CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Giới thiệu một số phương pháp nhân giống ở thực vật - Nhân giống bằng phương pháp gieo hạt: Đây là hình thức nhân giống khá khổ biến, dễ thực hiện, giá thành sản xuất thấp. Tuy nhiên, cây giống gieo từ hạt dễ phát sinh biến dị do thụ phấn chéo, khó giữ được đặc tính, năng suất ban đầu. Với phương pháp này, trên quy mô sản xuất, chỉ nên áp dụng đối với những đối tượng có khả năng hạt nảy mầm cao, đồng đều.
Quy trình sản xuất hạt giống cần đảm bảo tạo ra nguồn hạt giống đảm bảo tính xác thực về di truyền, hình thái và chất lượng với nguồn gen vật liệu nhân giống khi được cung cấp cho sản xuất gieo trồng ở thế hệ tiếp theo [16]. - Giâm cành: là một trong những phương pháp nhân giống vô tính, được sử dụng khá rộng rãi tỏng nghề trồng trọt, nhất là trong sản xuất cây ăn quả, cây công nghiệp., và cả cây cảnh. Ưu điểm cơ bản là giữ được hầu hết các đặc điểm của cây giống (cây mẹ), tức là cây mới được tạo ra không bị phân ly, biến dị. Đây là đặc tính rất quý trong việc chọn tạo giống mới.
Tuy nhiên số lượng cây giống tạo ra không nhiều. - Chiết cành là phương pháp nhân giống vô tính cây trồng bằng cách cho một cành hay một đoạn cành ra rễ trên cây, sau đó tách khỏi cây mẹ, đem trồng thành cây mới. - Ghép cây là tách rời một mắt ghép, một chồi non vừa lú ra ở nách lá hoặc một đoạn thân non của cây có những đặc tính nổi bật đặt vào một cây khác có đặc tính sống khoẻ và phát triển tốt, còn gọi là gốc ghép (gốc tháp) tiếp tục sống và tăng trưởng nhờ vào gốc ghép. Cây ghép giữ được các đặc tính của giống muốn nhân.
Tuy nhiên, lấy mắt ghép liên tục nhiều đời của một giống để ghép có thể dẫn đến hiện tượng thoái hóa giống. - Nhân giống in vitro: Nuôi cấy mô tế bào thực vật là tổng hợp những kỹ thuật được sử dụng để duy trì và nuôi cấy các tế bào, mô hoặc cơ quan thực vật trong điều kiện vô trùng trên môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng với những thành phần đã xác định. Mặc dù chi phí đầu tư ban đầu cao, nhưng mang lại hiểu quả rất lơn cho sản xuất. Tạo ra chính xác số cây nhân bản giúp tạo ra các loại hoa, quả chất lượng cao hoặc có những tính trạng mong muốn khác.
Tạo ra các cây trưởng thành một cách nhanh chóng, tạo ra hàng loạt các cây mà không cần đến hạt hoặc quá trình thụ phấn để tạo 3 Luan van hạt, tái sinh cây hoàn chỉnh từ các tế bào thực vật đã được biến đổi gen. Tạo ra các cây trong điều kiện vô trùng, để có thể vận chuyển mà hạn chế tối đa khả năng phát tán bệnh, sâu bệnh hoặc các nhân tố gây bệnh. Có thể tạo ra các cây từ hạt mà nếu không có nuôi cấy mô thì thường có tỷ lệ nảy mầm thấp hoặc sinh trưởng yếu, ví dụ: hoa lan hoặc cây nắp ấm, làm sạch các cây bị nhiễm virus nhất định hoặc các nhân tố lây nhiễm khác và nhân nhanh các cây này như là nguồn nguyên liệu sạch phục vụ đồng ruộng và nông nghiệp [4], [8]. Giới thiệu về phương pháp nhân giống in vitro Kỹ thuật nuôi cấy mô tê bào thực vật hay nhân giống in vitro đều là thuật ngữ mô tả nuôi cấy mô các bộ phận thực vật (tế bào đơn, mô, cơ quan) trong ống nghiệm chứ môi trường chất dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, đường và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong điều kiện vô trùng [2].
Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật cho phép tái sinh chồi hoặc cơ quan từ mô lá, thân, hoa, rễ, củ hoặc đỉnh sinh trưởng. Trước kia người ta dùng phương pháp này để nghiên cứu đặc tính cơ bản của tế bào và mô trong quá trình nuôi cấy. Hiện nay các nhà khoa học sử dụng hệ thống nuôi cấy mô thực vật để nghiên cứu các vấn đề liên quan thực vật. Kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật cũng mở rộng tiềm năng nhân giống vô tính đối với các loại cây quan trọng, có giá trị về mặt kinh tế và thương mại trong đời sống hằng ngày của con người [2].
Các yếu tố ảnh hưởng đến đến quá trình nhân giống in vitro 1. Mẫu nuôi cấy Theo lý thuyết tất cả các mô chưa hóa gỗ đang sinh trưởng mạnh như: mô phân sinh ngọn, tượng tầng, đầu rễ, phôi đang phát triển, thịt quả non…, khi đặt vào môi trường có chứa một lượng hormon thích hợp đều có khả năng tạo mô sẹo. Tuy nhiên, mỗi tế bào ở mỗi mô khác nhau có khả năng tạo mô sẹo, phân hóa thành rễ, thân, cành, lá… rất khác nhau. Do đó kết quả thu được cũng rất khác nhau ở những mẫu khi đưa vào nuôi cấy.
Việc chọn mẫu thực vật để sử dụng trong quá trình nuôi cấy có vai trò quyết định, nếu chọn sai mẫu chúng ta sẽ không thu nhận được kết quả, hoặc thu được những cây sẽ không phát triển mạnh, thậm chí cây có thể ngưng phát triển ở một giai đoạn nhất định. Các kết quả nghiên cứu cho thấy để bắt đầu nghiên cứu nhân giống vô tính một cây nhất định, người ta chú trọng đến các chồi bên và mô phân sinh đỉnh [4]. Vô trùng trong nuôi cấy Môi trường nuôi cấy mô thực vật có chứa đường, muối khoáng và vitamin, thích hợp cho các loài nấm, vi khuẩn phát triển. Do tốc độ phân chia tế bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn rất nhiều so với tế bào thực vật.
Nếu môi trường nuôi cấy bị nhiễm vài bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày đến một tuần toàn bộ bề mặt môi trường nuôi cấy và mẫu cấy sẽ phủ đầy nấm, khuẩn, thí nghiệm phải loại bỏ vì trong điều kiện này mô cấy không thể phát triển và chết dần. Khác với thí nghiệm vi sinh có thể kết thúc trong vài ngày, mức độ vô trùng trong thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật đòi hỏi rất cao mới có hi vọng thành công. Để đảm bảo điều kiện vô trùng trong quá trình nuôi cấy đòi hỏi chúng ta phải thực hiện các yêu cầu sau: - Vô trùng mô cấy. - Vô trùng dụng cụ thủy tinh, môi trường và nút đậy.
- Trong thao tác nuôi cấy cần phải tránh làm rơi nấm, khuẩn lên bề mặt môi trường nuôi cấy. Mô cấy có thể là các bộ phận khác nhau của thực vật, tùy theo sự tiếp xúc với môi trường bên ngoài mà các bộ phận này chứa nhiều hay ít vi khuẩn, nấm. Phương pháp vô trùng mẫu cấy phổ biến hiện nay là dùng các chất hóa học có hoạt tính diệt nấm, khuẩn. Hiệu lực diệt nấm, khuẩn của các chất này phụ thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng trên bề mặt mô cấy.
Các chất kháng sinh ít được sử dụng vì tác dụng không triệt để và ảnh hưởng xấu lên sự sinh trưởng của mô cấy. Ngoài ra, người ta còn sử dụng các chất làm giảm sức căng bề mặt như: Tween 80, fotoflo, teepol vào dung dịch diệt nấm khuẩn. Nồng độ và thời gian khử trùng của một số tác nhân vô trùng Tác nhân vô trùng Nồng độ Thời gian xử lý (phút) Hiệu quả Hypochloride Canxi 9-10% 5-30 Rất tốt Hypochlotide Natri 2-10% 5-30 Rất tốt Nước Brom 1-2% 2-10 Tốt HgCl2 0,1-1% 2-10 Trung bình Chất kháng sinh 4-50mg/l 30-60 Khá tốt H2O2 10-12% 5-15 Tốt 5 Luan van 1. Môi trường nuôi cấy Môi trường là yếu tố quan trọng cho sự sinh trưởng và phát triển của mô tế bào, là nguồn cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết nhằm duy trì sự sống, sinh trưởng và phát triển của tế bào trong quá trình nuôi cấy.
Việc lựa chọn môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào từng loài thực vật được nuôi cấy. Thành phần của môi trường nuôi cấy mô gồm: - Các chất vô cơ: Các chất dinh dưỡng vô cơ là các nguyên tố khoáng được cung cấp dưới dạng đa lượng và vi lượng. Sự sinh trưởng của thực vật trong nuôi cấy in vitro yêu cầu cần phải có cả các nguyên tố đa lượng và nguyên tố vi lượng kết hợp với nhau. Các nguyên tố đa lượng được sử dụng ở nồng độ lớn hơn 5 mM/L.
Bao gồm các nguyên tố sau: nitrogen (N), potassium (K), phosphorus(P), calcium (Ca), magnesium (Mg) và sulphur (S) ở dạng muối khoáng trong môi trường. Môi trường nuôi cấy chứa ít nhất 25 mM/L nitrogen (N) và potassium (K), các nguyên tố khác khoảng 1-3 mM/L [8], [17]. Các nguyên tố vi lượng được sử dụng ở nồng độ nhỏ hơn 0,05 mM/l. Bao gồm các nguyên tố: iron (Fe), manganese (Mn), zinc (Zn), boron (B), copper (Cu) và molybdenum (Mo).
Các nguyên tố khoáng này mặc dù với nồng độ nhỏ nhưng cần thiết cho sự sinh trưởng ở thực vật. Nguyên tố quan trọng nhất là Fe, Fe chỉ có hiệu quả ở pH thấp, chính vì vậy nó được cung cấp ở dạng FDTA – Fe phức tạp để có hiệu quả ở pH khác nhau ở dạng này không bị kết tủa và giải phóng dần ra môi trường theo nhu cầu của mô thực vật [8]. - Nguồn cacbon: Nguồn cacbon giúp mô, tế bào thực vật tổng hợp nên chất hữu cơ giúp tế bào phân chia, nguồn cacbon bổ sung vào môi trường ở dạng đường [8]. Đường là một phần rất quan trọng của môi trường dinh dưỡng, như là nguồn năng lượng.
Vì hầu hết thực vật nuôi cấy mô không thể quang hợp hiệu quả do sự phát triển tế bào và mô kém, thiếu chất diệp dục, hạn chế trao đổi khí và CO2 trong bình nuôi cấy. Do đó khả năng tự dưỡng kém, phải cần có nguồn cacbon bên ngoài để tạo năng lượng, nguồn cacbon thích hợp nhất là sucrose ở nồng độ 20 – 60 g/l. Trong khi hấp khử trùng môi trường, sucrose bị thủy phân thành glucose và fructose, được sử 6 Luan van dụng cho sự tăng trưởng của thực vật nuôi cấy mô, fructose nếu hấp môi trường sẽ gây độc hại cho cây [8], [17]. - Các chất hữu cơ: + Vitamin Là những chất hữu cơ cần thiết cho quá trình trao đổi chất, là thành phần của các enzim, do đó, muốn cây phát triển tốt thì môi trường nuôi cấy cần bổ sung các vitamin.
Thiamine (B1), acid nicotinic (B3), pyridoxine (B6), acid pantothenic (B5) là các vitamin thường được sử dụng. Trong đó B1 bổ sung vào môi trường để tham gia vào quá trình chuyển hóa carbohydrate [5], [17].