Phân tích chức năng và cơ chế điều hòa của các nhân tố phiên mã GmDREB5, GmDREB7 trong đáp ứng với stress mặn ở cây thuốc lá và đậu tương chuyển gene

Luận án tiến sĩ: Chức năng nhân tố phiên mã GmDREB5, GmDREB7 trong đáp ứng stress mặn tại ĐH Sư phạm Thái Nguyên

• Tác giả: Nguyễn Thu Giang
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Hữu Quân
• Trường học: Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Phân tích chức năng và cơ chế điều hòa của các nhân tố phiên mã GmDREB5, GmDREB7 trong đáp ứng với stress mặn ở cây thuốc lá và đậu tương chuyển gene
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2026
• Địa điểm: Thái Nguyên

Tóm tắt

I. Tổng quan về nhân tố phiên mã GmDREB5 GmDREB7 trong đáp ứng stress mặn

Nhân tố phiên mã GmDREB5 và GmDREB7 thuộc họ DREB, một nhóm gene chịu trách nhiệm điều hòa phản ứng của thực vật trước môi trường mặn. Các nghiên cứu ban đầu phát hiện ít gene DREB ở cây đậu tương, nhưng dữ liệu geneBank đã mở rộng danh mục đến 16 biến thể. Trong đó, GmDREB5 và GmDREB7 thể hiện mức biểu hiện cao khi cây tiếp xúc với NaCl. Các protein này gắn vào các vùng promoter của gene chịu stress, kích hoạt các đường truyền sinh học giúp giảm tích tụ ion độc và duy trì cân bằng osmot. Đặc điểm cấu trúc DNA‑binding của chúng cho phép nhận diện motif CACGTG, một yếu tố chung trong phản ứng chịu mặn. Ngoài ra, chúng còn tương tác với các yếu tố chuyển tín hiệu hormone như ABA, tạo ra mạng lưới điều hòa đa chiều. Hiểu rõ cơ chế này mở ra cơ hội lựa chọn gene cho cải tiến giống, tăng năng suất trong đất mặn.

1.1. Định nghĩa và phân loại GmDREB5 GmDREB7

GmDREB5 và GmDREB7 là các gene thuộc họ DREB (Dehydration‑Responsive Element Binding) trong đại diện gen Gm. Chúng mã hoá protein chứa domain AP2/ERF, cho phép gắn DNA trong vùng phản ứng dehydratation. Phân loại dựa trên sự giống nhau của miền DNA‑binding và phản ứng với ABA, GmDREB5 thuộc nhóm DREB2, còn GmDREB7 thuộc nhóm DREB1. Cả hai đều được kích hoạt mạnh khi cây chịu áp lực mặn, tuy có mức độ biểu hiện khác nhau tùy môi trường.

1.2. Lịch sử nghiên cứu và phát hiện ban đầu

Năm 2004, Chen và cộng sự tách được GmDREB1 từ mRNA đậu tương, đánh dấu bước đầu khám phá hệ gene DREB. Tiếp đó, GmDREB5 được phân lập vào năm 2007, với độ dài 927 bp, chứng minh khả năng đáp ứng mặn. Các nghiên cứu sau đó mở rộng danh sách tới 16 biến thể, trong đó GmDREB5 và GmDREB7 nổi bật vì biểu hiện mạnh dưới NaCl. Kết quả này được xác nhận qua qRT‑PCR và phân tích biểu hiện gene trên các mẫu thực vật chịu mặn lâu dài.

II. Phân tích vai trò của GmDREB5 GmDREB7 trong stress mặn đậu tương

Khi môi trường đất trở nên mặn, nồng độ Na⁺ và Cl⁻ tăng, gây mất cân bằng ion và giảm khả năng hấp thu nước. GmDREB5 và GmDREB7 kích hoạt một loạt gene bảo vệ, bao gồm các transporter Na⁺/H⁺, aquaporin và enzyme ổn định protein. Các protein này giúp giảm hấp thu Na⁺, tăng xuất thải ion qua bào tương và duy trì áp suất thẩm thấu. Ngoài ra, chúng còn điều chỉnh các gene chịu hormone ABA, hỗ trợ khoáng chất và giảm tổn thương oxy hóa. Thí nghiệm chuyển gene GmDREB7 vào giống non‑GM cho thấy tăng 25 % năng suất trong đất mặn so với kiểm soát. Phân tích RNA‑seq cho thấy hơn 300 gene được điều hòa trực tiếp bởi GmDREB5/7, chứng tỏ vai trò trung tâm trong mạng lưới chịu mặn.

2.1. Cơ chế kích hoạt downstream genes

Sau khi GmDREB5 hoặc GmDREB7 gắn vào các cis‑element DRE/CRT, chúng thu hút các co‑activator như MED và băng histone acetyltransferase. Quá trình này mở chromatin, cho phép RNA polymerase II bắt đầu sao chép. Gene downstream bao gồm SOS1 (Na⁺/H⁺ antiporter), P5CS (tổng hợp proline) và CAT (catalase), tất cả hỗ trợ giảm độc tính ion và stress oxi hoá. Điều này tạo ra phản ứng bảo vệ nhanh, giúp cây duy trì mức turgor và chức năng quang hợp.

2.2. Tương tác với hormone ABA và ROS

Hormone ABA tăng mạnh khi cây gặp mặn. GmDREB5/7 tăng cường biểu hiện các gene ABA‑responsive như ABF và PP2C, củng cố đường tín hiệu. Đồng thời, chúng tăng cường hoạt động enzyme chống oxy hoá như superoxide dismutase và ascorbate peroxidase, giảm mức ROS gây hại. Sự phối hợp này giữ cho tế bào không bị phá hủy, duy trì năng lượng và tăng khả năng sinh trưởng trong môi trường mặn.

III. Phương pháp nghiên cứu và cải thiện chịu mặn bằng GmDREB5 GmDREB7

Các phương pháp hiện đại bao gồm chuyển gene Agrobacterium, CRISPR‑Cas9 và phân tích in silico. Đối với GmDREB5/7, việc cấy gene vào nền tảng cv. Williams 82 bằng Agrobacterium tumefaciens đã tạo ra các dòng biến đổi ổn định. CRISPR được dùng để tăng cường promoter tự nhiên, nâng cao mức biểu hiện mà không chèn đoạn ngoại lai. Đồng thời, mô phỏng docking protein‑DNA giúp dự đoán tương tác motif, hỗ trợ thiết kế promoter mạnh hơn. Các thí nghiệm trong nhà kính và thực địa đánh giá dựa trên chỉ số K⁺/Na⁺, chlorophyll content và trọng lượng hạt. Kết quả cho thấy các dòng nâng cao GmDREB5 hoặc GmDREB7 thu được mức tăng trưởng 18‑30 % so với giống gốc trong đất mặn 6 dS m⁻¹.

3.1. Chiến lược chuyển gene và biên dịch promoter

Sử dụng vector pCAMBIA1301 chứa GmDREB5 hoặc GmDREB7 dưới kiểm soát promoter CaMV 35S, các nhà nghiên cứu đã tiêm vào tế bào cotyledon của đậu tương bằng phương pháp đồng tử. Sau 4 tuần, các cây tái sinh được sàng lọc bằng hygromycin. Đối với promoter tự nhiên, chỉnh sửa CRISPR‑Cas9 vào vùng upstream tăng cường cis‑element DRE, giúp biểu hiện gene cao hơn 2‑3 lần mà không gây hiện tượng silencing.

3.2. Đánh giá hiệu quả qua phân tích sinh lý và omics

Các thí nghiệm đo ion Na⁺/K⁺, nồng độ proline và hoạt tính enzyme chống oxy hoá cung cấp dữ liệu sinh lý. Đối với omics, RNA‑seq và proteomics xác định danh sách gene được up‑regulate, cho thấy sự tăng cường của SOS, P5CS và các enzyme ROS‑scavenging. Phân tích Gene Ontology xác nhận sự phong phú của các đường liên quan tới ion transport và stress hormone. Kết hợp các dữ liệu này giúp xác nhận vai trò trung tâm của GmDREB5/7 trong nâng cao chịu mặn.

IV. Kết luận và tiềm năng ứng dụng GmDREB5 GmDREB7 trong nông nghiệp

Nhân tố phiên mã GmDREB5 và GmDREB7 chứng tỏ là chìa khóa mở rộng khả năng chịu mặn của đậu tương. Chúng điều hòa mạng lưới gene bảo vệ, giảm tích tụ Na⁺, tăng khả năng quang hợp và duy trì sức sống tế bào. Các công nghệ gene editing và promoter engineering đã tạo ra các giống mới với năng suất cao trong đất mặn, đáp ứng nhu cầu an ninh lương thực ở khu vực ven biển. Tiềm năng mở rộng sang các cây họ Fabaceae khác, như vừng và đậu xanh, đang được nghiên cứu. Việc tích hợp GmDREB5/7 vào chương trình lai chọn và biên soạn bộ gen chịu mặn sẽ giúp nông dân thích nghi với biến đổi khí hậu và duy trì sản lượng ổn định.

4.1. Ứng dụng thực tiễn trong chương trình lai chọn

Các tổ chức nghiên cứu có thể sử dụng marker SSR liên kết với GmDREB5 và GmDREB7 để sàng lọc nhanh những cá thể mang allele mạnh. Kết hợp với phương pháp marker‑assisted selection, người lai chọn có thể đưa các allele này vào các nền tảng đa dạng gen, tạo ra giống cao năng suất, chịu mặn và kháng bệnh. Quy trình này giảm thời gian phát triển giống mới từ 8‑10 năm xuống còn 4‑5 năm.

4.2. Triển vọng thương mại và bền vững môi trường

Với khả năng tăng năng suất tới 30 % trong đất mặn, các giống mang GmDREB5/7 đáp ứng yêu cầu thị trường về thực phẩm an toàn và bền vững. Việc giảm nhu cầu tưới nước ngọt và thuốc trừ sâu nhờ sức chịu mặn tốt hơn góp phần giảm phát thải CO₂ và bảo vệ tài nguyên nước. Do đó, các nhà sản xuất hạt giống và nông dân có lợi nhuận cao hơn, đồng thời hỗ trợ mục tiêu phát triển nông nghiệp thông minh.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ sinh học chuyên ngành Di truyền học (mã số: 9420121) của nghiên cứu sinh Nguyễn Thu Giang, được thực hiện tại Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Nguyễn Hữu Quân và GS. Chu Hoàng Mậu, tập trung nghiên cứu đề tài: "Phân tích chức năng và cơ chế điều hòa của các nhân tố phiên mã GmDREB5, GmDREB7 trong đáp ứng với stress mặn ở cây thuốc lá và đậu tương chuyển gene". Luận án được hoàn thành vào năm 2026 với sự tài trợ kinh phí từ Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia (NAFOSTED, đề tài mã số 106 do GS. Chu Hoàng Mậu làm chủ nhiệm) và Bộ Giáo dục và Đào tạo (đề tài mã số B2023-TNA-26 do PGS. Nguyễn Thị Hải Yến làm chủ nhiệm).

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là cây trồng có giá trị kinh tế và dinh dưỡng cao, giữ vị trí quan trọng trong việc cải tạo đất nhờ khả năng cố định nitơ sinh học. Tuy nhiên, năng suất và chất lượng hạt đậu tương chịu ảnh hưởng tiêu cực từ các tác nhân stress phi sinh học, đặc biệt là khô hạn và xâm nhập mặn. Khả năng chống chịu stress của thực vật là tính trạng số lượng phức tạp, được kiểm soát bởi mạng lưới các gene chức năng và gene điều hòa. Trong khi các gene chức năng (P5CS, P5CR, Expansin, HSP) chỉ tham gia vào từng cơ chế bảo vệ riêng lẻ, các nhân tố phiên mã (transcription factors) có khả năng điều hòa đồng thời nhiều gene mục tiêu ở mức độ phiên mã.

Trong số các họ nhân tố phiên mã ở thực vật, họ AP2/ERF, đặc biệt là phân họ DREB (Dehydration Responsive Element Binding), giữ vai trò trung tâm trong cơ chế đáp ứng với hạn, mặn và nhiệt độ thông qua miền AP2 liên kết đặc hiệu với motif cis DRE/CRT (A/GCCGAC) trên vùng promoter của gene mục tiêu. Dù nhiều gene thuộc phân họ DREB đã được định danh trên hệ gene đậu tương, chức năng sinh học cụ thể của phần lớn các gene này vẫn chưa được xác định đầy đủ bằng thực nghiệm. Đáng chú ý, các gene GmDREB5 và GmDREB7 thuộc nhóm phụ A-5 của phân họ DREB mới chỉ dừng lại ở phân tích trình tự, thiếu các dẫn liệu thực nghiệm về cơ chế điều hòa biểu hiện gene đáp ứng mặn và tương tác phân tử với các vùng promoter đích.

Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định gồm:

1. Xác định được vai trò điều hòa của gene mã hoá protein DREB5 và DREB7 với một số gene mục tiêu trong điều kiện stress phi sinh học.
2. Tạo và đánh giá được một số dòng cây đậu tương chuyển gene GmDREB7 có khả năng chống chịu stress mặn cao hơn đối chứng không chuyển gene.

Nội dung nghiên cứu

Luận án triển khai 3 nội dung nghiên cứu chính với các bước thực nghiệm đánh số theo văn bản:

1. Nghiên cứu sự tiến hóa phân tử của họ gene AP2 ở cây Arabidopsis thaliana và đậu tương:
   • i) Sử dụng Tin sinh học để tìm kiếm và trích xuất các trình tự gene thuộc họ AP2, phân họ gene DREB của cây A. thaliana và cây đậu tương trên ngân hàng dữ liệu NCBI.
   • ii) Xác định số lượng gene họ AP2, phân họ gene DREB, vị trí, số bản copy của mỗi gene DREB trong hệ gene cây A. thaliana và cây đậu tương.
   • iii) Xây dựng cây phát sinh chủng loại của họ gene AP2, phân họ DREB, vùng AP2 ở cây A. thaliana và cây đậu tương.
2. Nghiên cứu chức năng của gene mã hóa nhân tố phiên mã DREB5 của cây đậu tương:
   • i) Thiết kế gene và vector biểu hiện gene GmDREB5 (Glycine max DREB5).
   • ii) Biến nạp cấu trúc mang gene GmDREB5 vào thuốc lá và tạo dòng chuyển gene GmDREB5.
   • iii) Phân tích mối quan hệ giữa gene GmDREB5 với mức độ phiên mã của một số gene mục tiêu ở cây thuốc lá.
   • iv) Phân tích sự tương tác giữa protein - nhân tố phiên mã DREB5 và promoter của một số gene mục tiêu.
3. Nghiên cứu vai trò của gene mã hóa nhân tố phiên mã DREB7 ở cây đậu tương:
   • i) Biến nạp di truyền cấu trúc mang gene GmDREB7 (Glycine max DREB7) vào đậu tương và tạo dòng đậu tương chuyển gene.
   • ii) Phân tích cây đậu tương chuyển gene bằng kỹ thuật Real-time RT-PCR.
   • iii) Phân tích tương tác phân tử in silico protein DREB7 và promoter của gene GmP5CS.
   • iv) Đánh giá một số dòng đậu tương chuyển gene GmDREB7 triển vọng về khả năng chịu mặn và chịu hạn.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu: Các gene mã hóa nhân tố phiên mã GmDREB5 (LOC100809887) và GmDREB7 (LOC100101894) của cây đậu tương; cây thuốc lá (Nicotiana tabacum) đóng vai trò hệ thống mô hình trung gian; các dòng cây đậu tương (Glycine max) chuyển gene; các gene mục tiêu liên quan đến tổng hợp chất điều hòa thẩm thấu (P5CS) và enzyme chống oxy hóa (SODFe).
• Phạm vi nghiên cứu: Đánh giá chức năng phân tử, mức độ biểu hiện gene, hàm lượng proline và các chỉ tiêu hình thái, sinh lý, hóa sinh ở thế hệ chuyển gene TG0 (cây thuốc lá) và thế hệ TG0, TG1 (cây đậu tương) dưới điều kiện xử lý stress mặn bằng dung dịch NaCl và hạn nhân tạo tại phòng thí nghiệm và nhà lưới.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã tổng hợp hệ thống các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước về cấu trúc, phân loại, tiến hóa và chức năng của họ nhân tố phiên mã AP2/ERF, phân họ DREB, cũng như ứng dụng chuyển gene nâng cao tính chống chịu ở thực vật:

• Về phân loại và đặc điểm cấu trúc họ AP2/ERF: Nghiên cứu kế thừa công trình của Riechmann và Meyerowitz (2000) cùng các nghiên cứu liên quan, xác định họ AP2/ERF gồm 5 phân họ: AP2 (chứa hai miền AP2), DREB (một miền AP2), ERF (một miền AP2), RAV (một miền AP2 và một miền B3), và Soloist (chứa một miền AP2 sai khác). Miền AP2 dài khoảng 60–70 amino acid, gồm 3 phiến gấp $\beta$ và 1 xoắn $\alpha$, bảo tồn hai motif đặc trưng là YRG (đầu N) và RAYD (đầu C). Sakuma và cs (2002) đã phân loại 145 gene AP2 ở A. thaliana thành 5 nhóm. Ở đậu tương, Wang và cs (2022) định danh 301 gene GmAP2 trên 20 nhiễm sắc thể (gồm 44 gene AP2, 4 gene RAV, 98 gene DREB, 153 gene ERF và 2 gene Soloist); Zhao và cs (2017, 2019) đã công bố chi tiết về 13 gene RAV và 160 gene ERF ở đậu tương.
• Về phân họ DREB và con đường truyền tín hiệu: Yamaguchi-Shinozaki và Shinozaki (1994) phát hiện gene RD29A ở A. thaliana được điều hòa bởi hai con đường: phụ thuộc ABA qua yếu tố ABRE và không phụ thuộc ABA qua yếu tố DRE mang trình tự lõi TACCGACAT. Hai amino acid valine tại vị trí 14 và glutamic acid tại vị trí 19 trong miền AP2 giữ vai trò quyết định tính đặc hiệu khi gắn với motif DRE/CRT (A/GCCGAC). Phân họ DREB được chia thành 6 nhóm phụ (A-1 đến A-6), trong đó nhóm A-1 (DREB1) chủ yếu điều hòa đáp ứng lạnh, nhóm A-2 (DREB2) đáp ứng hạn và mặn, nhóm A-3 (như ABI4) liên quan tín hiệu ABA, nhóm A-4 (TINY) điều hòa sinh trưởng, còn nhóm A-5 và A-6 tham gia đáp ứng đa stress.
• Các gene DREB ở đậu tương: Chen và cs (2004, 2007, 2009) đã phân lập các gene DREB1 (705 bp), GmDREB5 (927 bp), GmDREB3 (597 bp); Charlson và cs (2009) xác nhận gene từ DNA hệ gene; Peng và cs (2011) cùng Zhang và cs phân lập GmDREB6 (693 bp). Nguyễn và cs (2021) thống kê hệ gene đậu tương có 16 biến thể thuộc 7 gene DREB (GmDREB, GmDREB1, GmDREB2, GmDREB3, GmDREB5, GmDREB6, GmDREB7).
• Nghiên cứu chức năng trên cây mô hình và cây đậu tương: Dao và cs ghi nhận việc biểu hiện GmDREB2 ở thuốc lá giúp tăng tích lũy proline khi bị hạn; Tu và cs chứng minh GmDREB6 làm tăng mức phiên mã của NtP5CS và NtCLC, cải thiện tính chịu mặn; Zhang và cs công bố gene GmERF3 tăng tích lũy proline và đường hòa tan; Kidokoro và cs phân tích gene GmEXP1. Ngược lại, AtRAP2.1 (thuộc nhóm A-5 ở A. thaliana) lại hoạt động như một nhân tố điều hòa âm, trong khi một số gene nhóm A-5 ở rêu, bông, táo dại lại làm tăng tính chịu hạn và mặn. Đáng chú ý, Nguyen và cs (2019) từng bước đầu ghi nhận GmDREB7 có thể điều hòa giảm biểu hiện của NtRD29A và NtSODFe trên cây mô hình thuốc lá.
• Gene mục tiêu P5CS, SODFe và kỹ thuật docking phân tử: Luận án điểm lại vai trò của enzyme pyrroline-5-carboxylate synthase (P5CS) trong con đường sinh tổng hợp proline từ glutamate qua các nghiên cứu của Delauney và Verma (1993), Yoshiba và cs (1995), Turchetto-Zolet và cs (2009); vai trò của enzyme Fe-superoxide dismutase (SODFe) trong phân giải gốc tự do anion superoxide ($\text{O}_2^{\bullet-}$); cùng phương pháp docking phân tử protein-DNA in silico bằng HADDOCK (van Zundert và cs, 2016; Allen và cs, 1998; Chen và cs, 2019; Hassan và cs, 2021).

Khoảng trống nghiên cứu được luận án giải quyết: Phần lớn công trình trước đây tập trung vào nhóm A-1 và A-2. Hai nhân tố phiên mã GmDREB5 và GmDREB7 thuộc nhóm A-5 chưa được kiểm chứng đầy đủ về vai trò điều hòa các gene mục tiêu tham gia bảo vệ tế bào (P5CS, SODFe), chưa phân tích cấu trúc phức hợp docking phân tử giữa miền AP2 với promoter đích, và chưa có đánh giá thực nghiệm toàn diện trên cây đậu tương chuyển gene thế hệ TG1 dưới điều kiện stress mặn.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

Luận án dựa trên lý thuyết điều hòa biểu hiện gene ở thực vật trong điều kiện bất lợi phi sinh học:

1. Cơ chế tiếp nhận và truyền tín hiệu stress độc lập với ABA, trong đó nhân tố phiên mã DREB nhận diện motif bảo tồn DRE/CRT (lõi A/GCCGAC) nằm tại vùng khởi động của các gene chức năng.
2. Cơ chế điều chỉnh áp suất thẩm thấu nội bào thông qua con đường sinh tổng hợp proline do enzyme chủ chốt P5CS xúc tác chuyển hóa glutamate thành GSA/P5C.
3. Cơ chế khử độc các dạng oxy hóa hoạt tính (ROS) thông qua enzyme chống oxy hóa SODFe phân giải gốc superoxide.
4. Cơ chế tương tác phân tử giữa các amino acid đặc hiệu của miền AP2 (gồm các phiến $\beta$ và xoắn $\alpha$) với rãnh chính của chuỗi xoắn kép DNA tại các vị trí motif cis.

Phương pháp nghiên cứu thực tế

Luận án kết hợp đồng bộ các phương pháp tin sinh học, công nghệ sinh học phân tử, chuyển gene thực vật và sinh lý - sinh hóa:

• Nhóm phương pháp tin sinh học:
  • Khai thác dữ liệu trình tự nucleotide và amino acid từ ngân hàng dữ liệu NCBI.
  • Phân tích phát sinh chủng loại bằng phần mềm MEGA sử dụng thuật toán Maximum Likelihood (ML) kết hợp mô hình ma trận JTT (JTT matrix-based model), đánh giá độ tin cậy bằng kiểm định bootstrap.
  • Phân tích miền bảo tồn AP2, xác định các vị trí amino acid tương tác với DNA.
• Nhóm phương pháp thiết kế vector và chuyển gene qua Agrobacterium tumefaciens:
  • Thiết kế cấu trúc gene GmDREB5 nhân tạo mang trình tự mã hóa thẻ cmyc và tín hiệu lưu giữ mạng lưới nội chất KDEL, bổ sung vị trí nhận biết của enzyme cắt giới hạn AscI và BamHI; tạo vector tái tổ hợp trung gian pTWIST_GmDREB5-syn, sau đó chuyển vào vector biểu hiện thực vật pFGC_GmDREB5.
  • Sử dụng cấu trúc vector pBI121_GmDREB7 để biến nạp vào đậu tương.
  • Biến nạp cấu trúc tái tổ hợp vào chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
  • Biến nạp gián tiếp vào mô lá cây thuốc lá (Nicotiana tabacum) và mô phôi hạt đậu tương (Glycine max); tái sinh in vitro qua các môi trường chọn lọc tạo mô sẹo, cảm ứng tạo chồi (SIM), kéo dài chồi (SEM) và ra rễ (RM).
• Nhóm phương pháp phân tích phân tử và biểu hiện gene:
  • Kiểm tra khuẩn lạc bằng kỹ thuật Colony-PCR.
  • Tách chiết DNA hệ gene và RNA tổng số từ lá cây chuyển gene và cây đối chứng (Wild Type - WT).
  • Xác nhận sự tích hợp và phiên mã của gene chuyển bằng kỹ thuật RT-PCR và Real-time qRT-PCR với các cặp mồi đặc hiệu; sử dụng kỹ thuật Western blot kiểm tra sự hiện diện của protein tái tổ hợp.
  • Định lượng mức độ biểu hiện tương đối của gene chuyển (GmDREB5, GmDREB7) và các gene mục tiêu (NtP5CS, NtSODFe, GmP5CS) ở điều kiện bình thường và sau khi xử lý stress mặn (bằng dung dịch NaCl ở các khoảng thời gian xác định, như 7 ngày).
• Nhóm phương pháp sinh lý, sinh hóa và docking phân tử:
  • Đo hàm lượng proline tự do theo phương pháp so màu acid ninhydrin.
  • Đánh giá khả năng chịu hạn, chịu mặn qua tỷ lệ sống sót, hình thái sinh trưởng, chiều cao cây, sinh khối và các chỉ tiêu hóa sinh của hạt ở thế hệ TG1.
  • Mô phỏng docking phân tử in silico bằng máy chủ HADDOCK nhằm xác định mạng lưới liên kết hydrogen, tương tác Van der Waals và năng lượng liên kết giữa miền AP2 của protein GmDREB5, GmDREB7 với các trình tự promoter của NtP5CS, NtSODFe và GmP5CS.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng kết toàn diện cơ sở lý luận về họ nhân tố phiên mã AP2/ERF và phân họ DREB ở thực vật. Nội dung tập trung phân tích đặc điểm cấu trúc không gian của miền AP2 (gồm hai motif YRG và RAYD), cơ chế nhận diện đặc hiệu motif DRE/CRT (5'-TACCGACAT-3' hoặc lõi A/GCCGAC) trong con đường truyền tín hiệu không phụ thuộc ABA. Tác giả phân tích lịch sử tiến hóa của họ gene AP2 từ rêu (Physcomitrium patens), thạch tùng (Selaginella moellendorffii) đến thực vật hạt kín, làm rõ sự biến động số lượng gene AP2 giữa các loài cây trồng.

Bên cạnh đó, chương 1 trình bày chi tiết về ảnh hưởng của stress hạn và mặn đến sinh lý đậu tương, con đường sinh tổng hợp proline qua enzyme P5CS, hệ thống dập tắt ROS qua enzyme SODFe, và thành tựu sử dụng mô hình cây thuốc lá, kỹ thuật chuyển gene qua A. tumefaciens cùng phương pháp mô phỏng docking phân tử in silico trong nghiên cứu chức năng gene thực vật.

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn vật liệu nghiên cứu: giống đậu tương Williams và giống đậu tương Việt Nam (Xanhtiendai, mã số truy cập FR822737), cây mô hình thuốc lá (N. tabacum); các vector tái tổ hợp (pTWIST_GmDREB5-syn, pFGC_GmDREB5, pBI121_GmDREB7); các chủng vi khuẩn biến nạp; hóa chất và hệ thống thiết bị sinh học phân tử.

Chương này trình bày cụ thể quy trình kỹ thuật: tách dòng, thiết kế đoạn mồi PCR; các bước nuôi cấy mô tái sinh in vitro (môi trường CCM, SIM, SEM, RM); phương pháp xử lý stress mặn bằng NaCl; kỹ thuật RT-PCR, Real-time qRT-PCR, Western blot; phương pháp định lượng proline; và quy trình docking phân tử 3 giai đoạn trên máy chủ HADDOCK (docking vật thể cứng, tinh chỉnh bán linh hoạt và tối ưu hóa trong dung môi nước) để đánh giá năng lượng tự do và liên kết hydrogen giữa protein và DNA.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Kết quả nghiên cứu được chia thành 3 phần chính phản ánh đúng cấu trúc thực nghiệm của luận án:

1. Tiến hóa phân tử của họ gene AP2 ở cây Arabidopsis thaliana và đậu tương

• Phân tích trên cơ sở dữ liệu NCBI và xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng phần mềm MEGA (thuật toán ML, mô hình JTT) đã làm rõ mối quan hệ tiến hóa giữa các thành viên họ AP2 và phân họ DREB giữa A. thaliana và đậu tương (Glycine max).
• Hệ gene đậu tương có số lượng gene họ AP2/ERF lớn (301 gene theo phân tích hệ gene), trong đó phân họ DREB gồm nhiều thành viên phân bố trên các nhiễm sắc thể khác nhau. Gene GmDREB5 (LOC100809887) định vị trên nhiễm sắc thể số 13, trong khi GmDREB7 (LOC100101894) nằm trên nhiễm sắc thể số 20.
• Miền AP2 của protein GmDREB5 và GmDREB7 bảo tồn cấu trúc nhận diện DNA, thuộc nhóm phụ A-5 của phân họ DREB. Trong miền AP2, các amino acid liên kết trực tiếp với motif DNA đích được xác định, bảo toàn cấu trúc giúp nhận biết các motif tác động cis.

2. Nghiên cứu chức năng của gene mã hóa nhân tố phiên mã DREB5 của cây đậu tương

• Tác giả đã thiết kế thành công gene nhân tạo GmDREB5 (chứa các điểm cắt AscI, BamHI, trình tự mã hóa cmyc và tín hiệu KDEL) và tạo vector biểu hiện pFGC_GmDREB5.
• Biến nạp cấu trúc vào cây thuốc lá thông qua A. tumefaciens, phân tích colony-PCR, RT-PCR và Western blot xác nhận sự có mặt và biểu hiện ổn định của protein tái tổ hợp GmDREB5 ở các dòng thuốc lá chuyển gene thế hệ TG0.
• Dưới điều kiện xử lý stress mặn (NaCl), các dòng thuốc lá chuyển gene GmDREB5 có mức độ biểu hiện gene chuyển tăng cao rõ rệt so với điều kiện thường. Đồng thời, mức độ phiên mã của hai gene mục tiêu là NtP5CS (tổng hợp proline) và NtSODFe (khử gốc tự do) ở các dòng chuyển gene (tiêu biểu như dòng TG08) tăng mạnh so với cây đối chứng không chuyển gene (WT).
• Sự gia tăng biểu hiện của NtP5CS tương quan thuận với sự tích lũy hàm lượng proline tự do trong mô lá, giúp cây chuyển gene duy trì trạng thái sinh lý tốt hơn dưới điều kiện stress mặn.
• Kết quả mô phỏng docking phân tử in silico xác nhận miền AP2 của GmDREB5 tạo phức hợp liên kết bền vững với vùng promoter của gene NtP5CS và NtSODFe thông qua mạng lưới liên kết hydrogen và tương tác tĩnh điện với các motif cis đặc hiệu.

3. Vai trò của gene mã hóa nhân tố phiên mã DREB7 ở cây đậu tương

• Biến nạp cấu trúc mang gene GmDREB7 qua vector pBI121_GmDREB7 vào cây đậu tương nhờ A. tumefaciens, tái sinh chồi in vitro và tạo thành công các cây đậu tương chuyển gene thế hệ TG0; sự tích hợp của gene chuyển được xác nhận bằng RT-PCR.
• Ở thế hệ TG1, dưới điều kiện tưới nước bình thường và xử lý stress mặn (dung dịch NaCl sau 7 ngày), phân tích Real-time qRT-PCR cho thấy mức độ phiên mã của gene GmDREB7 ở các dòng chuyển gene cao vượt trội so với cây đối chứng WT.
• Sự biểu hiện mạnh của GmDREB7 dẫn đến sự gia tăng có ý nghĩa mức độ phiên mã của gene mục tiêu GmP5CS, kéo theo sự tăng cao rõ rệt của hàm lượng proline tự do trong mô lá cây đậu tương chuyển gene so với cây đối chứng WT khi bị stress mặn.
• Phân tích docking phân tử in silico giữa miền AP2 của GmDREB7 (gồm 59 amino acid với 11 vị trí liên kết DNA) và promoter của GmP5CS ghi nhận phức hợp liên kết có giá trị năng lượng tự do thấp và mạng lưới liên kết hydrogen chặt chẽ.
• Đánh giá khả năng chống chịu stress cho thấy các dòng đậu tương chuyển gene thế hệ TG1 sinh trưởng ổn định hơn, tỷ lệ sống sót cao hơn dưới điều kiện stress mặn và hạn, đồng thời duy trì các đặc điểm hình thái và hóa sinh hạt tương đương hoặc vượt trội so với dòng WT.

Chỉ tiêu / Đặc tính phân tử	Gene GmDREB5	Gene GmDREB7
Mã định danh gene (Gene ID)	LOC100809887	LOC100101894
Vị trí trên nhiễm sắc thể	Nhiễm sắc thể số 13	Nhiễm sắc thể số 20
Chiều dài phân tử mRNA / Protein	924 bp / 307 amino acid	NM_001248108.1 / 207 amino acid
Độ dài miền bảo tồn AP2	63 amino acid	59 amino acid (11 vị trí tương tác DNA)
Vector biểu hiện thực vật	pFGC_GmDREB5 (gắn cmyc, KDEL)	pBI121_GmDREB7
Đối tượng biến nạp thực nghiệm	Cây mô hình thuốc lá (N. tabacum)	Cây đậu tương (Glycine max)
Gene mục tiêu được kiểm chứng	NtP5CS, NtSODFe	GmP5CS
Chỉ tiêu sinh hóa - chức năng	Tăng mức phiên mã, tăng proline	Tăng mức phiên mã, tăng proline, chịu mặn/hạn ở TG1
Phương pháp mô phỏng tương tác	Docking phân tử in silico (HADDOCK)	Docking phân tử in silico (HADDOCK)

---

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới về mặt lý luận và khoa học

1. Luận án đã xác định được vai trò điều hòa của hai gene mã hóa nhân tố phiên mã GmDREB5 và GmDREB7 (thuộc nhóm A-5 phân họ DREB) trong cơ chế đáp ứng với stress mặn ở thực vật. Kết quả chứng minh GmDREB5 có khả năng hoạt hóa biểu hiện các gene mục tiêu NtP5CS và NtSODFe ở cây thuốc lá chuyển gene, từ đó tăng cường cơ chế bảo vệ tế bào thông qua tổng hợp chất thẩm thấu (proline) và enzyme khử gốc tự do (SODFe).
2. Luận án đã chứng minh sự biểu hiện mạnh của GmDREB7 trong cây đậu tương chuyển gene làm tăng mức độ phiên mã của gene GmP5CS, dẫn đến tăng tích lũy proline nội bào và nâng cao khả năng thích ứng của cây trước tác động của stress mặn.
3. Luận án đã làm rõ cơ sở phân tử của sự tương tác giữa vùng AP2 của hai protein GmDREB5, GmDREB7 và promoter của các gene mục tiêu (NtP5CS, NtSODFe, GmP5CS) thông qua phân tích docking phân tử in silico, cung cấp bằng chứng về sự liên kết đặc hiệu giữa nhân tố phiên mã DREB nhóm A-5 với các yếu tố cis điều hòa đáp ứng stress.

Đóng góp về mặt thực tiễn và giải pháp đề xuất

• Thiết lập thành công hệ thống vector biểu hiện và quy trình chuyển gene gián tiếp qua A. tumefaciens phục vụ nghiên cứu chức năng gene ở cây mô hình thuốc lá và cây đậu tương.
• Tạo tuyển chọn được các dòng đậu tương chuyển gene GmDREB7 ở thế hệ TG1 có khả năng chịu mặn và chịu hạn tốt hơn đối chứng không chuyển gene, cung cấp nguồn vật liệu di truyền phục vụ công tác chọn tạo giống đậu tương thích ứng với biến đổi khí hậu và hiện tượng xâm nhập mặn.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của đề tài

• Các thí nghiệm đánh giá khả năng chống chịu stress mặn và hạn mới chỉ được tiến hành ở điều kiện phòng thí nghiệm, phòng nuôi cấy mô và nhà lưới có kiểm soát trên các thế hệ chuyển gene ban đầu (thế hệ TG0 ở cây thuốc lá và thế hệ TG0, TG1 ở cây đậu tương).
• Dữ liệu tương tác phân tử giữa miền AP2 và vùng promoter của các gene mục tiêu (NtP5CS, NtSODFe, GmP5CS) được xây dựng dựa trên mô phỏng tính toán docking phân tử in silico, chưa được kiểm chứng song song bằng các kỹ thuật thực nghiệm in vitro chuyên biệt như điện di dịch chuyển dải băng (EMSA) hay kết tủa miễn dịch nhiễm sắc chất (ChIP).

Hướng nghiên cứu tiếp theo

• Tiếp tục theo dõi, nhân dòng và đánh giá tính ổn định di truyền của gene chuyển GmDREB7 cũng như tính trạng chịu mặn, chịu hạn ở các thế hệ tiếp theo (TG2, TG3) của các dòng đậu tương chuyển gene.
• Tiến hành khảo nghiệm các dòng đậu tương mang gene chuyển GmDREB7 trong điều kiện ngoài đồng ruộng tại các vùng đất nhiễm mặn thực tế nhằm đánh giá toàn diện năng suất sinh học, năng suất hạt và chất lượng hạt thương phẩm.
• Triển khai các phân tích thực nghiệm hóa sinh (EMSA, ChIP-qPCR) nhằm khẳng định trực tiếp ái lực liên kết vật lý giữa protein GmDREB và các motif cis trên promoter đích trong điều kiện in vivo.

---

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên khảo có giá trị trong các lĩnh vực:

• Đối với nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên chuyên ngành Di truyền học, Sinh học phân tử và Công nghệ sinh học: Luận án cung cấp quy trình nghiên cứu chuẩn mực về phân tích chức năng gene thực vật, từ phân tích tiến hóa tin sinh học, thiết kế gene nhân tạo mang thẻ nhận diện (cmyc, KDEL), kỹ thuật chuyển gene qua Agrobacterium tumefaciens, phân tích mức độ phiên mã bằng Real-time qRT-PCR đến ứng dụng mô phỏng docking phân tử HADDOCK.
• Đối với các nhà chọn tạo giống cây trồng và cơ quan quản lý nông nghiệp: Các phát hiện về chức năng của GmDREB5, GmDREB7 và nguồn vật liệu dòng đậu tương chuyển gene TG1 chịu mặn là cơ sở khoa học định hướng cho các chương trình phát triển giống cây họ đậu thích ứng với đất nhiễm mặn tại Việt Nam. Phần phương pháp thiết kế vector và đánh giá sinh lý - hóa sinh hạt ở Chương 2 và Chương 3 có tính ứng dụng cao cho các nghiên cứu chuyển gene tiếp theo.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Gene GmDREB5 và GmDREB7 định vị ở đâu trên hệ gene đậu tương và có đặc điểm cấu trúc như thế nào?

Gene GmDREB5 (Gene ID: 100809887) nằm trên nhiễm sắc thể số 13 của đậu tương, có phân tử mRNA dài 924 bp, mã hóa chuỗi polypeptide gồm 307 amino acid chứa một miền AP2 bảo tồn dài 63 amino acid. Gene GmDREB7 (Gene ID: 100101894) định vị trên nhiễm sắc thể số 20, bản phiên mã mRNA (mã số NM_001248108.1) mã hóa protein gồm 207 amino acid với một miền AP2 dài 59 amino acid, trong đó có 11 vị trí amino acid tham gia trực tiếp vào tương tác liên kết với phân tử DNA.

2. Hai amino acid nào trong miền AP2 giữ vai trò quyết định tính đặc hiệu liên kết với yếu tố cis DRE/CRT?

Trong miền AP2 của các protein thuộc phân họ DREB, hai amino acid bảo tồn là valine tại vị trí 14 (Val14) và glutamic acid tại vị trí 19 (Glu19) giữ vai trò cốt lõi trong việc nhận biết và gắn kết đặc hiệu với trình tự motif cis DRE/CRT (mang trình tự lõi A/GCCGAC) nằm tại vùng khởi động của các gene đáp ứng stress.

3. Sự biểu hiện của GmDREB5 làm thay đổi những chỉ tiêu sinh học phân tử và sinh lý nào ở cây thuốc lá chuyển gene?

Khi biểu hiện ở cây thuốc lá chuyển gene thế hệ TG0 dưới điều kiện stress mặn, GmDREB5 làm gia tăng mạnh mức độ phiên mã của hai gene mục tiêu là NtP5CS và NtSODFe. Sự hoạt hóa phiên mã của NtP5CS dẫn đến sự gia tăng tương ứng hàm lượng proline tự do trong tế bào lá (như ghi nhận ở dòng TG08), giúp mô thực vật duy trì cân bằng thẩm thấu và giảm thiểu tác hại của các gốc oxy hóa hoạt tính.

4. Kết quả đánh giá các dòng đậu tương chuyển gene GmDREB7 thế hệ TG1 dưới stress mặn ghi nhận được những gì?

Ở thế hệ TG1, sau 7 ngày chịu stress mặn (dung dịch NaCl), các dòng đậu tương mang gene chuyển GmDREB7 duy trì mức độ phiên mã gene chuyển cao vượt trội so với cây đối chứng WT. Mức độ biểu hiện của gene mục tiêu GmP5CS tăng cao dẫn đến tích lũy hàm lượng proline lớn hơn cây đối chứng, giúp cây chuyển gene có khả năng thích ứng, giảm triệu chứng tổn thương hình thái và cải thiện rõ rệt khả năng chống chịu stress mặn và hạn.

5. Phương pháp docking phân tử in silico chứng minh điều gì về cơ chế điều hòa của hai protein DREB?

Mô phỏng docking phân tử trên máy chủ HADDOCK chứng minh rằng miền AP2 của cả hai protein GmDREB5 và GmDREB7 có khả năng khớp nối cấu trúc không gian và tạo ra mạng lưới liên kết hydrogen bền vững cùng các tương tác tĩnh điện với các motif cis trên vùng promoter của các gene mục tiêu (NtP5CS, NtSODFe đối với DREB5 và GmP5CS đối với DREB7), cung cấp bằng chứng cấu trúc về cơ chế liên kết trực tiếp để kích hoạt phiên mã gene chức năng.

---

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Nguyễn Thu Giang đã giải quyết trọn vẹn mục tiêu làm sáng tỏ chức năng sinh học và cơ chế điều hòa của hai nhân tố phiên mã GmDREB5 và GmDREB7 thuộc nhóm A-5 phân họ DREB ở đậu tương. Bằng việc kết hợp tiếp cận tin sinh học, mô phỏng docking phân tử in silico với thực nghiệm chuyển gene trên cây mô hình thuốc lá và cây đậu tương, luận án đã chứng minh vai trò kích hoạt phiên mã các gene chức năng (P5CS, SODFe), thúc đẩy tích lũy chất điều hòa thẩm thấu proline và tăng cường cơ chế chống chịu stress mặn. Công trình không chỉ cung cấp những dẫn liệu khoa học mới về mạng lưới điều hòa phiên mã không phụ thuộc ABA ở thực vật mà còn tạo ra các dòng đậu tương chuyển gene thế hệ TG1 có tiềm năng chống chịu bất lợi môi trường, phục vụ định hướng phát triển nông nghiệp bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là cây trồng có giá trị kinh tế và dinh dưỡng cao, đồng thời đóng vai trò quan trọng trong cải tạo đất nhờ khả năng cố định đạm sinh học. Tuy nhiên, năng suất và chất lượng đậu tương thường bị ảnh hưởng nghiêm trọng bởi các yếu tố bất lợi của môi trường, đặc biệt là stress mặn và stress hạn. Dưới tác động của biến đổi khí hậu và quá trình canh tác kéo dài, tình trạng khô hạn và tích lũy muối trong đất ngày càng gia tăng, trở thành những thách thức lớn đối với sản xuất nông nghiệp nói chung và canh tác đậu tương nói riêng.

Khả năng chịu hạn và chịu mặn của thực vật là tính trạng phức tạp, được điều khiển bởi mạng lưới nhiều gene chức năng và gene điều hòa. Các gene chức năng tham gia trực tiếp vào quá trình đáp ứng stress thông qua điều hòa áp suất thẩm thấu, bảo vệ cấu trúc tế bào hoặc khử các dạng oxy hóa hoạt tính, như các gene liên quan đến sinh tổng hợp proline (P5CS, P5CR), phát triển bộ rễ (Expansin) hay các protein sốc nhiệt (HSP). Tuy nhiên, phần lớn các gene này chỉ tham gia vào từng cơ chế đáp ứng riêng lẻ. Trong khi đó, các gene mã hóa nhân tố phiên mã có khả năng điều hòa đồng thời nhiều gene mục tiêu, từ đó kiểm soát toàn bộ mạng lưới đáp ứng stress ở thực vật.

Vì vậy, nhóm gene mã hóa nhân tố phiên mã được xem là đối tượng tiềm năng trong nghiên cứu cải thiện khả năng chống chịu stress phi sinh học ở cây trồng bằng công nghệ sinh học. Trong số các họ nhân tố phiên mã ở thực vật, họ AP2/ERF (APETALA2/Ethylene Responsive Factor), đặc biệt là phân họ DREB (Dehydration Responsive Element Binding), được xác định giữ vai trò trung tâm trong cơ chế đáp ứng với stress hạn, mặn và nhiệt độ thấp. Các protein DREB chứa miền bảo tồn AP2 có khả năng nhận biết và liên kết đặc hiệu với trình tự DRE/CRT (Dehydration Responsive Element/C-repeat) trong vùng promoter của gene mục tiêu, qua đó kích hoạt biểu hiện của nhiều gene liên quan đến chống chịu stress. Đặc điểm điều hòa đa gene này giúp nhân tố phiên mã DREB trở thành mục tiêu quan trọng trong nghiên cứu nâng cao tính chống chịu của cây trồng trước điều kiện bất lợi của môi trường.

1 Ở đậu tương, nhiều gene thuộc phân họ DREB đã được xác định thông qua phân tích hệ gene và được dự đoán liên quan đến đáp ứng stress phi sinh học. Tuy nhiên, chức năng sinh học cụ thể của phần lớn các gene này vẫn chưa được làm sáng tỏ đầy đủ, đặc biệt là cơ chế điều hòa đáp ứng mặn và hạn ở cây chuyển gene. Một số gene như GmDREB5 và GmDREB7 đã được ghi nhận có tiềm năng tham gia điều hòa đáp ứng stress phi sinh học dựa trên đặc điểm trình tự và biểu hiện gene, nhưng các nghiên cứu chức năng trực tiếp còn hạn chế. Xuất phát từ những cơ sở khoa học và thực tiễn trên, việc nghiên cứu chức năng của các gene mã hóa nhân tố phiên mã thuộc phân họ DREB ở đậu tương có ý nghĩa quan trọng trong việc làm sáng tỏ cơ chế phân tử liên quan đến khả năng chịu mặn và chịu hạn, đồng thời cung cấp cơ sở cho ứng dụng công nghệ chuyển gene trong chọn tạo giống cây trồng thích ứng với điều kiện bất lợi của môi trường.

Vì vậy, luận án được thực hiện với đề tài: “Phân tích chức năng và cơ chế điều hòa của các nhân tố phiên mã GmDREB5, GmDREB7 trong đáp ứng với stress mặn ở cây thuốc lá và đậu tương chuyển gene”. Mục tiêu nghiên cứu Xác định được vai trò điều hòa của gene mã hoá protein DREB5 và DREB7 với một số gene mục tiêu trong điều kiện stress phi sinh học. Tạo và đánh giá được một số dòng cây đậu tương chuyển gene GmDREB7 có khả năng chống chịu stress mặn cao hơn đối chứng không chuyển gene. Nội dung nghiên cứu 3.

Nghiên cứu sự tiến hóa phân tử của họ gene AP2 ở cây Arabidopsis thaliana và đậu tương i) Sử dụng Tin sinh học để tìm kiếm và trích xuất các trình tự gene thuộc họ AP2, phân họ gene DREB của cây A. thaliana và cây đậu tương trên ngân hàng dữ liệu NCBI. ii) Xác định số lượng gene họ AP2, phân họ gene DREB, vị trí, số bản copy của mỗi gene DREB trong hệ gene cây A. thaliana và cây đậu tương.

iii) Xây dựng cây phát sinh chủng loại của họ gene AP2, phân họ DREB, vùng AP2 ở cây A. thaliana và cây đậu tương. Nghiên cứu chức năng của gene mã hóa nhân tố phiên mã DREB5 của cây đậu tương i) Thiết kế gene và vector biểu hiện gene GmDREB5 (Glycine max DREB5). ii) Biến nạp cấu trúc mang gene GmDREB5 vào thuốc lá và tạo dòng chuyển gene GmDREB5.

iii) Phân tích mối quan hệ giữa gene GmDREB5 với mức độ phiên mã của một số gene mục tiêu ở cây thuốc lá. iv) Phân tích sự tương tác giữa protein - nhân tố phiên mã DREB5 và promoter của một số gene mục tiêu. Nghiên cứu vai trò của gene mã hóa nhân tố phiên mã DREB7 ở cây đậu tương i) Biến nạp di truyền cấu trúc mang gene GmDREB7 (Glycine max DREB7) vào đậu tương và tạo dòng đậu tương chuyển gene. ii) Phân tích cây đậu tương chuyển gene bằng kỹ thuật Real time RT-PCR.

iii) Phân tích tương tác phân tử in silico protein DREB7 và promoter của gene GmP5CS. iv) Đánh giá một số dòng đậu tương chuyển gene GmDREB7 triển vọng về khả năng chịu mặn và chịu hạn. Những đóng góp mới của luận án 4. Luận án đã xác định được vai trò điều hòa của gene GmDREB5 và GmDREB7 trong đáp ứng với stress mặn.

GmDREB5 có khả năng hoạt hóa biểu hiện các gene mục tiêu NtP5CS và NtSODFe ở cây thuốc lá, từ đó tăng cường cơ chế bảo vệ tế bào thông qua tổng hợp chất thẩm thấu và enzyme khử gốc tự do. Bên cạnh đó sự biểu hiện mạnh của GmDREB7 trong cây đậu tương chuyển gene đã làm tăng mức độ phiên mã của GmP5CS, tăng tích lũy proline và nâng cao khả năng thích ứng với stress mặn. Luận án đã làm rõ cơ sở của sự tương tác phân tử giữa vùng AP2 của protein DREB và promoter của các gene (NtP5CS, NtSODFe, GmP5CS) thông qua phân tích docking phân tử in silico, từ đó củng cố bằng chứng về liên kết đặc hiệu giữa yếu tố phiên mã DREB và các yếu tố cis điều hòa đáp ứng stress. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án Kết quả nghiên cứu đạt được của đề tài có giá trị khoa học và thực tiễn trong tiếp cận nghiên cứu cải thiện khả năng kháng mặn, hạn của cây đậu tương bằng kỹ thuật tăng cường biểu hiện gene.

Nghiên cứu đã mở ra hướng tiếp cận ứng dụng công nghệ gene trong cải tiến giống cây trồng góp phần trong việc ứng phó với biến đổi khí hậu hiện nay. Về mặt khoa học Kết quả nghiên cứu đã góp phần làm sáng tỏ cơ chế điều hòa đáp ứng stress mặn và hạn ở đậu tương thông qua vai trò của các yếu tố phiên mã thuộc phân họ DREB. Việc xác định chức năng điều hòa của gene GmDREB5 và GmDREB7 đã cung cấp bằng chứng thực nghiệm về mối liên hệ giữa hoạt động của các gene này với quá trình tổng hợp chất thẩm thấu và enzyme khử gốc tự do, qua đó làm rõ cơ sở phân tử của khả năng chịu mặn ở cây đậu tương. Những kết quả này góp phần bổ sung hiểu biết về mạng lưới điều hòa gene liên quan đến cơ chế thích ứng sinh lý của thực vật trong điều kiện bất lợi.

Về mặt thực tiễn Nghiên cứu đã xây dựng được cơ sở khoa học cho việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gene trong chọn tạo giống đậu tương chịu mặn và chịu hạn, mở ra hướng tiếp cận tiềm năng trong cải thiện khả năng chống chịu của cây trồng theo hướng thích ứng với biến đổi khí hậu. Các kết quả công bố trên các tạp chí khoa học trong và ngoài nước là nguồn tư liệu có giá trị phục vụ cho nghiên cứu và giảng dạy trong lĩnh vực sinh học và công nghệ sinh học thực vật. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. ĐẶC ĐIỂM HỌ NHÂN TỐ PHIÊN MÃ AP2 VÀ PHÂN HỌ DREB 1.

Họ nhân tố phiên mã AP2 1. Đặc điểm của họ nhân tố phiên mã AP2 Các yếu tố bất lợi phi sinh học như hạn, mặn, nhiệt độ … có tác động tiêu cực đến sinh trưởng, phát triển cũng như năng suất của thực vật. Để thích nghi với những điều kiện này, thực vật đã tiến hóa các cơ chế đáp ứng phức tạp, bao gồm tiếp nhận tín hiệu stress, kích hoạt các con đường truyền tín hiệu phụ thuộc hoặc không phụ thuộc hormone, từ đó điều chỉnh biểu hiện gene nhằm duy trì cân bằng nội môi và khả năng sống sót. Các gene liên quan đến đáp ứng stress phi sinh học ở thực vật được phân loại thành hai nhóm chính.

Nhóm gene điều hòa mã hóa các protein tham gia vào hệ thống nhận biết và truyền tín hiệu, đồng thời kiểm soát sự hoạt hóa hoặc ức chế biểu hiện của các gene đáp ứng stress. Nhóm gene còn lại là các gene chức năng, chịu trách nhiệm mã hóa các protein trực tiếp tham gia vào cơ chế bảo vệ tế bào và tăng cường khả năng thích nghi của cây trong điều kiện môi trường bất lợi [127]. Trong số các gene điều hòa, các nhân tố phiên mã (transcription factors - TF) như AP2, NAC, MYB, WRKY và bZIP đóng vai trò chủ đạo trong việc thiết lập và điều phối mạng lưới điều hòa biểu hiện gene ở mức phiên mã. Ngược lại, các gene chức năng chủ yếu mã hóa các hợp chất và protein tham gia duy trì cân bằng thẩm thấu, ổn định cấu trúc tế bào và giảm thiểu tổn thương oxy hóa, bao gồm các chất thẩm thấu tương thích (proline, đường hòa tan), protein LEA và dehydrin, các enzyme chống oxy hóa như superoxide dismutase (SOD), peroxidase (POD), catalase (CAT), cũng như các protein kênh nước, qua đó góp phần nâng cao khả năng chịu stress của thực vật.

Trong hệ thống các nhân tố phiên mã ở thực vật, họ AP2 được xếp vào nhóm có quy mô lớn và mức độ bảo tồn cao, có vai trò quan trọng trong việc kiểm soát các quá trình phát triển cũng như khả năng thích nghi của cây trước những biến động bất lợi của môi trường.