tất cả các hợp chất.

---

Kết luận

Luận án tiến sĩ kỹ thuật của tác giả Phan Thị Hoàng Anh đã giải quyết trọn vẹn các mục tiêu nghiên cứu từ việc khảo sát đặc tính nguồn nguyên liệu nghệ vàng Bình Dương, xây dựng quy trình công nghệ chiết xuất tích hợp thu hồi đồng thời tinh dầu và curcuminoid có hỗ trợ vi sóng, đến phân lập sạch 3 thành phần tự nhiên chính. Công trình đã tổng hợp thành công 30 dẫn xuất dị vòng isoxazole, pyrazole và phenylpyrazole của curcuminoid với 10 cấu trúc hoàn toàn mới được định danh cấu trúc rõ ràng bằng hệ phổ nghiệm hiện đại. Kết quả thử nghiệm sinh học in vitro đã phát hiện dẫn xuất 19 có hoạt tính gây độc tế bào ung thư tuyến tiền liệt PC3 vượt trội gấp 38 lần curcumin, độ chọn lọc cao ($SI = 26$) và thỏa mãn quy tắc Lipinski, mở ra hướng nghiên cứu ứng dụng triển vọng trong lĩnh vực hóa dược. Các số liệu thực nghiệm và quy trình công nghệ được trình bày trong luận án có độ tin cậy cao, đóng góp thiết thực cho cả phương diện khoa học cơ bản và thực tiễn sản xuất.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Cây Nghệ vàng (Curcuma longa L.) thuộc họ gừng (Zingiberaceae), được trồng nhiều ở những v ng khí hậu nóng âm như Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia, Jamaica, Peru.và Việt Nam. Củ Nghệ vàng từ lâu đã được su dụng rộng rãi làm gia vi, chất bảo quản và chat tao màu trong thực phẩm. Ngoài ra, củ Nghệ vàng c ng là một trong những phương thuốc dân gian hiệu quả trong chữa trỊ nhiều loại bệnh như vàng da, các bệnh về gan, dạ dày, u nhọt, viêm khớp.Trong những thập kỷ gần đây có rất nhiều nghiên cứu đã được công bố về hoạt tính sinh hoc và được học của củ Nghệ vàng c ng như các thành phan chiết xuất từ củ Nghệ vàng, trong đó curcuminoid và tinh dau đã được chứng minh là những thành phần chính tạo nên dược tính cao của củ Nghệ vàng. Việt Nam có nguồn Nghệ vàng phong phú, phân bố ở nhiều tỉnh thành như V nh Phúc, Hải Dương, Hưng Yên, Nghệ An, Quảng Nam, Đồng Nai, Bình Dương.

Thanh phân, hàm lượng curcuminoid và tinh dầu trong củ Nghệ vàng ở các v ng khác nhau có sự thay đổi lớn do ảnh hưởng của điều kiện khí hậu, thé như ng, điều kiện trồng trọt, chăm sóc.Việc nghiên cứu về đặc trưng củ Nghệ vàng của mỗi v ng sẽ giúp đánh giá đầy đủ hơn giá trị sử dụng, từ đó có được sự định hướng tốt hơn cho việc phát triển nguồn Nghệ vàng trong nước. Các nghiên cứu về Nghệ vàng ở trong nước cho đến nay chủ yếu mới chỉ tập trung ở một số v ng Nghệ vàng phía Bắc như ở H a Binh, V nh Phúc, Hưng Yên. Chính vì vậy, để góp phan vào việc tìm hiểu thêm về các nguôn Nghệ vàng khác trong nước, trong dé tài nay, chúng tôi chọn đối tượng nghiên cứu là củ Nghệ vàng (Curcuma longa L.) thu hái tại Bình Dương, với đề tài “Nghiên cứu quy trình tách chiết, tong hợp dan xuất và xác định tinh chất, hoạt tinh của tinh dau và curcumin trích từ cây Nghệ vàng (Curcuma longa L. Quy trình phân lập curcuminoid từ củ Nghệ vàng được định hướng khảo sát là trích ly curcuminoid kết hợp tách tinh dầu va không qua giai đoạn loại béo.

So với những quy trình hiện sử dụng để tách curcuminoid từ củ Nghệ vàng, quy trình này sẽ giúp tận thu được nguôn tỉnh dầu từ củ Nghệ, giảm lượng dung môi hữu cơ sử dụng mà vẫn đảm bảo thu được curcuminoid từ củ Nghệ vàng với hiệu suất và độ tinh khiết cao. Với mục tiêu trên, chúng tôi hy vọng sẽ góp phần tìm ra một quy trình mới có tính ứng dụng cao đề có thê mở rộng ở quy mô sản xuât lớn hơn. Một hướng nghiên cứu thứ hai quan trọng và trọng tâm của công trình này là tong hợp dẫn xuất của curcuminoid và khảo sát hoạt tinh sinh học. Curcumin mặc dù đã được chứng minh có rất nhiều hoạt tính mạnh và đa dạng, một trong những nhược điểm lớn của curcumin là tính khả dụng sinh hoc (bioavailability) thấp thể hiện ở sự hap thu kém, sự chuyền hóa nhanh và sự dao thai lớn khi vào cơ thé.

Chính những yếu tố trên đã làm ảnh hưởng lớn đến dược Ì của curcumin. Phương pháp biến đổi cau trúc curcumin nhằm cải thiện hoạt tính và tính khả dung sinh học là hướng nghiên cứu đang rất được quan tâm hiện nay. Mặc d chưa có nhiều nghiên cứu về mối quan hệ giữa sự biến đối cấu trúc curcumin với sự cải thiện tính khả dụng sinh học của curcumin, rất nhiều dẫn xuất c ng đã được chứng minh in vitro và in vivo có hoạt tinh sinh học cao hon curcumin. Đặc biệt trong số đó, các dẫn xuất isoxazole, pyrazole curcumin va dẫn xuất của pyrazole curcumin được chứng minh có nhiều hoạt tính sinh học mạnh hơn so với curcumin như hoạt tính kháng oxy hóa, kháng viêm, ức chế chọn loc enzyme COX-2 và đặc biệt là hoạt tính kháng ung thư.

Việc bién đổi cau trúc B- diketone của curcumin thành các dị v ng isoxazole, pyrazole đã được chứng minh giúp tăng hoạt tính gây độc tế bào ung thư của curcumin với nhiều d ng tế bào khác nhau. Chính vi vậy trong dé tài nghiên cứu này, các dan xuất isoxazole và pyrazole curcuminoid được định hướng tong hop, dong thời khảo sát một số hoạt tính sinh hoc của các dân xuất này so với curcumin như hoạt tính kháng khuẩn, kháng oxy hóa và kháng ung thư.1 Tông quan về curcumin Cây Nghệ vàng có tên khoa hoc là Curcuma longa L. thuộc họ gừng (Zingiberaceae). Trên thé gidi, Nghé vang phan bố ở các v ng nhiệt đới, cận nhiệt đới và được trồng chủ yếu ở các nước châu Á như Ấn Độ, Trung Quốc, Pakistan, Bangladesh, Indonesia.

và Việt Nam [1]. Thanh phan hóa học chính quan trọng nhất của thân rễ Nghệ vàng là curcuminoid (~ 2-8 %), thành phần tạo màu vàng cho củ Nghệ. Hỗn hợp curcuminoid bao gồm 3 thành phần chính : curcumin (Cur), demethoxycurcumin (DMC) và bisdemethoxycurcumin (BDMC) (hình 1.1) chiếm lần lượt khoảng 77 %, 17 %, 3 % [1-4]. HO Oy Ô OH ann, O O (I) R,=R,=OCH; (Curcumin) (2) R,;=OCH3, R;=H (Demethoxycurcumin) (3) R,=R,=H (Bisdemethoxycurcumin) Hình 1.

Cấu trúc của các thành phần curcuminoid [1] Curcumin, danh pháp quốc tế 1,7-bis-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-hepta- 1 ,6- diene-3,5-dione, chiếm hàm lượng cao nhất trong 3 thành phan và c ng được chứng minh có nhiều hoạt tính sinh học mạnh va đa dạng hơn so với 2 thành phan c n lại.2 Một số tính chat hóa lý của curcumin Curcumin là chất ran kết tinh màu vàng cam, tan trong chất béo, ethanol, methanol, dichloromethane, acetone, acetic acid băng và hầu như không tan trong nước ở môi trường acid hay trung tính (độ tan < 10 pg/ml ở 25°C). Trong môi trường kiềm, curcumin tạo dung dịch màu đỏ [1, 4, 5|. Dung dịch cureumin trong dung môi hữu cơ có độ hấp thu cực đại ở bước sóng từ 420-430 nm (bảng 1. Các thông số hoa! của các thành phần curcuminoid [6].

Đặc trưng Thông sô Curcumin DMC BDMC Diém chay (°C) 184 172 222 UV-Vis Amax trong ethanol (nm) 429 424 419 1.1 Sự phân huy curcumin trong môi trường kiểm Dung dịch curcumin có màu không ổn định do sự phân hủy của curcumin hoặc do thay đối dung môi. Trong môi trường acid, dung dịch có mau vàng và chuyển sang đỏ nâu và đỏ đậm trong môi trường kiềm. Phố hap thu trong môi trường acid, base thé hiện trong hình 1.6 3 ® 424 = 124 = = if = = 1 S an sử z2 ¬ 2 081) Ÿ E 0. 0 0 T T T T T T = T 20 260 300 340 380 420 460 590 540 220 260 300 340 380 420 460 500 540 , Wavelenctt Wavelength [nm] a) avelength [nm] b) Time[hours| 0.

a) Phố UV-Vis của curcumin. — dung dich curcumin 3,09 x 10° M trong NaOH 0,5M, --- dung dich curcumin 3,04 x 10°M trong acetic acid bang; b) Phé UV- Vis cua dung dich curcumin 4,99 x 10°M trong NaOH 0,091M theo thoi gian [7] Độ bén của curcumin phụ thuộc vào pH môi trường [8, 9], phản ứng phân hủy xảy ra nhanh hơn trong môi trường trung tính — kiểm [9]. Khi tiếp xúc liên tục với môi trường kiềm sẽ có sự thay đổi mau rất rõ rệt sang mau vàng nâu hoặc vang nhạt (gần như không mau). OCH; /' OCH, OH ' AS OH radical O Y O CHO Sản phẩm ngưng tụ oO S HO~ ~~ HO + AY HO OH OCH 3 OCH 3 OCH; vanillin acetone feruloylmethane ferulic acid Hình 1.

Các sản phẩm phân hủy curcumin trong môi trường kiềm [8] Nghiên cứu của Tonnesen và cộng sự [8] cho thay, phan ứng phân hủy curcumin trong dung dịch pH 8,5 xảy ra nhanh ngay sau 5 phút. SKBM của dung dich curcumin bị phân hủy hoàn toàn cho 8-17 vết, phụ thuộc vào thời gian phản ứng và pH môi trường. Các sản phẩm phân hủy của curcumin được nhóm tác giả xác định thông qua HPLC — MS bao gồm ferulic acid, feruloylmethane và các sản phẩm phân hủy của feruloylmethane là vanilin và acetone (hình 1. Màu vàng đến vàng nâu của dung dịch được dự đoán là do các sản phẩm ngưng tụ từ thành phân feruloylmethane.

Trong môi trường giả sinh | (đệm phosphate, pH 7.2, 37°C ) không có huyết thanh, 90 % curcumin phân hủy trong 30 phút. Tuy nhiên khi có mặt huyết thanh, curcumin bén hơn: trong môi trường nuôi cấy tế bao chứa 10 % huyết thanh bao thai b_ và trong máu người, sau 1 giờ chỉ ít hơn 20 % curcumin bị phân hủy va sau 8 giờ, chỉ khoảng 50 % curcumin bi phân hủy. Sản phẩm chính trong phan ứng phân hủy được xác định là trans-6-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2,4-dioxo-5-hexenal, vanilin, ferulic acid và feruloylmethane [9].2 Dé bên quang hóa của curcumin Curcumin đã được WHO thông qua là chất màu trong thực phẩm [10]. Tuy nhiên curcumin không thích hợp cho mọi loại sản phẩm do nó mat màu rất nhanh khi tồn trữ trong môi trường kiềm.

Ngoài ra, curcumin c ng dễ bị quang phân dưới tác dụng của bức xạ UV-Vis cả ở dạng h a tan và dạng mang ran [11]. SKBM của dung dich curcumin trong isopropanol (1 mg/100 ml) sau khi chiếu xạ dưới ánh sáng 400-510 nm trong 245 phút cho 1 sản phẩm phân hủy chính có R; gan với curcumin, được xác định (bang phương pháp MS, NMR) là do sự v ng hóa của curcumin (sản phẩm I, hình 1. Phản ứng đóng v ng dé xuất cho curcumin khi phơi sáng (A > 400 nm) [11] Ngoài sản phẩm chính v ng hóa, có 6 sản phẩm phụ khác được xác định băng MS va HPLC, gồm có vanillin, vanillic acid, ferulic aldehyde, ferulic acid va 4- vinyl guaiacol (hình 1. O O HO OH hv hv hv HạCO CHO HạCO S HạCO N CH -~----- OH | Con, HO HO HO HạCO 0 eee.

màRate le OH Hinh 1. Su phan huy cua curcumin trong isopropanol (A > 400 nm) [11] Dưới tac dung cua bức xa liên tục ở 240-600 nm, curcumin phan hủy nhanh hon. Sau 100 phút dung dịch mat màu hoàn toàn. Kết qua GC-MS cho nhiều sản phẩm phân hủy khác chứng tỏ tác động của tia UV đã gây sự thay đổi đáng ké trong cấu trúc curcumin.

Sự quang phan curcumin chịu ảnh hưởng của dung môi [11]. Trong methanol tốc độ quang phân của curcumin chậm nhất so với trong ethyl acetate, chloroform, va acetonitrile, có thé do dung môi hỗ trợ sự hình thành các liên kết hydro nội phân tử và liên phân tử trong curcumin và khả năng lọc sáng (inner-filter) của dung môi. Tốc độ mat mau của curcumin ở 400-750 nm chậm lại khi có mặt các tác nhân dập tắt oxygen singlet như B-carotene hoặc DABCO (1 4-diazabicylco-(2,2,2)octane), trong khi đó các tác nhân nhạy sáng như methylene blue xúc tác, lam tăng tốc cho phản ứng quang phân curcumin.