Nghiên cứu phát triển hệ vector SFV nhằm biểu hiện gen neurokinin 1 phục vụ nghiên cứu dược lý

Nghiên cứu phát triển hệ vector SFV Semliki Forest virus nhằm nhân dòng và biểu hiện gen neurokinin 1 phục vụ nghiên cứu dược lý tại Việt Nam.

• Tác giả: Phạm Thị Hồng Nhung
• Người hướng dẫn: PGS. Đinh Đoàn Long
• Trường học: Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Nghiên cứu phát triển hệ vector SFV (Semliki Forest Virut) nhằm nhân dòng và biểu hiện gen mã hóa thụ thể Neurokinin-1 phục vụ các nghiên cứu dược lý và phát triển thuốc ở Việt Nam
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2012
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG BIỂU HIỆN THỤ THỂ KẾT CẶP G-PROTEIN (GPCR)
• 1.1.1. Thụ thể kết cặp G-protein và vai trò trong nghiên cứu dược phẩm
• 1.1.2. Các hệ thống vector
• 1.1.3. Các hệ thống biểu hiện thụ thể kết cặp G-protein
• 1.2. HỆ THỐNG VECTOR SFV (SEMLIKI FOREST VIRUT)
• 1.2.1. Virut Semliki Forest (SFV)
• 1.2.2. Hệ vector SFV (Semliki Forest virut) cơ bản
• 1.2.3. Tiềm năng ứng dụng khác của hệ vector SFV
• 1.2.4. Các yếu tố cần được cải tiến trong hệ vector SFV
• 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
• 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.2.1. Chuẩn bị tế bào khả biến và biến nạp
• 2.2.2. Phương pháp tách chiết plasmit
• 2.2.3. Duy trì, bảo quản mẫu sinh phẩm trong quá trình phân lập và nhân dòng
• 2.2.4. Thiết kế mồi
• 2.2.5. Khuếch đại gen nhờ phản ứng PCR (polymerase chain reaction)
• 2.2.6. Cắt ADN sử dụng enzym giới hạn và chống tự nối/đóng vòng
• 2.2.7. Tạo các đoạn ADN sợi đôi và các linker từ các đoạn oligonucleotit
• 2.2.8. Phản ứng nối các đoạn ADN
• 2.2.9. Sàng lọc khuẩn lạc
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Chuẩn bị tế bào khả biến và biến nạp
• 3.2. Cải tiến vector pSFV
• 3.3. Tạo ADN tái tổ hợp chứa gen NK1 trong hệ vector SFV cơ bản
• 3.4. Tạo ADN tái tổ hợp chứa gen NK1 trong hệ vector SFV cải tiến
• 3.5. Sàng lọc chủng vi khuẩn mang gen mã hóa NK1
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu hệ vector SFV và gen neurokinin 1

Nghiên cứu phát triển hệ vector SFV (Semliki Forest Virus) nhằm biểu hiện gen neurokinin 1 (NK1) là một bước tiến quan trọng trong lĩnh vực dược lý tại Việt Nam. Hệ vector SFV được biết đến với khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp hiệu quả, đặc biệt là các thụ thể kết cặp G-protein (GPCR). Gen NK1 có vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh lý và bệnh lý, do đó việc nghiên cứu và phát triển hệ thống biểu hiện gen này sẽ mở ra nhiều cơ hội trong việc phát triển thuốc mới và nghiên cứu dược lý.

1.1. Hệ vector SFV và ứng dụng trong nghiên cứu dược lý

Hệ vector SFV là một trong những công nghệ tiên tiến trong biểu hiện gen, cho phép sản xuất protein tái tổ hợp với hiệu suất cao. Hệ thống này đã được áp dụng thành công trong nhiều nghiên cứu dược lý, giúp xác định cấu trúc và chức năng của các thụ thể như NK1. Việc sử dụng hệ vector SFV không chỉ giúp tăng cường hiệu quả biểu hiện mà còn giảm thiểu thời gian và chi phí trong nghiên cứu.

1.2. Vai trò của gen neurokinin 1 trong nghiên cứu dược lý

Gen neurokinin 1 (NK1) mã hóa cho thụ thể NK1, có vai trò quan trọng trong việc điều hòa nhiều quá trình sinh lý như cảm giác đau, viêm và phản ứng miễn dịch. Nghiên cứu về gen này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế bệnh lý mà còn mở ra hướng đi mới trong phát triển thuốc điều trị các bệnh liên quan đến thụ thể NK1.

II. Thách thức trong việc phát triển hệ vector SFV tại Việt Nam

Mặc dù hệ vector SFV có nhiều ưu điểm, nhưng việc phát triển và ứng dụng nó tại Việt Nam vẫn gặp phải một số thách thức. Đầu tiên, việc thiếu nguồn lực và công nghệ hiện đại có thể ảnh hưởng đến khả năng nghiên cứu và phát triển. Thứ hai, sự cạnh tranh từ các công nghệ khác cũng là một yếu tố cần xem xét. Cuối cùng, việc đào tạo nhân lực có chuyên môn cao trong lĩnh vực này là rất cần thiết để đảm bảo sự phát triển bền vững.

2.1. Thiếu nguồn lực và công nghệ hiện đại

Việc phát triển hệ vector SFV đòi hỏi nguồn lực tài chính và công nghệ hiện đại. Tại Việt Nam, nhiều phòng thí nghiệm vẫn chưa được trang bị đầy đủ thiết bị cần thiết để thực hiện các nghiên cứu phức tạp. Điều này có thể dẫn đến việc chậm tiến độ trong nghiên cứu và phát triển.

2.2. Cạnh tranh từ các công nghệ khác

Trong lĩnh vực nghiên cứu dược lý, có nhiều công nghệ khác cũng đang được phát triển và ứng dụng. Sự cạnh tranh này có thể làm giảm tính hấp dẫn của hệ vector SFV nếu không có những cải tiến và ứng dụng thực tiễn rõ ràng.

III. Phương pháp phát triển hệ vector SFV cho gen neurokinin 1

Để phát triển hệ vector SFV cho gen NK1, cần thực hiện một số bước quan trọng. Đầu tiên, việc thiết kế và tối ưu hóa vector là rất cần thiết để đảm bảo hiệu suất biểu hiện cao. Tiếp theo, các phương pháp tách chiết và nhân dòng gen cũng cần được thực hiện một cách chính xác để thu được sản phẩm mong muốn. Cuối cùng, việc sàng lọc và xác định các chủng vi khuẩn mang gen NK1 là bước quan trọng để đảm bảo tính khả thi của hệ thống.

3.1. Thiết kế và tối ưu hóa vector SFV

Thiết kế vector SFV cho gen NK1 bao gồm việc lựa chọn các trình tự điều khiển phiên mã và dịch mã phù hợp. Việc tối ưu hóa các yếu tố này sẽ giúp tăng cường hiệu suất biểu hiện protein tái tổ hợp, từ đó nâng cao khả năng nghiên cứu và phát triển thuốc.

3.2. Phương pháp tách chiết và nhân dòng gen

Các phương pháp tách chiết và nhân dòng gen NK1 cần được thực hiện một cách chính xác để đảm bảo thu được sản phẩm chất lượng cao. Việc sử dụng các enzym giới hạn và kỹ thuật PCR sẽ giúp tăng cường hiệu quả trong quá trình này.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn của hệ vector SFV

Kết quả nghiên cứu cho thấy hệ vector SFV có khả năng biểu hiện gen NK1 với hiệu suất cao. Các thí nghiệm đã chứng minh rằng protein tái tổ hợp có thể được sản xuất và thu nhận một cách hiệu quả. Điều này mở ra nhiều cơ hội cho việc ứng dụng trong nghiên cứu dược lý và phát triển thuốc tại Việt Nam.

4.1. Hiệu suất biểu hiện gen NK1 trong hệ vector SFV

Các thí nghiệm cho thấy hệ vector SFV có thể biểu hiện gen NK1 với hiệu suất cao, cho phép thu nhận protein tái tổ hợp trong thời gian ngắn. Điều này chứng tỏ tính khả thi của hệ thống trong nghiên cứu và phát triển dược phẩm.

4.2. Ứng dụng trong nghiên cứu dược lý

Protein tái tổ hợp từ gen NK1 có thể được sử dụng trong các nghiên cứu dược lý để xác định hoạt tính và chức năng của thụ thể. Điều này sẽ giúp phát triển các liệu pháp điều trị mới cho các bệnh lý liên quan đến thụ thể NK1.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu phát triển hệ vector SFV để biểu hiện gen NK1 đã mở ra nhiều cơ hội trong lĩnh vực dược lý tại Việt Nam. Với những kết quả đạt được, hệ thống này có thể được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu và phát triển thuốc. Tương lai, việc cải tiến và tối ưu hóa hệ vector sẽ tiếp tục được thực hiện để nâng cao hiệu quả và khả năng ứng dụng.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu trong phát triển dược phẩm

Nghiên cứu về hệ vector SFV và gen NK1 không chỉ có ý nghĩa trong việc phát triển thuốc mà còn góp phần nâng cao chất lượng cuộc sống cho người dân. Việc phát triển các liệu pháp điều trị mới sẽ giúp cải thiện sức khỏe cộng đồng.

5.2. Hướng đi tương lai cho nghiên cứu hệ vector SFV

Tương lai, nghiên cứu sẽ tiếp tục tập trung vào việc cải tiến hệ vector SFV, mở rộng ứng dụng cho các gen khác và phát triển các liệu pháp điều trị mới. Điều này sẽ tạo ra nhiều cơ hội cho các nhà nghiên cứu và ngành dược phẩm tại Việt Nam.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Thụ thể kết cặp G-protein (GPCR) là họ protein màng lớn nhất ở người với khoảng 1.000 thụ thể khác nhau, đóng vai trò then chốt trong quá trình dẫn truyền tín hiệu nội bào. Trong lĩnh vực y dược, các GPCR là đích tác động sinh học của hơn 50% tổng số loại thuốc điều trị đang lưu hành trên toàn cầu, mang lại doanh thu thương mại vượt mức 30 tỷ USD mỗi năm. Tuy nhiên, việc nghiên cứu cấu trúc và sàng lọc hoạt chất mới gặp thách thức nghiêm trọng do hàm lượng GPCR tự nhiên trong tế bào chỉ đạt mức rất thấp, thường dao động khoảng vài fmol/mg protein màng. Đồng thời, sự đa dạng của các biến thể alen tự nhiên khiến kết quả thử nghiệm tiền lâm sàng dễ sai lệch.

Nhằm khắc phục rào cản trên, đề tài tập trung giải quyết vấn đề thiết lập hệ thống nhân dòng và biểu hiện nhân tạo thụ thể GPCR tái tổ hợp ở mức độ cao. Mục tiêu cụ thể của luận văn là phát triển, cải biến hệ vector Semliki Forest Virus (SFV) dạng plasmid ADN và thực hiện nhân dòng thành công cADN mã hóa thụ thể Neurokinin-1 (NK1) của người Việt Nam. Nghiên cứu được triển khai thực nghiệm trong giai đoạn năm 2011–2012 tại Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein cùng Phòng thí nghiệm Di truyền học thuộc Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của công trình thể hiện ở việc làm chủ công nghệ vector virus thế hệ mới, mở ra tiềm năng sản xuất protein màng đạt năng suất 1 đến 10 mg/lít dịch nuôi cấy, cung cấp công cụ sàng lọc dược phẩm chủ động với chi phí giảm tới 60% so với việc nhập khẩu sinh phẩm thương mại.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu vận dụng lý thuyết biểu hiện protein tái tổ hợp trên tế bào động vật có vú và cơ chế sao chép phân tử của Alphavirus thuộc họ Togaviridae. Virus Semliki Forest sở hữu hệ gen ARN sợi đơn dương kích thước 11.442 nucleotide, có khả năng khuếch đại mARN nội bào cực mạnh nhờ phức hệ enzyme ARN replicase (mã hóa bởi 4 protein phi cấu trúc nsP1–nsP4 dài 7.381 nucleotide).

Hệ thống biểu hiện SFV vận hành theo mô hình hai vector độc lập gồm vector tái tổ hợp pSFV (11.489 cặp base) và vector trợ giúp pHelper (8.650 cặp base). Cơ chế "vector tự sát" đảm bảo an toàn sinh học cấp độ 2 khi các hạt virus thế hệ con không thể tiếp tục nhân bản do thiếu hụt gen cấu trúc. Để khắc phục giới hạn dịch mã, lý thuyết tăng cường biểu hiện gen chỉ ra rằng 102 nucleotide đầu tiên của gen mã hóa vỏ capsid SFV có khả năng gia tăng hiệu suất dịch mã của protein xuôi dòng lên gấp 10 đến 100 lần. Ba khái niệm trung tâm được tích hợp vào mô hình vector cải tiến bao gồm: vùng nhân dòng đa điểm (Multiple Cloning Site - MCS) đa dạng hóa vị trí cắt giới hạn, đuôi ái lực kép FLAG-tag và His10-tag phục vụ tinh sạch ái lực một bước, cùng trình tự nhận biết của protease Thrombin giúp thu hồi protein tái tổ hợp nguyên bản.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn vật liệu nghiên cứu bao gồm chủng vi khuẩn Escherichia coli DH5α, hệ vector pSFV/pHelper cơ bản và plasmid pJET1.2 mang gen mã hóa thụ thể NK1 người. Cỡ mẫu khảo sát biến nạp được thực hiện trên 3 lô tế bào khả biến độc lập, theo dõi mật độ quang OD600 qua 4 mốc thời gian (60, 95, 115 và 125 phút). Quá trình sàng lọc khuẩn lạc tái tổ hợp được tiến hành trên tập hợp 139 khuẩn lạc ngẫu nhiên (gồm 74 khuẩn lạc chọn lọc cho dòng vector pSFV-M7 và 65 khuẩn lạc cho dòng pSFV-M8).

Phương pháp chọn mẫu ngẫu nhiên kết hợp kỹ thuật colony PCR được lựa chọn vì tính ưu việt trong việc sàng lọc nhanh hàng trăm dòng vi khuẩn biến nạp mà không cần tách chiết plasmid sơ bộ. Quy trình phân tích phân tử kết hợp chặt chẽ:

• Biến nạp sốc nhiệt tế bào khả biến bằng muối hóa trị hai CaCl2 nhằm tối ưu hóa sự hấp phụ ADN.
• Kỹ thuật PCR chuẩn khuếch đại đoạn gen vỏ capsid 896 bp sử dụng cặp mồi F-N/R-N.
• Cắt phân tử ADN bằng enzyme giới hạn nồng độ cao (BglII, EcoRI, AccI, XmaI, SmaI, XhoI) và xử lý dephosphoryl hóa đầu 5' bằng enzyme FastAP để ức chế 100% khả năng tự đóng vòng của vector.
• Phản ứng tạo sợi đôi từ các đoạn oligonucleotide bằng đoạn Klenow của ADN Polymerase I.
• Phản ứng nối T4 DNA Ligase ở 16°C và xác định cấu trúc giải trình tự Sanger tự động. Toàn bộ tiến trình thực nghiệm được chuẩn hóa đồng bộ trong 12 tháng.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Thứ nhất, nghiên cứu đã chuẩn hóa thành công quy trình tạo tế bào khả biến E. coli DH5α bằng phương pháp CaCl2 0,1M đạt hiệu suất biến nạp tối ưu lên tới 585.000 khuẩn lạc/µg plasmid ADN siêu xoắn (5,85x10^5 CFU/µg) khi dịch nuôi cấy đạt chỉ số OD600 = 0,356 ở thời điểm 115 phút. Hiệu suất này cao gấp hơn 140 lần so với mẫu thu ở giai đoạn 60 phút (chỉ đạt 4.175 CFU/µg).

Thứ hai, tác giả đã khuếch đại và phân lập thành công đoạn gen mã hóa vỏ capsid SFV dài 896 bp (chứa 267 axit amin) từ khuôn mẫu pHelper. Kết quả giải trình tự khẳng định độ chính xác của vùng tăng cường dịch mã 102 nucleotide đầu tiên, phát hiện một đột biến đồng nghĩa T132C (chuyển đổi bộ ba CCT thành CCC) nhưng vẫn bảo tồn chính xác axit amin Proline, không làm thay đổi đặc tính chức năng sinh học.

Thứ ba, hệ thống đã tạo thành công hai vector cải tiến thế hệ mới mang tên pSFV-M7 và pSFV-M8 mang đoạn chèn kích thước 634 bp tích hợp đồng thời vùng tăng cường dịch mã, FLAG-tag, chuỗi 10 gốc Histidine (His10-tag), vị trí cắt Thrombin và vùng nhân dòng đa điểm mở rộng. Phản ứng colony PCR kiểm tra trên 74 khuẩn lạc pSFV-M7 và 65 khuẩn lạc pSFV-M8 đều xác nhận sự xuất hiện chính xác của băng điện di đặc hiệu 634 bp.

Thứ tư, nghiên cứu đã hoàn thành việc chèn đoạn cADN mã hóa thụ thể NK1 (kích thước xấp xỉ 1,2 kb) vào cả hai hệ thống vector pSFV cơ bản và pSFV cải tiến, tạo ra các dòng vi khuẩn mang plasmid tái tổ hợp ổn định sẵn sàng cho các thử nghiệm biểu hiện protein màng.

Thảo luận kết quả

Hiệu suất biến nạp vượt trội tại điểm OD600 từ 0,3 đến 0,4 được lý giải do quần thể vi khuẩn E. coli đang ở pha sinh trưởng theo hàm mũ (exponential phase), màng tế bào có độ linh động cao nhất để tạo phức hệ vận chuyển ADN với ion Ca2+. Dữ liệu sinh trưởng thực tế và hiệu suất chuyển gen có thể được minh họa trực quan thông qua biểu đồ tương quan giữa giá trị OD600 và số lượng khuẩn lạc thu nhận, giúp các phòng thí nghiệm dễ dàng chuẩn hóa quy trình nhân bản.

Việc thiết kế đoạn chèn trung gian số 2 (kích thước 676 bp thu từ phản ứng cắt phối hợp BglII, EcoRI và AccI) là một sáng tạo kỹ thuật quan trọng nhằm vượt qua trở ngại pSFV gốc chứa tới 4 vị trí nhận biết của enzyme EcoRI. Kết quả điện di trên gel agarose 1% tách biệt rõ nét 4 phân đoạn ADN (1.355 bp, 5.993 bp, 676 bp và 313 bp) chứng minh phản ứng cắt đã đạt hiệu suất 100%. So với hệ thống biểu hiện Baculovirus trên tế bào côn trùng vốn đòi hỏi quy trình tạo virus kéo dài tới 21 ngày và có cấu trúc N-glycosyl hóa chứa quá nhiều mannose, hệ vector SFV cải tiến rút ngắn thời gian tạo hạt virus tái tổ hợp xuống chỉ còn 1 đến 2 ngày, đồng thời đảm bảo đầy đủ các biến đổi sau dịch mã đặc trưng của động vật có vú.

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm hoàn thiện và ứng dụng hiệu quả hệ vector SFV cải biến vào thực tiễn nghiên cứu y dược, các giải pháp trọng tâm cần được triển khai bao gồm:

• Thiết lập quy trình biểu hiện in vivo thụ thể NK1 tái tổ hợp trên các dòng tế bào động vật có vú chuyên biệt (BHK-21, CHO và HEK293): Đặt mục tiêu đạt năng suất biểu hiện từ 5 đến 10 mg thụ thể/lít môi trường trong vòng 6 đến 12 tháng, do nhóm nghiên cứu sinh học phân tử tại Phòng thí nghiệm trọng điểm thực hiện.
• Chuẩn hóa quy trình tinh sạch một bước sử dụng sắc ký ái lực cột Ni-NTA hoặc hạt từ gắn kháng thể Anti-FLAG: Phấn đấu thu hồi chế phẩm thụ thể màng NK1 đạt độ tinh sạch trên 95% và bảo tồn hoạt tính liên kết phối tử trong thời gian 3 đến 6 tháng, do các chuyên viên hóa sinh phối hợp thực hiện.
• Xây dựng hệ thống thử nghiệm sàng lọc thuốc thông lượng cao (High-Throughput Screening - HTS): Đánh giá hoạt tính đối kháng thụ thể NK1 của hơn 100 hợp chất thiên nhiên chiết xuất từ nguồn dược liệu bản địa Việt Nam trong lộ trình 12 đến 24 tháng, do Viện Dược liệu phối hợp cùng Đại học Quốc gia Hà Nội đảm nhiệm.
• Mở rộng ứng dụng nền tảng vector pSFV-M7 và pSFV-M8 để nhân dòng từ 5 đến 10 thụ thể GPCR đích quan trọng khác (như thụ thể Serotonin, Dopamine và thụ thể Chemokine): Hỗ trợ các chương trình phát triển thuốc điều trị ung thư và bệnh lý thần kinh giai đoạn 2025–2030, do các viện nghiên cứu y sinh thực hiện.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

• Nhà nghiên cứu sinh học phân tử và công nghệ sinh học: Tiếp cận quy trình chi tiết về kỹ thuật cải tạo vector virus, thiết kế đoạn nối linker, tối ưu hóa vùng tăng cường dịch mã và giải pháp khắc phục các vị trí cắt giới hạn trùng lặp.
• Chuyên gia dược lý học và phát triển dược phẩm: Ứng dụng nền tảng sản xuất nguồn protein thụ thể GPCR tái tổ hợp số lượng lớn nhằm thiết lập các mô hình thử nghiệm gắn kết phối tử (ligand binding assay) để tìm kiếm hoạt chất giảm đau, chống viêm mới.
• Giảng viên, nghiên cứu sinh và học viên cao học chuyên ngành Di truyền học, Hóa sinh học: Sử dụng tài liệu như một cẩm nang thực hành chuẩn mực về các kỹ thuật thao tác ADN tái tổ hợp, tối ưu chu trình PCR, colony PCR và phương pháp chuẩn bị tế bào siêu khả biến.
• Các doanh nghiệp công nghệ sinh học y dược: Tham khảo mô hình chuyển giao kỹ thuật sản xuất protein khó biểu hiện, hỗ trợ định hướng đầu tư hệ thống sản xuất kháng nguyên và kit thử nghiệm dược chất tiên tiến.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao thụ thể GPCR rất khó biểu hiện ở mức độ cao trong các hệ thống tế bào chủ thông thường? GPCR sở hữu cấu trúc không gian phức tạp với 7 đoạn xoắn xuyên màng kỵ nước, đòi hỏi các điều kiện cuộn gập, định vị màng chính xác và biến đổi sau dịch mã như glycosyl hóa. Khi biểu hiện cưỡng bức ở mức độ cao, chúng dễ gây độc cho tế bào chủ hoặc tạo thể vùi không hoạt tính.

Cải tiến đột phá của hai vector pSFV-M7 và pSFV-M8 so với vector pSFV cơ bản là gì? Vector pSFV cơ bản chỉ chứa 3 vị trí cắt giới hạn hạn chế. Hai vector cải tiến pSFV-M7 và pSFV-M8 được bổ sung 102 nucleotide tăng cường dịch mã từ vỏ capsid SFV, tích hợp đuôi ái lực FLAG-tag/His10-tag, vị trí cắt protease Thrombin và mở rộng vùng nhân dòng đa điểm với các enzyme cắt mới.

Hệ thống vector Semliki Forest Virus (SFV) có an toàn đối với người thực hiện không? Hệ thống đạt mức độ an toàn sinh học cấp độ 2 nhờ thiết kế "tự sát" phân tách độc lập giữa vector replicon (pSFV) và vector bổ trợ gen cấu trúc (pHelper). Hạt virus tái tổ hợp sinh ra chỉ có khả năng lây nhiễm một chu kỳ đơn lẻ mà không thể tiếp tục nhân lên trong tế bào vật chủ.

Ý nghĩa của việc tích hợp đồng thời hai đuôi ái lực FLAG-tag và His10-tag là gì? Cấu trúc tag kép cho phép phân tích protein linh hoạt bằng nhiều kỹ thuật như Western blot, ELISA (sử dụng kháng thể Anti-FLAG hoặc Anti-His) và hỗ trợ tinh sạch ái lực hai bước liên tiếp qua cột ái lực ion kim loại Ni2+ và cột kháng thể M1, nâng độ tinh sạch lên trên 98%.

Nghiên cứu biểu hiện thụ thể Neurokinin-1 (NK1) mang lại giá trị gì cho ngành y dược Việt Nam? Thụ thể NK1 liên kết với phối tử Chất P (Substance P), tham gia trực tiếp vào cơ chế dẫn truyền cảm giác đau, viêm nhiễm và phản xạ nôn mửa do hóa trị ung thư. Việc chủ động tạo nguồn thụ thể NK1 tái tổ hợp giúp các nhà khoa học trong nước tự chủ sàng lọc hoạt chất đối kháng từ nguồn dược liệu tự nhiên.

Kết luận

• Hoàn thiện xuất sắc quy trình chuẩn bị tế bào khả biến E. coli DH5α đạt hiệu suất 5,85x10^5 CFU/µg tại ngưỡng quang phổ OD600 = 0,356.
• Khuếch đại và phân lập chính xác đoạn gen vỏ capsid SFV 896 bp mang trình tự tăng cường dịch mã tự nhiên.
• Xây dựng thành công hai hệ vector cải biến thế hệ mới pSFV-M7 và pSFV-M8 tích hợp đầy đủ hệ thống đa nhân dòng và tag kép tinh sạch.
• Nhân dòng thành công đoạn cADN mã hóa thụ thể NK1 người vào hệ vector SFV chuẩn và SFV cải biến.
• Khẳng định tính khả thi của nền tảng công nghệ sinh học phân tử hiện đại trong việc tự chủ sản xuất các protein màng GPCR phức tạp tại Việt Nam.

Kế hoạch tiếp theo trong giai đoạn 12–24 tháng tới là chuyển giao hệ vector vào nuôi cấy tế bào động vật và triển khai sàng lọc hoạt chất kháng thụ thể NK1. Độc giả và các đơn vị nghiên cứu quan tâm có thể kết nối với nhóm tác giả tại Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội để cùng hợp tác thử nghiệm và phát triển các ứng dụng sinh dược học chuyên sâu.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG BIỂU HIỆN THỤ THỂ KẾT CẶP G-PROTEIN (GPCR) 1.1 Thụ thể kết cặp G-protein và vai trò trong nghiên cứu dược phẩm Thụ thể là một lớp lớn các protein có chức năng tiếp nhận các tín hiệu ngoại bào, truyền hóa và thúc đẩy quá trình truyền tin nội bào dẫn đến đáp ứng tế bào giúp cơ thể đáp ứng kịp thời với sự thay đổi của môi trường. Để thực hiện được chức năng đó, thụ thể có đặc tính liên kết đặc hiệu với một hoặc một số phân tử tín hiệu đặc thù được gọi là phối tử (ligand) và phức hệ “ligand – thụ thể” sẽ khởi đầu một quá trình truyền tin nội bào và gây nên đáp ứng tế bào [3]. Có 4 họ thụ thể chính (Hình 1), trong đó thụ thể kết cặp G-protein (viết tắt là GPCR) là họ protein lớn và đa dạng nhất ở người [33].

Thụ thể kết cặp G- protein là nhóm thụ thể xuyên màng sinh chất và hoạt động nhờ sự kết cặp với một loại protein hoạt động bởi liên kết với GTP (tức là G-protein). GPCR dẫn truyền tín hiệu cho nhiều dạng phối tử, bao gồm các hóc môn, peptit thần kinh, các chemokine…Trong cơ thể, các GPCR được biểu hiện trên hầu hết các kiểu tế bào và ước tính có đến 1000 GPCR khác nhau ở người [52]. Bốn họ thụ thể chính (nguồn: Gunnar Schulte, 2008 [18]) Sự thay đổi về mật độ cũng như trạng thái hoạt hóa của các GPCR là nguyên nhân trực tiếp gây nên nhiều bệnh cấp tính và mãn tính như tiểu đường, các bệnh tim, trầm cảm, viêm nhiễm và ung thư [31]. Các GPCR là đích tác động chính của hơn 50% các loại dược phẩm đang được sử dụng trong điều trị.

3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học Riêng năm 2001, nhóm thuốc này đem đến doanh thu trên 30 tỷ USD và ước tính con số hiện nay còn cao hơn [25]. Mặc dù GPCR có ý nghĩa thực tiễn to lớn song có hai trở ngại lớn khi sử dụng các GPCR tự nhiên (native) trong các nghiên cứu dược lý học phân tử và sàng lọc thuốc. Thứ nhất là các GPCR tự nhiên thường chỉ được biểu hiện ở mức độ rất thấp (khoảng vài fmol/mg protein màng tế bào) nên thường không sẵn có để dùng cho các thí nghiệm sàng lọc. Thứ hai là trong các mô hình thử nghiệm ở các động vật thí nghiệm, các GPCR thường đồng thời tồn tại ở nhiều dạng phụ (subtype) khác nhau hoặc các dạng biến thể (variants/polymorphic alleles) khác nhau, dẫn đến có thể có những nhận định nhầm về khả năng tương tác của các “thuốc thử” (test compound) với các thụ thể đích nếu đối tượng thí nghiệm lấy mẫu ngẫu nhiên không đại diện cho nhóm phổ biến nhất (các alen kiểu dại).

Có thể nhận thấy những khó khăn trên có thể được khắc phục bằng việc ứng dụng các kỹ thuật di truyền nhằm biểu hiện các GPCR tái tổ hợp của người. Các GPCR tái tổ hợp được biểu hiện ở mức độ cao sẽ cung cấp nguồn nguyên liệu cho các thí nghiệm xác định hoạt tính liên kết với phối tử cũng như chức năng liên kết của các G-protein. Chính bởi vậy, xây dựng các hệ thống biểu hiện GPCR nhanh và hiệu quả là một hướng nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng và mang lại nhiều lợi ích thiết thực trong sàng lọc và nghiên cứu phát triển dược phẩm.2 Các hệ thống vector Ý tưởng về vector mang gen ngoại lai bắt nguồn từ các plasmit vi khuẩn. Vector là phân tử ADN có khả năng tự tái bản, tồn tại độc lập trong tế bào chủ và mang các gen cần chuyển.

Sau khi vector ngoại lai được đưa vào tế bào chủ, chúng sử dụng bộ máy sao chép của tế bào chủ để nhân bản đến số lượng cần thiết và biểu hiện các gen chúng mang [1]. Đến nay, đã có hơn 2600 vector được chia làm 3 nhóm chính là plasmit (nguồn gốc từ vi khuẩn), phagơ (nguồn gốc từ virut) và nhiễm sắc thể nhân tạo [46]. Chuyển gen vào các tế bào động vật có thể tiến hành bằng cách gây nhiễm các phagơ mang gen tái tổ hợp quan tâm hoặc chuyển gen trực tiếp thông qua plasmit. Có rất nhiều vector biểu hiện trên động vật có vú có nguồn gốc từ virut 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học được dùng trong sản xuất protein, liệu pháp gen và phát triển vacxin mới (Phụ lục-1).

Hiệu quả biểu hiện gen đặc biệt là trong các tế bào động vật có vú không đơn thuần thể hiện ở tốc độ sản xuất protein mà còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố như các nhân tố kiểm soát phiên mã và dịch mã, quá trình biên tập và sự ổn định của ARN, số lượng bản sao của gen ngoại lai, khả năng gây độc của các protein tái tổ hợp với tế bào cũng như các đặc tính di truyền của tế bào chủ. Giá trị của vector ở chỗ nó được thiết kế sao cho thuận tiện với mục đích sử dụng. Không có hệ vector nào toàn năng cho chuyển gen và biểu hiện mà cần có sự chọn lựa tùy theo mục đích và kích thước của đoạn gen được tạo dòng [66]. Các vector liên tục được cải tiến thuận lợi cho việc chuyển gen, sản xuất và thu hồi protein ngoại lại một cách hiệu quả.

Dưới đây tóm lược một số xu hướng cải tiến vector phổ biến và ý nghĩa của chúng.1 Tạo các vector ADN từ hệ gen virut có bản chất ARN Nhiều virut có hệ gen ARN có tiềm năng phát triển thành các vector biểu hiện mạnh. Các phiên bản vector ADN của virut ARN được thiết lập là một bước cải tiến lớn đem lại các hệ thống biểu hiện mạnh hơn (đặc biệt ở tế bào động vật có vú), dễ dàng thao tác với các enzym và thuận lợi cho quá trình chèn các đoạn ADN ngoại lai đồng thời hạn chế được các bước xử lý trong điều kiện chuyên biệt dành cho ARN và dịch mã ARN có mũ đầu 5’ trong ống nghiệm [6]. Nhiều nghiên cứu xây dựng vector ADN dựa trên hệ vector ARN gốc đã được tiến hành, chẳng hạn như các hệ vector ADN có nguồn gốc từ ARN hệ gen của virut Sindbis [54].2 Thêm hoặc cải tiến các vùng điều khiển Những hiểu biết ngày càng sâu sắc về các trình tự mã cho các tín hiệu điều khiển quá trình phiên mã, biên tập mARN và dịch mã có thể thêm vào vector giúp chúng ta chủ động điểu khiển hiệu suất biểu hiện theo ý muốn. Trình tự Kozak GCC(A/G) CCATGG ở động vật có xương sống hoặc trình tự tương đương CAAAACATG ở côn trùng bất cứ khi nào xuất hiện đều làm tăng hiệu suất dịch mã ARN [1].

Ngoài ra, đoạn trình tự này còn khuyến 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học khích loại bỏ các vùng có thể ức chế dịch mã nằm ngược dòng ATG hay vùng cấu trúc thứ cấp ở đầu 5’ không mã hóa [15]. Lựa chọn các trình tự tăng cường hay các promoter mạnh có hiệu suất phiên mã cao để thêm hoặc thay thế cho promoter gốc của vector sẽ giúp tắng cường mức độ biểu hiện protein. Bảng 1 trình bày một số promoter có thể thêm vào vector biểu hiện trên động vật có vú. Một số promoter được bổ sung vào các vector biểu hiện (nguồn: Gerstein, 2001 [15]) Promoter Hệ vector gốc Độ mạnh* EF-1α Nhân tố kéo dài 1α ở người 40-160 CMV Cytomegalovirut 4 RSV Virut LTR rous sarcoma 2 SV40 muộn Gen muộn của virut simian 40 1.1 SV40 sớm Gen sớm của virut simian 40 1 * Promoter SV40 sớm được coi là có độ mạnh là 1để so sánh với các promoter khác.

Nhiều tín hiệu kết thúc phiên mã của sinh vật nhân sơ đã được nghiên cứu và được sử dụng rộng rãi trong các vector biểu hiện. Ở sinh vật nhân chuẩn, trình tự ATCAAA(A/T)TAGGAAGA đã được xác định là vùng kết thúc phiên mã của chín gen được nghiên cứu [36]. Đuôi polyadenin – polyA (50-250 phân tử adenyl nối tiếp nhau) thêm sau mARN có vai trò quan trọng giúp ổn định và dịch chuyển ARN từ nhân ra tế bào chất để dịch mã. Mặc dù trình tự polyA cách xa điểm khởi đầu dịch mã nhưng nó có tác dụng tăng cường sự tái hoạt động của ribosom nên trực tiếp làm tăng cường hiệu suất dịch mã [1].

Có một số tín hiệu polyadenin hóa hiệu quả đã được sử dụng trong vector biểu hiện của động vật có vú có nguồn gốc từ gen mã cho hoóc môn tăng trưởng của bò, β- globin chuột, đơn vị phiên mã sớm của SV40 và gen mã cho thymidine kinase của Herpes simplex. 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học 1.3 Mở rộng và đa dạng hóa các vùng nhân dòng đa điểm Các phiên bản vector đầu tiên dựa trên trình tự nguyên gốc của plasmit hoặc phage có vùng nhân dòng đa điểm (multiple cloning site-MCS) rất hạn chế. Các vị trí nhân dòng đa điểm là nơi mà các enzym giới hạn nhận biết để cắt rời làm chỗ lắp ráp đoạn gen ngoại lai vào. Các trình tự này thường nằm xa điểm khởi đầu tái bản để tránh bị cắt nhầm.

Để thuận lợi cho quá trình nhân dòng gen ngoại lai, các vector gốc thường được bổ sung thêm các đoạn nối (linker) mang vị trí nhân dòng đa điểm mới. Các vị trí nhân dòng đa điểm mới phải đảm bảo không có trong trình tự gốc của vector, ưu tiên cho các enzym giới hạn tạo được đầu tương thích với nhiều enzym giới hạn khác [2].4 Thêm các vùng gen giúp sàng lọc thể tái tổ hợp Các gen kháng kháng sinh giúp chọn lọc các dòng tế bào chứa vector tái tổ hợp thường được thêm vào hầu hết các vector. Các gen kháng kháng sinh hay được sử dụng là gen mã họ kháng sinh penicillin (bao gồm ampicillin) tác động ức chế hình thành thành tế bào vi khuẩn hoặc kanamycin, tetracyclin và chloramphenicol ức chế sự sinh trưởng vi khuẩn thông qua ức chế sinh tổng hợp protein vi khuẩn. Các gen báo cáo (reporter genes) giúp xác định plasmit có chứa đoạn chèn gen ngoại lai mong muốn cũng có thể được cài vào vector.

Gen lacZ là một gen báo cáo điển hình, mã hóa cho β-galactosidase có khả năng cắt galactose. Vị trí nhân dòng đa điểm nằm trong gen LacZ và nếu đoạn chèn được cài thành công vào vector sẽ làm bất hoạt β-galactosidase. Chính vì vậy, tế bào chứa vetor có đoạn chèn quan tâm có thể được xác định bằng phương pháp chọn khuẩn lạc xanh/trắng trên môi trường chứa X-gal [2].