ĐẶT VẤN ĐỀ Tỏi đã được sử dụng phổ biến trên thế giới từ hơn 4000 năm trước, dùng làm gia vị thực phẩm - kích thích tiêu hóa, như một vị thuốc chữa bệnh, giảm cholesterol máu, phòng ngừa trụy tim mạch, ức chế sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh. Tuy nhiên, nhược điểm cố hữu của tỏi là mùi khó chịu do các hợp chất sulfur gây ra. Để khắc phục nhược điểm này, người ta lên men tự nhiên tỏi tươi để tạo ra tỏi đen. Quy trình lên men tự nhiên cũng làm cho hàm lượng carbohydrat tăng từ 28,7% (trong tỏi) lên tới 47,9% (trong tỏi đen), nhờ đó tỏi đen có vị ngọt của trái cây vì trong thành phần có chứa đường, acid amin và sau quá trình lên men tự nhiên sẽ chuyển thành màu đen, vị ngọt, không còn mùi cay, hăng của tỏi thông thường.
Ngoài ra sau quá trình lên men, hàm lượng một số acid amin trong tỏi đen tăng đáng kể góp phần vào hoạt tính lý hoá của tỏi đen [11]. Acid amin là thành phần quan trọng thực hiện các chức năng đa dạng của cơ thể sống, là tiền thân của nhiều sinh chất quan trọng trong cơ thể sống. Acid amin tạo nên tế bào, phục hồi mô, tạo nên các kháng thể chống lại vi khuẩn và virut, là một phần của enzym và hệ thống hormon. Nó tạo nên ARN, AND vận chuyển oxi đi khắp cơ thể và tham gia vào hoạt động của các cơ.
Sự thiếu hụt acid amin dẫn đến cơ thể mệt mỏi, hạ đường huyết, dị ứng [25]. Để phân tích acid amin, thường có 2 phương pháp chính: (1) tạo dẫn xuất trước hoặc sau cột với thuốc thử phát huỳnh quang và phân tích bằng kỹ thuật CE, LC hoặc GC với đầu dò FLD; (2) định lượng trực tiếp sử dụng đầu dò khối phổ (LC-MS, GC-MS). Phương pháp thứ 2 có độ nhạy, độ chính xác cao và thời gian phân tích rất ngắn (dưới 5 phút) tuy nhiên, đòi hỏi phòng thí nghiệm phải trang bị thiết bị đắt tiền, và có kỹ thuật viên được đào tạo chuyên sâu. Do đó không phù 2 hợp với điều kiện phòng thí nghiệm tại Việt Nam phục vụ công tác kiểm soát chất lượng tỏi đen thường quy [20], [22], [47].
Ngoài ra với phương pháp tạo dẫn xuất trước hoặc sau cột là phương pháp sắc ký lỏng đã được đưa vào Dược Điển các nước với ưu điểm, sử dụng thiết bị phổ biến (HPLC đầu dò UV-Vis, PDA, FLD) có thể áp dụng rộng rãi cho các trung tâm kiểm nghiệm ở Việt Nam [22], [3], [58]. Bên cạnh các thuốc thử tạo dẫn xuất truyền thống như OPA, ninhydrin, PICT, AQC, NBD-F. Gần đây nhiều công trình đã công bố việc ứng dụng thuốc thử tạo dẫn xuất FMOC để phân tích các acid amin trong các nền mẫu như nấm, sữa ong chúa và một vài dược liệu (trinh nữ hoàng cung, chùm ngây…) [9], [10], [1], [4]. Nguyên nhân do thuốc thử FMOC phổ biến, rẻ tiền, phản ứng nhạy và đặc hiệu cho cả amin bậc 1 lẫn bậc 2.
Sản phẩm dẫn xuất có thể phát hiện bằng cả 2 loại đầu dò UV-Vis và huỳnh quang. Chính vì lý do này, nghiên cứu ứng dụng phương pháp tạo dẫn xuất FMOC với các acid amin có trong tỏi đen sau khi thủy phân. Đến nay chưa có nghiên cứu ứng dụng phương pháp tạo dẫn xuất với FMOC trên nền mẫu tỏi đen, nên chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng một số acid amin trong tỏi đen bằng phương pháp sắc ký lỏng” để góp phần phục vụ công tác kiểm nghiệm và cung cấp thêm các lựa chọn cho các nhà phân tích với ba mục tiêu cụ thể như sau: 1. Xây dựng quy trình tạo dẫn xuất 16 acid amin trong tỏi đen bằng thuốc thử FMOC-Cl 2.
Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng 16 acid amin có trong tỏi đen bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, đầu dò FLD. Ứng dụng quy trình đã thẩm định xác định hàm lượng 16 acid amin trong chế phẩm tỏi đen lưu hành trên thị trường. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về tỏi tươi 1.
Đặc điểm thực vật và phân bố: Theo hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan, Allium sativum thuộc họ Hành – Liliaceae có vị trí như sau [56]: Giới thực vật (Plantae) Thực vật bậc cao (Cormobionta) Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp Hành (Liliopsida) Phân lớp Hành (Liliiidae) Bộ Hành (Liliales) Họ Hành (Liliaceae) Chi Allium Loài Allium sativum Hình 1. Sơ đồ vị trí của Allium sativum theo hệ thống của Takhtajan 4 Hình 1. Tỏi tươi (Allium sativum) Tỏi (Allium sativum) là một loài thực vật thuộc họ Hành, nghĩa là có họ hàng với hành tây, hành ta, hành tím, tỏi tây,… có nguồn gốc ở Trung Á. Tỏi là cây thảo, thân hành, hình trụ, đầu nhọn, gân song song, hai mặt nhẵn.
Cụm hoa mọc ở ngọn, bao bọc bởi những lá mo, có mũi nhọn rất dài, hoa màu trắng hay hồng có cuốn hình sợi dài, bao gồm 6 phiến hình mũi mác, xếp thành hai hàng, thuôn, nhị 6 chỉ nhị có cựa dài, dính vào các mảng bao hoa, bầu gần hình cầu, quả nang [12]. Bộ phận dùng là củ. Tại Việt Nam có những vùng đất trồng tỏi nổi tiếng như Lý Sơn, Phan Rang… 1. Thành phần hoá học: Tỏi tươi chứa khoảng 62,8% nước, 6,3% protein, 0,1% chất béo, 29% cacbonhydrat, Ca 0,00003%, P 0,000031%, Fe 0,0013%, vitamin C 0,013%.
Thành phần chủ yếu trong tỏi là allicin (C6H10OS2) một hợp chất chứa lưu huỳnh có tính kháng khuẩn, đặc biệt là đối với chủng Staphllococcus, thương hàn, phó thương hàn, tả, trực khuẩn bạch hầu, vi khuẩn thối. Allicin được tạo thành từ alliin nhờ enzym alliinase theo phản ứng sau [6]. Sơ đồ chuyển hoá alliin thành allicin Allicin rất dễ kết hợp với cystein, một acid amin chứa gốc SH tạo thành C6H11O2S2. Gốc SH có vai trò quan trọng trong sự sinh sản của vi khuẩn.
Nhờ đó allicin ức chế sự sinh sản của vi khuẩn. Ngoài ra trong tỏi còn có một số hợp chất saponin steroid có hoạt tính chống nấm và một số pectin như arabinose, mannose, glucose [12]. Tổng quan về tỏi đen 1. Tỏi đen Mặc dù có rất nhiều tác dụng, tỏi tươi có mùi hôi rất khó chịu do có chứa allicin và các thành phần gây mùi khác.
Vì vậy, các nhà khoa học Nhật Bản, Hàn Quốc đã nghiên cứu lên men tỏi tươi tạo ra tỏi đen để khắc phục nhược điểm này. Tỏi đen là sản phẩm lên men từ tỏi tươi ở nhiệt độ 70-80oC và độ ẩm thích hợp trong 1-3 tháng. Quá trình này làm cho tép tỏi có màu sẫm, tạo cho chúng có vị ngọt và thay đổi độ đặc của chúng thành dai và giống như thạch [15] [35]. Xử lý Gói Lên men Làm Sản Tỏi làm giấy bằng khô tỏi phẩm khô sạch bạc nhiệt đen tỏi đen Hình 1.
Quá trình lên men tỏi đen 6 Hình 1. Sự thay đổi màu sắc của tỏi đen trong suốt quá trình lên men [19] Trong quá trình lên men sẽ xảy ra phản ứng chuyển hoá các hợp chất chứa lưu huỳnh như methionin, cystein thành những hợp chất mới chứa lưu huỳnh tan được trong nước như S-allyl-cystein, alliin, isoalliin, cycloalliin, các dẫn chất của cystein, dẫn chất tetrahydro-β-carbolin [5]. Quy trình lên men tự nhiên cũng làm cho hàm lượng carbohydrat tăng từ 28,7% (trong tỏi) lên tới 47,9% (trong tỏi đen), nhờ đó tỏi đen có vị ngọt của trái cây vì trong thành phần có chứa đường, acid amin và sau quá trình lên men tự nhiên sẽ chuyển thành màu đen, vị ngọt, không còn mùi cay, hăng của tỏi thông thường. Ngoài ra sau quá trình lên men, hàm lượng 1 số acid amin trong tỏi đen tăng đáng kể góp phần vào hoạt tính lý hoá của tỏi đen.
Trong quá trình này, màu đen của tỏi được hình thành không phải do phản ứng tạo màu của enzym và phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ của quá trình lên men. Lúc này melanoidin được hình thành do phản ứng Maillard, là phản ứng xảy ra giữa đường và acid amin. Melanoidin là một polymer có khối lượng phân tử lớn màu nâu. Như vậy sự chuyển màu của tỏi từ trắng sang đen là do phản ứng Maillard [11].
Tác dụng dược lý - Hoạt tính chống oxy hoá: Tỏi đen ức chế tạo ra ROS do H2O2 gây ra trong các tế bào RAW264.7 và peroxid hoá lipid do tert-butyl hydroperoxid trong tế bào gan chuột, và hoạt tính chống oxy hoá ở động vật khác. Tổn thương oxy hóa do 7 tia cực tím B gây ra ở da chuột bị giảm khi điều trị tỏi đen. Tỏi đen làm giảm tổn thương gan do oxy hóa mãn tính do rượu gây ra và các triệu chứng nôn nao ở chuột. Sự peroxy hóa lipid được điều hòa bởi ABG ở chuột có chế độ ăn nhiều chất béo (HFD) và hạn chế chuột bị căng thẳng.
- Hoạt tính chống viêm: Tỏi đen làm giảm sản xuất NO và các cytokin gây viêm trong các tế bào RAW264.7 do LPS gây ra và ở chuột bị nhiễm trùng huyết. Chiết xuất hexan của ABG làm giảm sự tăng sinh tế bào và biểu hiện của ICAM- 1 và VCAM-1 trong các tế bào mô đệm nội mạc tử cung con người do kích hoạt TNF-a. - Ngoài các tác dụng chống oxy hóa và chống viêm nêu trên đối với tế bào và động vật, tỏi đen còn có tác dụng chống ung thư, chống tiểu đường và béo phì, chống dị ứng, bảo vệ gan, bảo vệ tim mạch, bảo vệ thần kinh và chống huyết khối [47]. Các acid amin trong tỏi đen Tính chất của acid amin Acid amin là những hợp chất hữu cơ đa chức mà trong cấu trúc chứa 2 nhóm chức khác nhau: nhóm chức amin (-NH2) và nhóm chức acid (COOH) có tính bazo nên trạng thái kết tinh acid amin tồn tại ở dạng lưỡng tính [2] [47].
Trừ glycin, các acid amin đều có ít nhất một nguyên tử carbon bất đối xứng. Các acid amin thu được từ protein bằng phương pháp thủy phân acid hoặc base đều có tính quang hoạt. Các acid amin thiên nhiên là những α-aminoacid và có cấu hình giống nhau thuộc dãy L (chỉ ở dạng này thì các acid amin có giá trị dinh dưỡng cho con người và động vật) [2] [47]. Cấu trúc của 16 acid amin [17] Khung acid Chữ amin cơ bản viết tắt R His Histidin -CH2 –(CH2)3NH C(NH2) = Arg Arginin NH2 Ser Serin –CH2OH Asp Aspartic acid –CH2COOH Glutamic –CH2CH2COOH Glu acid Thre Threonin –CH (OH) CH3 Gly Glycin –H Ala Alanin –CH3 Met Methionin –CH2CH2SCH3 Val Valin –CH (CH3)2 Phe Phenylalanin –CH2C6H5 Iso Isoleucin –CH (CH3) CH2 CH3 Leu Leucin –CH2 CH (CH3)2 Lys Lysin –(CH2)4NH2 Tyr Tyrosin –CH2C6H4OH Pro Prolin C5H9NO2 Phản ứng của gốc R: phản ứng oxy hóa khử do nhóm SH của cystein, phản ứng tạo muối do các nhóm COOH hay NH2 của glutamat hay lysin, phản ứng tạo ester do nhóm OH của tyrosin.