MỞ ĐẦU Cá là món ăn giàu năng lượng được ưa thích và cũng chứa nhiều nguy cơ mầm bệnh tiềm tàng nếu chưa được nấu chín. Nhiều thống kê đã chỉ ra rằng có khoảng 50 loại giun sán ký sinh chủ yếu được tìm thấy ở các loại hải sản, trong đó phổ biến là những loại cá nước ngọt. Nhiễm sán lá gan nhỏ là bệnh gắn liền với tập quán ăn gỏi cá từ lâu đời ở nhiều vùng trong cả nước như: Ninh ình, Nam Định, Hòa ình, Phú Yên, ình Định… Theo ước tính trên thế giới số người mắc sán lá gan nhỏ khoảng 45 triệu người, số người có nguy cơ mắc khoảng hơn 600 triệu [13]. Tại Việt Nam đã phát hiện được hai loài sán lá gan nhỏ là Clonorchis sinensis và Opisthorchis viverrini với hai vùng dịch tễ rõ rệt.sinensis lưu hành cao ở vùng đồng bằng Bắc bộ như Nam Định, Hoà Bình, Ninh Bình 20-30%.
Trong khi đó loài sán lá gan nhỏ O. viverrini lưu hành chủ yếu ở các tỉnh phía Nam như Phú Yên có tỷ lệ nhiễm 36,9%, ình Định 11,9%, Đăk Lăk 7,6%, Đà Nẵng 0,3%, Quảng Nam 4,6%, Khánh Hoà 1,4% [9]. Sán lá gan nhỏ ký sinh gây tổn thương gan, lách, tụy. Nhiễm sán lá gan nhỏ gây tăng sinh tổ chức xơ trong gan, ống mật có thể dày lên và có khi gấp 2-3 lần bình thường; ống tụy có thể dày; lách có khi sưng to và xơ hóa; đặc biệt nhiễm sán lá gan nhỏ kéo dài sẽ ảnh hưởng đến chức năng gan, dẫn đến xơ gan, có thể gây ung thư đường mật và gây tử vong [2], [13].
Tuy nhiên, từ khi nhiễm sán lá gan nhỏ đến khi xuất hiện các triệu chứng bệnh lý là một khoảng thời gian dài không có triệu chứng lâm sàng hoặc các triệu chứng không đặc hiệu. Do không biểu hiện rầm rộ như những bệnh khác nên dễ bị lãng quên, ít được quan tâm. Thậm trí cho đến khi triệu chứng tổn thương gan đã rõ, nhiều bác sĩ lâm sàng vẫn không nghĩ đến nguyên nhân là do sán lá gan nhỏ. Vì vậy, việc chẩn đoán xác định bệnh sán lá gan nhỏ cần dựa vào các xét nghiệm cận lâm sàng [19], [46].
Xét nghiệm tìm thấy trứng sán trong phân hoặc dịch tá tràng bằng phương pháp Kato- atz được WHO (1994) đưa ra như là tiêu chuẩn vàng chẩn đoán xác 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Mặc dù vậy, tùy vào giai đoạn nhiễm và mức độ đào thải trứng qua phân mà xét nghiệm trứng trong phân có thể bỏ sót, không phát hiện được, độ nhạy không cao (chỉ khoảng 30%), độ đặc hiệu phụ thuộc nhiều vào kinh nghiệm của kỹ thuật viên, dễ nhầm lẫn giữa trứng của các loài sán lá gan nhỏ và với trứng của sán lá ruột nhỏ [46]. Chẩn đoán bằng sinh học phân tử sử dụng các gen đích ITS1, ITS2 và DNA ty thể với các kỹ thuật PCR, real time PCR để chẩn đoán sán lá gan nhỏ O. sinensis cho độ nhạy và độ đặc hiệu cao [18], [20], [24].
Tuy vậy chưa được áp dụng rộng rãi do giá thành cao và kỹ thuật phức tạp, hạn chế khi thực hiện tại những phòng xét nghiệm được trang bị nghèo nàn [11]. Gần đây, cùng với sự ra đời của một số kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt axit nucleic, việc ứng dụng phát triển các kỹ thuật đẳng nhiệt phát hiện nhanh các ký sinh trùng gây bệnh đã được đơn giản hóa thêm một bước. Trong đó kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt mạch vòng (LAMP-Loop-Mediated Isothermal Amplification) được sử dụng phổ biến hơn cả. Hơn nữa, với khả năng phát hiện trực tiếp sản phẩm của phản ứng LAMP, không cần điện di là một trong các ưu điểm nổi trội của phương pháp này, giúp đơn giản hóa và rút ngắn thời gian phân tích [4],[19], [37].
Ở Việt Nam, đến nay chủ yếu vẫn sử dụng phương pháp xét nghiệm bằng Kato- atz để phát hiện nhiễm sán lá gan nhỏ, hiện chưa có nghiên cứu nào về ứng dụng kỹ thuật LAMP phát hiện sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis trên người. Do vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật LAMP để chẩn đoán xác định nhiễm sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis trên người” với mục tiêu: 1. Thiết lập quy trình kỹ thuật LAMP để phát hiện nhiễm sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis trên người. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của quy trình kỹ thuật LAMP trong xác định sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis trên mẫu phân thu thập từ người bệnh.
2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Bệnh sán lá gan nhỏ Bệnh sán lá gan nhỏ là bệnh mắc phải do nhiễm sán lá gan nhỏ thuộc chi Clonorchis và Opisthorchis. Trên thế giới, có 3 loài sán lá gan nhỏ gây bệnh ở người là Clonorchis sinensis; Opisthorchis viverrini; Opisthorchis felineus.Ở Việt Nam, bệnh do hai loài sán Clonorchis sinensis hoặc Opisthorchis viverrini ký sinh trong đường mật gây nên [2]. Các triệu chứng lâm sàng Giai đoạn mới nhiễm Người bệnh thường không có triệu chứng rõ rệt, một số trường hợp có rối loạn tiêu hoá, ăn chậm tiêu, mệt mỏi.
Giai đoạn phát bệnh Người bệnh có thể có một trong số các triệu chứng như rối loạn tiêu hoá, đau tức hạ sườn phải và vùng gan, đôi khi có cơn đau gan điển hình và kèm theo vàng da, nước tiểu vàng. Một số trường hợp người bệnh bị xạm da, gan có thể sưng to dưới bờ sườn với mật độ mềm, mặt nhẵn và tiến triển chậm, lúc này có thể đau điểm túi mật, viêm đường mật hoặc viêm tụy. Giai đoạn mạn tính Người bị nhiễm sán lá gan nhỏ có thể ăn kém, gầy yếu, sụt cân, giảm sức lao động, đường mật dày lên, kém đàn hồi, có thể bị tắc, có thể xơ gan, cổ trướng và chết. Đặc biệt sán lá gan có thể đẫn đến ung thư đường mật.
Các phương pháp chẩn đoán[1] Chẩn đoán lâm sàng Dựa vào các triệu trứng lâm sàng như rối loạn tiêu hoá, ậm ạch khó tiêu, đau tức vùng gan, có thể biểu hiện viêm đường mật hoặc viêm tụy. Dựa vào tiền sử như sống trong vùng dịch tễ sán lá gan hoặc đã từng ăn gỏi cá nghĩ đến bệnh sán lá gan. Chẩn đoán cận lâm sàng Dựa vào kết quả của các xét nghiệm cận lâm sàng gồm: 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Xét nghiệm phân có trứng sán lá gan trong phân hoặc dịch tá tràng là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán xác định. Siêu âm gan có hình ảnh gan tăng sáng, ống mật có thể bị giãn, thành ống mật và thành túi mật dày.
Công thức máu: Bạch cầu ái toan, chức năng gan. Miễn dịch học: Với độ chính xác phụ thuộc nguồn kháng nguyên hay kháng thể sử dụng làm chuẩn. Các xét nghiệm sinh học phân tử: PCR, real time PCR, đến nay đã có nhiều tác giả đề xuất kỹ thuật LAMP cho xét nghiệm phát hiện sán lá gan nhỏ [15], [31]. Đặc điểm phân loại, hình thái của sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis 1.
Phân loại Giới: Animalia (Linnaeus, 1758) Ngành: Platyhelminthes (Claus, 1887) Lớp: Trematoda (Rudolphi, 1808) Bộ: Opisthorchiida (La Rue, 1957) Họ: Opisthorchiidae (Looss, 1899) Chi: Clonorchis (Looss,1907) Loài: sinensis (Looss,1907) 1. Hình thái sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis 1. Sán trưởng thành Con sán hình chiếc lá nhỏ (bằng hạt thóc lép) dài 10 - 20 mm, rộng 2 - 4 mm, có 2 mồm hút (hấp khẩu). Sán lưỡng tính có nghĩa là trên một con sán có 2 bộ phận sinh dục đực và cái, dựa vào hình dạng tinh hoàn người ta xác định loài của sán.
Clonorchis sinensis có tinh hoàn phân nhánh, khác với loài Opisthorchis viverrini có tinh hoàn phân thùy. 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Hình thể, cấu tạo sán lá gan nhỏ C. sinensistrƣởng thành[2] 1.
Đặc điểm hình thái trứng sán lá gan nhỏ Trứng có kích thước 26 - 30 x 16 - 17 m có nắp ở đầu và gai nhỏ ở cuối, nhìn dưới kính hiển vi giống như hạt vừng. Sán lá gan nhỏ và trứng sán lá gan nhỏ [2] 1. Chu kỳ phát triển của sán lá gan nhỏ Sán trưởng thành ký sinh ở đường mật, đẻ trứng, trứng theo mật xuống ruột rồi theo phân ra ngoài. Trứng được rơi vào môi trường nước.
Trứng bị ốc nuốt và nở ra ấu trùng lông trong ốc để phát triển thành ấu trùng đuôi. Ấu trùng đuôi rời ốc bơi tự do trong nước. Ấu trùng đuôi xâm nhập vào cá nước ngọt, rụng đuôi phát triển thành ấu trùng nang (nang ấu trùng) ở trong thịt của cá (bằng mắt thường khó nhìn thấy ấu trùng nang). Người (hoặc động vật) ăn phải cá có ấu trùng nang chưa được nấu chín.
Sau khi ăn, ấu trùng này vào dạ dày, xuống tá tràng rồi ngược theo đường mật lên gan, nở ra sán lá gan trưởng thành, ký sinh và gây bệnh ở đó [2], [23]. 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Chu kỳ phát triển của sán lá gan nhỏ [2] 1. Một số đặc điểm di truyền phân tử của sán lá gan nhỏ sử dụng trong giám định lo i 1.DNA ribosome(rDNA)trong hệ gen nhân Đơn vị phiên mã ribosome (rTU) của rDNA thường được sử dụng để chuẩn đoán phân tử và nghiên cứu hệ thống, phát sinh gen.
Một rTU của ba vùng mã hóa bao gồm các gen: 18S, 5.8S và 28S được phân tách bằng hai vùng giao gen (ITS1 và ITS2) [27], [29] (Hình 1. Vùng ITS1 và ITS2 thường được sử dụng trong giám định sán lá gan nhỏ [27]. Minh họa rTU eukaryote [44] 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Đoạn gen của rDNA chứa các vùng 18S, 5.8S và 28S tạo thành một cụm lặp đi lặp lại song song. NTS: không được phiên mã spacer, ETS: spacer sao chép bên ngoài, ITS: spacers phiên mã nội bộ 1 và 2, được đánh số từ 5’ kết thúc [44].
- Các đoạn gen ITS (internal transcribed spacer) nằm trên RNA ribosome, là một đoạn gen không chức năng (không mã hóa) nằm giữa các tiểu đơn vị lớn (28S) và tiểu đơn vị nhỏ (18S) [12]. + ITS gồm ITS1 và ITS2 ngăn cách bởi vùng gen rRNA 5,8S. Đây là khu vực điển hình được bảo tồn tương đối trong một loài hoặc một chi, do vậy rất hữu ích để xác định ranh giới loài [36]. + Vùng ITS1 có khả năng bảo tồn cao hơn vùng ITS2.
ên cạnh đó, vùng đầu 5’ của ITS1 có độ biến thiên cao hơn vùng đầu 3’, điều này cho phép phân biệt giữa các loài. Tuy nhiên, hạn chế của việc sử dụng ITS1 trong những nghiên cứu sinh học phân tử là sự hiện diện của các đoạn trình tự lặp lại. Hầu hết vùng ITS1 có cấu trúc gồm 3 yếu tố lặp lại: một là tại đầu ngắn 5’; hai là tại đầu 3’; ba là bên trong vùng ITS1 chứa ít nhất 2 đoạn lặp.