ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của ngành công nghiệp dược trên thế giới, ngành dược Việt Nam ngày càng phát triển với hơn 220 nhà máy sản xuất đạt GMP-WHO, GMP-EU, sản xuất các thành phẩm, đa phần là thuốc generic, trong đó phổ biến nhất là nhóm thuốc kháng viêm, thuốc điều trị bệnh gout, kháng sinh, đái tháo đường, tim mạch. Trong các nhóm thuốc điều trị bệnh gout mãn tính hay tăng acid uric huyết, allopurinol đã được Bộ Y tế đưa vào danh mục thuốc thiết yếu lần VII năm 2018 [2], và được chỉ định thường quy trong điều trị bệnh gout và tăng uric huyết thứ phát do hóa trị bệnh bạch cầu hay ung thư. Do đó allopurinol là một trong các thuốc được sản xuất bởi nhiều công ty dược phẩm trong nước như Domesco, Stella, Pharmedic, Dược Hậu Giang. Trong quá trình tổng hợp, sản xuất, bảo quản, allopurinol vẫn còn tồn tại hoặc phát sinh các tạp chất liên quan có khả năng gây độc tính hoặc đột biến gen, ảnh hưởng không nhỏ đến hiệu quả điều trị lâm sàng và đặc tính an toàn của thuốc đối với bệnh nhân.
Các nghiên cứu đã cho thấy tạp A và tạp D của allopurinol là sản phẩm trung gian trong quá trình tổng hợp. Tạp A và tạp B cũng là sản phẩm phân hủy của allopurinol khi gặp tác nhân kiềm hóa [14]. Tạp C, D, E, F là các sản phẩm phụ được tạo thành từ sản phẩm trung gian với các chất tham gia phản ứng độc hại với môi trường thủy sinh, có thể gây tác động bất lợi dài hạn trong môi trường nước, do đó có khả năng ảnh hưởng đến phụ nữ có thai [7]. Các tạp A, B, C, D, E đã được chứng minh có khả năng gây độc tính trên da và gây hội chứng Steven Johnson do tác dụng lên gen HLA-B*5801 [12].
Trong khi đó tạp Ethyl- (E/Z)-3-(2-carbethoxy-2-cyanoethyl)amino pyrazol-4-carboxylat (tạp F theo USP 2 standard 2022) nằm trong nhóm 3, là nhóm có cấu trúc có khả năng gây đột biến gen và ung thư. Trong nhiều chuyên luận của hầu hết dược điển như USP 44; BP2021; DĐVN V kiểm tra tạp chất liên quan allopurinol là một tiêu chuẩn bắt buộc trong kiểm nghiệm nguyên liệu allopurinol. BP 2021 còn bắt buộc yêu cầu kiểm tra tạp chất A, B, C, D, E trong thành phẩm allopurinol. Trong khi đó quy trình dược điển Việt Nam V và dược điển trên thế giới định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng đầu dò UV-VIS hoặc dãy iod quang bị hạn chế bởi độ đặc hiệu, các pic phải tách rời nhau.
Quy trình USP 44 cho thấy thời gian lưu tạp B và C allopurinol lần lược 6,9 phút và 7,1 phút dẫn đến hệ số phân giải thấp có thể gây ảnh hưởng đến kết quả phân tích. Ngoài ra các quy trình Dược Điển Việt Nam V và BP 2021 chỉ định lượng từng tạp hoặc một nhóm các tạp, làm tăng chi phí, thời gian, nguyên liệu để định lượng hết các tạp theo quy định, cũng như chưa có quy trình định lượng đồng thời 6 tạp trên trong thành phẩm allopurinol. Hiện các phương pháp phân tích hiện đại như sắc ký lỏng ghép đầu dò khối phổ ngày càng phổ biến và hiệu quả đã được cập nhật trong hướng dẫn Q2(R2) của ICH năm 2022 đặc biệt trong lĩnh vực phân tích tạp chất liên quan với hàm lượng thấp. Xuất phát từ những lý do trên, đề tài “Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời 6 tạp A,B,C,D,E,F của allopurinol bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao” được lựa chọn để thực hiện.
Với mục tiêu sau: 1. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời 6 tạp A, B, C, D, E, tạp F của allopurinol bằng hệ thống sắc kí lỏng ghép đầu dò khối phổ hai lần tứ cực (LC-MS/MS). Ứng dụng quy trình định lượng tạp chất liên quan trong một số nguyên liệu và thành phẩm allopurinol trên thị trường. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.
Tổng quan về allopurinol Tên quốc tế: allopurinol, allopurinolum. Tên hóa học: 1,5-dihydro-4H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-on. Công thức phân tử: C5H4N4O. Khối lượng mol: 136,11 g/mol [1].
Công thức cấu tạo allopurinol: Hình 1. Công thức cấu tạo allopurinol Allopurinol được tổng hợp lần đầu bởi Roland. K và Robins năm 1955, từ phản ứng malononitril với triethyl orthoformat. Tính chất vật lý Bột trắng hay gần như trắng.
Nhiệt độ nóng chảy: 350oC [20]. Độ tan: rất khó tan trong nước và trong ethanol 96%, tan trong các dung dịch hydroxyd kiềm loãng, dễ tan trong DMSO (4 mg/mL), kém tan trong n-octanol, cloroform [1], [7], [16]. Tính chất hoá học Allopurinol có pKa = 10,2; có thể bị phân hủy một phần trong môi trường acid và kém bền trong môi trường kiềm tạo 3-aminopyrazol-4-carboxamid. Ở môi 4 trường kiềm sản phẩm tiếp tục bị phân hủy thành acid 3-aminopyrazol-4- carboxylic và 3-aminopyrazol [6].
Tính chất dược lý Cơ chế tác dụng Allopurinol có cấu trúc tương tự hypoxanthin, tác dụng ức chế enzym xanthin oxydase, là enzym có vai trò chuyển hóa các tiền chất hypoxanthin thành acid uric. Vì thế, allopurinol làm giảm nồng độ acid uric trong máu. Acid uric huyết tăng cũng có thể gây bệnh thận và sỏi thận. Do vậy, allopurinol được dùng để ngăn ngừa sỏi thận do acid uric và ngăn ngừa cơn viêm khớp gout cấp [1].
Thuốc ức chế xanthin oxydase, bắt đầu làm giảm sản xuất acid uric trong 2-3 ngày, acid uric máu trở lại bình thường trong vòng 1 - 3tuần [1]. Chỉ định: Dự phòng gout và tăng acid uric máu [1]. Chống chỉ định: Gout cấp; nếu có đợt cấp xảy ra trong khi đang dùng allopurinol, vẫn tiếp tục dự phòng và điều trị đợt cấp riêng lẻ [1]. Liều lượng và cách dùng: Cách dùng: Thuốc uống trong bữa ăn với sữa hoặc một thuốc kháng acid để làm giảm bớt kích ứng dạ dày nhưng phải uống cách xa nhau để không ảnh hưởng đến hấp thu của allopurinol.
Người lớn uống ít nhất 2 lít nước mỗi ngày. Tránh uống nhiều rượu (có thể làm tăng acid uric máu) hoặc vitamin C (có thể làm tăng khả năng bị sỏi thận do acid hóa nước tiểu) [1]. Liều dùng: Dự phòng gout: uống, người lớn, 100 mg uống 1 lần mỗi ngày, sau đó điều chỉnh liều tùy theo nồng độ acid uric máu hay nước tiểu; liều duy trì thông thường đối với bệnh nhẹ, 100 - 200 mg hàng ngày; bệnh vừa 300 - 600 mg hàng ngày; bệnh nặng 700 - 900 mg hàng ngày; liều trên 300 mg phải chia làm nhiều liều [1]. Tổng quan về tạp chất liên quan của allopurinol 1.
Tạp chất A Tên hóa học: 5-amino-1H-pyrazol-4-carboxamid; 3-aminopyrazol-4-carboxamid. Công thức phân tử: C4H8N4O5S [1]. Khối lượng mol: 175,15 g/mol. Công thức cấu tạo tạp A: Hình 1.
Công thức cấu tạo tạp A 1. Tính chất vật lý Tinh thể màu vàng nhạt hoặc trắng ngà, không mùi. Nhiệt độ nóng chảy: 225 – 227 oC. Độ tan: Tan trong nước và DMSO.
Nguồn gốc phát sinh Tạp A là sản phẩm trung gian trong quá trình tổng hợp allopurinol theo qui trình Roland. Gressel và Josheph F. Gallelli nghiên cứu về độ ổn định của allopurinol cho thấy tạp A cũng là sản phẩm phân hủy của allopurinol khi gặp tác nhân kiềm hóa. 6 Allpurinol Tạp A Hình 1.
Sơ đồ quá trình phân hủy allopurinol thành tạp A. Tạp chất B Tên hóa học: 5-(formylamino)-1H-pyrazol-4-carboxamid.[1] Công thức phân tử: C5H6N4O2. Khối lượng mol: 154,13 g/mol [13]. Công thức cấu tạo tạp B: Hình 1.
Công thức cấu tạo tạp B 1. Tính chất vật lý Chất rắn, màu trắng hoặc trắng ngà, không mùi. Nguồn gốc phát sinh Tạp B được hình thành trong quá trình phân hủy allopurinol dưới tác động môi trường kiềm tạo 3-aminopyrazol-4-carboxamid, sản phẩm tạo thành tiếp tục tác dụng với format hình thành tạp B. 7 Allopurinol Tạp A Tạp B Hình 1.
Sơ đồ hình thành tạp B 1. Tạp chất C Tên hóa học: 5-(4H-1,2,4-triazol-4-yl)-1H-pyrazol-4-carboxamid [1]. Công thức phân tử: C6H6N6O. Khối lượng mol: 178,15 g/mol.
Công thức cấu tạo tạp C: Hình 1. Công thức cấu tạo tạp C 1. Tính chất vật lý Chất rắn, kết tinh, màu trắng hoặc trắng ngà, không mùi. Nguồn gốc phát sinh Tạp C được tạo thành do khả năng tạo vòng 1,2,4 triazol của các tác nhân tham gia phản ứng hydrazin, formamid tồn dư với sản phẩm trung gian 3-amino-4 pyrazolcarboxamid (tạp A) [18].
8 Tạp A Tạp C Hình 1. Sơ đồ hình thành tạp C 1. Tạp chất D Tên hóa học: ethyl 5-amino-1H-pyrazol-4-carboxylat [1]. Công thức phân tử: C6H9N3O2.
Khối lượng mol: 155,15 g/mol. Công thức cấu tạo tạp D: Hình 1. Công thức cấu tạo tạp D 1. Tính chất vật lý Chất rắn, kết tinh, màu trắng, trắng ngà hoặc vàng nhạt, không mùi.
Nhiệt độ nóng chảy: 101 – 104 oC. Nguồn gốc phát sinh Tạp D là sản phẩm trung gian trong quá trình tổng hợp allopurinol theo qui trình của Jean Druey và cộng sự (1959) [23]. Sơ đồ hình thành tạp D 1. Tạp chất E Tên hóa học: ethyl 5-(formylamino)-1H-pyrazol-4-carboxylat [1].
Công thức phân tử: C7H9N3O3. Khối lượng mol: 183,16 g/mol. Công thức cấu tạo tạp E: Hình 1. Công thức cấu tạo tạp E 1.
Tính chất vật lý Chất rắn, màu trắng, không mùi [44]. Nhiệt độ nóng chảy: 196 – 200 oC. Nguồn gốc phát sinh Tạp E được hình hành từ sản phẩm trung gian là tạp D trong quá trình tổng hợp allopurinol theo qui trình của Jean Druey. Tạp D sau khi hình thành sẽ phản ứng tiếp với triethyl orthoformat dư để tạo thành tạp E [23].
10 Tạp D Tạp E Hình 1. Sơ đồ hình thành tạp E 1. Tạp chất Ethyl-(E/Z)-3-(2-carbethoxy-2-cyanoethyl)amino pyrazol-4- carboxylat Tên hóa học: ethyl-(E/Z)-3-(2-carbethoxy-2-cyanoethenyl)amino-1H-pyrazol- 4-carboxylat. Công thức phân tử: C12H14N4O4.
Khối lượng mol: 278,1 g/mol. Công thức cấu tạo: Hình 1. Công thức cấu tạo tạp F 1. Tính chất vật lý Chất rắn, màu trắng.
Nguồn gốc phát sinh Tạp F được hình hành từ sản phẩm trung gian là tạp D trong quá trình tổng hợp allopurinol theo qui trình của Jean Druey. Tạp D sau khi hình thành sẽ phản ứng tiếp với lượng dư của triethyl orthoformat và ethyl cyanoaceton tạo thành tạp F. 11 Tạp D Ethyl 2-cyanoacetyl Tryethylothorformat Tạp F Hình 1. Sơ đồ hình thành tạp F 1.
Tính chất dược lý và độc tính các tạp allopurinol Makoto Osabe và cộng sự (2016) bằng mô hình docking đã chứng minh khả năng gắn kết của 6 tạp chất liên quan của allopurinol có ký hiệu lần lượt là A, B, C, D, E, F với gen HLA-B*5801 gây ra hội chứng Steven-Johnson và hoại tử tế bào biểu bì tương tự như tác dụng phụ của allopurinol [2],[28] … Kết quả nghiên cứu cho thấy các tạp liên quan allopurinol (ngoại trừ tạp A) có khả năng gắn kết cao hơn hẳn hoạt chất chính, trong đó đặc biệt đáng lưu ý là tạp F với hai dạng đồng phân quang học (Z) và (E) có khả năng gắn kết vượt trội.