Tổng quan nghiên cứu

Ung thư phổi là một trong những bệnh ung thư phổ biến và có tỷ lệ tử vong cao trên toàn cầu. Theo ước tính, năm 2020 có khoảng 19,3 triệu ca ung thư mới được chẩn đoán trên thế giới, con số này dự kiến tăng lên 30,2 triệu vào năm 2040. Tại Việt Nam, ung thư phổi đứng thứ hai về số ca mắc mới với khoảng 23.600 ca và 20.700 ca tử vong mỗi năm. Các phương pháp điều trị truyền thống như hóa trị, xạ trị còn nhiều hạn chế do ảnh hưởng đến tế bào bình thường và khả năng kháng thuốc của tế bào ung thư. Trong bối cảnh đó, liệu pháp miễn dịch, đặc biệt là sử dụng kháng thể đơn dòng (mAbs) nhắm vào con đường PD-1/PD-L1, đã mở ra hướng điều trị mới hiệu quả cho bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ.

Luận văn thạc sĩ này tập trung đánh giá các yếu tố ảnh hưởng đến năng suất biểu hiện protein kháng PD-1 trên dòng tế bào buồng trứng chuột hamster Trung Quốc (CHO). Mục tiêu chính là khảo sát môi trường nuôi cấy tối ưu và điều kiện hạ nhiệt độ nhằm tăng sản lượng protein kháng thể kháng PD-1, đồng thời đánh giá chất lượng sản phẩm so với thuốc đối chứng Keytruda. Nghiên cứu được thực hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm với các môi trường nuôi cấy Power CHO, EpiT12 và NanoT12, kết hợp bổ sung chất dinh dưỡng Feed a và Feed b ở các nồng độ khác nhau. Thời gian nuôi cấy kéo dài đến ngày 18 với các điều kiện nhiệt độ được điều chỉnh từ 37°C xuống 32°C từ ngày thứ 5. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển quy trình sản xuất kháng thể đơn dòng trong nước, góp phần giảm chi phí và nâng cao khả năng tiếp cận liệu pháp miễn dịch cho bệnh nhân ung thư.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

  • Công nghệ sản xuất protein tái tổ hợp (Recombinant Protein Production - RPP): Quá trình biểu hiện protein tái tổ hợp trong tế bào động vật có vú, đặc biệt là dòng tế bào CHO, được sử dụng phổ biến trong sản xuất thuốc sinh học do khả năng sửa đổi sau dịch mã như glycosyl hóa, giúp protein có hoạt tính sinh học cao.

  • Cơ chế miễn dịch của kháng thể kháng PD-1: PD-1 là thụ thể trên tế bào T có vai trò ức chế hoạt động miễn dịch khi tương tác với phối tử PD-L1/PD-L2. Kháng thể kháng PD-1 ngăn chặn tương tác này, tái kích hoạt tế bào T để tiêu diệt tế bào ung thư.

  • Ảnh hưởng của nhiệt độ đến biểu hiện protein: Hạ nhiệt độ nuôi cấy từ 37°C xuống khoảng 32°C giúp kéo dài thời gian sống tế bào, giảm apoptosis và tăng năng suất biểu hiện protein nhờ cơ chế sốc lạnh và điều hòa phiên mã, dịch mã.

  • Khái niệm về môi trường nuôi cấy và chất bổ sung: Môi trường nuôi cấy cung cấp các thành phần dinh dưỡng thiết yếu như amino acid, glucose, vitamin, acid béo và các yếu tố tăng trưởng. Việc bổ sung chất dinh dưỡng theo từng giai đoạn (Fed-batch) giúp duy trì sự tăng sinh và biểu hiện protein tối ưu.

Phương pháp nghiên cứu

  • Nguồn dữ liệu: Dòng tế bào CHO biểu hiện kháng thể kháng PD-1 được cung cấp từ công ty Nanogen, Việt Nam. Ba loại môi trường nuôi cấy thử nghiệm gồm Power CHO (Lonza, Mỹ), EpiT12 và NanoT12 (Nanogen, Việt Nam). Chất bổ sung Feed a và Feed b được sử dụng với các nồng độ 1%/0,1% và 2%/0,2%.

  • Thiết kế thí nghiệm: Thí nghiệm được tổ chức theo thiết kế lồng nhau hai giai đoạn (Two-staged nested design). Giai đoạn 1 khảo sát ảnh hưởng của môi trường và nồng độ chất bổ sung ở nhiệt độ 37°C. Giai đoạn 2 khảo sát ảnh hưởng của việc hạ nhiệt độ từ 37°C xuống 32°C từ ngày nuôi cấy thứ 5.

  • Phương pháp nuôi cấy: Tế bào được nuôi cấy huyền phù trong bình 250 mL với thể tích làm việc 50 mL, tốc độ lắc 100 vòng/phút, 5% CO2, độ ẩm 90%. Chất dinh dưỡng được bổ sung từ ngày thứ 3, glucose duy trì ở 30 mM, glutamine bổ sung 2 mM mỗi 2 ngày.

  • Phân tích dữ liệu: Mật độ tế bào, tỷ lệ tế bào sống, nồng độ glucose, glutamine, lactate được theo dõi hàng ngày. Nồng độ protein kháng thể được định lượng bằng sắc ký HPLC sử dụng cột Protein A. Chất lượng protein được đánh giá bằng SDS-PAGE, Western blot và phân tích cấu trúc glycan bằng sắc ký UPLC.

  • Cỡ mẫu và lặp lại: Mỗi nghiệm thức được thực hiện với 3 lần lặp lại độc lập để đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của kết quả.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

  1. Môi trường nuôi cấy tối ưu: Môi trường NanoT12 kết hợp với bổ sung Feed a 1%, Feed b 0,1% từ ngày thứ 3 cho mật độ tế bào cao nhất đạt 18,4 ± 5,01 x 10^6 tế bào/mL vào ngày thứ 7 ở quy trình hạ nhiệt độ 37-32°C. So với các môi trường khác, mật độ tế bào này cao hơn khoảng 1,5 lần.

  2. Ảnh hưởng của nồng độ chất bổ sung: Nồng độ thấp hơn của Feed a:b (1%:0,1%) cho kết quả tốt hơn về mật độ tế bào và tỷ lệ sống so với nồng độ cao hơn (2%:0,2%), đặc biệt trong môi trường EpiT12 và NanoT12.

  3. Tác động của hạ nhiệt độ: Việc giảm nhiệt độ từ 37°C xuống 32°C vào ngày thứ 5 giúp duy trì tỷ lệ tế bào sống trên 80% đến ngày 14, kéo dài thời gian pha tăng sinh và tăng sản lượng protein kháng thể. Nồng độ kháng thể kháng PD-1 đạt tối đa 3141 ± 0,11 µg/mL vào ngày thứ 5 ở điều kiện hạ nhiệt độ.

  4. Chất lượng protein: Sản phẩm protein thu được sau tinh sạch có đặc tính tương tự thuốc đối chứng Keytruda về cấu trúc glycan, điện di SDS-PAGE và Western blot, chứng tỏ tính đồng nhất và hoạt tính sinh học cao.

Thảo luận kết quả

Kết quả cho thấy môi trường NanoT12 với bổ sung Feed a 1%, Feed b 0,1% là điều kiện tối ưu cho sự tăng sinh và biểu hiện protein kháng PD-1 trên tế bào CHO. Việc sử dụng nồng độ chất bổ sung thấp hơn giúp tránh độc tính do quá tải dinh dưỡng, đồng thời duy trì môi trường ổn định cho tế bào phát triển. Hạ nhiệt độ nuôi cấy từ ngày thứ 5 kích thích cơ chế sốc lạnh, làm giảm quá trình apoptosis và tăng cường biểu hiện protein nhờ điều hòa phiên mã và dịch mã đặc hiệu. Các kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đây về ảnh hưởng tích cực của hạ nhiệt độ đối với năng suất protein tái tổ hợp.

Chất lượng protein tương đương với thuốc thương mại Keytruda khẳng định tính khả thi của quy trình nuôi cấy và tinh sạch trong nghiên cứu. Việc duy trì cấu trúc glycan và hoạt tính sinh học là yếu tố then chốt đảm bảo hiệu quả điều trị của kháng thể đơn dòng. Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ mật độ tế bào theo ngày nuôi cấy, biểu đồ tỷ lệ tế bào sống, đồ thị nồng độ protein kháng thể và bảng so sánh đặc tính glycan giữa mẫu nghiên cứu và thuốc đối chứng.

Đề xuất và khuyến nghị

  1. Áp dụng môi trường NanoT12 kết hợp bổ sung Feed a 1%, Feed b 0,1% trong quy trình nuôi cấy tế bào CHO để tối ưu hóa năng suất biểu hiện protein kháng PD-1, với thời gian nuôi cấy khoảng 7-10 ngày. Chủ thể thực hiện: các phòng thí nghiệm và nhà máy sản xuất sinh dược.

  2. Thực hiện hạ nhiệt độ nuôi cấy từ 37°C xuống 32°C vào ngày thứ 5 để kéo dài thời gian sống tế bào và tăng sản lượng protein, áp dụng trong quy trình sản xuất quy mô phòng thí nghiệm và công nghiệp.

  3. Kiểm soát chặt chẽ nồng độ chất bổ sung Feed a và Feed b nhằm tránh độc tính và duy trì môi trường ổn định, đề xuất sử dụng nồng độ thấp (1%:0,1%) cho hiệu quả tối ưu.

  4. Đầu tư phát triển quy trình tinh sạch và kiểm tra chất lượng protein bằng các phương pháp SDS-PAGE, Western blot và phân tích glycan để đảm bảo sản phẩm đạt tiêu chuẩn tương đương thuốc thương mại, phục vụ cho mục tiêu sản xuất thuốc tương đương sinh học.

  5. Khuyến khích nghiên cứu mở rộng quy mô sản xuất từ phòng thí nghiệm lên quy mô công nghiệp, đồng thời khảo sát thêm các yếu tố khác như pH, áp suất thẩm thấu và thành phần môi trường để nâng cao hiệu quả sản xuất.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

  1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Công nghệ Sinh học: Nghiên cứu cung cấp kiến thức chuyên sâu về công nghệ nuôi cấy tế bào CHO, biểu hiện protein tái tổ hợp và các yếu tố ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng sản phẩm.

  2. Doanh nghiệp sản xuất thuốc sinh học: Thông tin về quy trình nuôi cấy, tối ưu môi trường và hạ nhiệt độ giúp cải tiến quy trình sản xuất kháng thể đơn dòng, giảm chi phí và nâng cao chất lượng sản phẩm.

  3. Cơ quan quản lý và phát triển chính sách y tế: Cung cấp cơ sở khoa học cho việc phát triển thuốc tương đương sinh học trong nước, góp phần nâng cao khả năng tiếp cận liệu pháp miễn dịch cho bệnh nhân ung thư.

  4. Bác sĩ và chuyên gia điều trị ung thư: Hiểu rõ cơ chế hoạt động của kháng thể kháng PD-1 và các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng thuốc, hỗ trợ trong việc lựa chọn và tư vấn liệu pháp điều trị miễn dịch.

Câu hỏi thường gặp

  1. Tại sao chọn tế bào CHO để biểu hiện protein kháng PD-1?
    Tế bào CHO có khả năng sửa đổi sau dịch mã như glycosyl hóa, giúp protein có hoạt tính sinh học cao và tương thích với người. Ngoài ra, chúng dễ nuôi cấy huyền phù, thích hợp cho sản xuất quy mô lớn.

  2. Ảnh hưởng của việc hạ nhiệt độ nuôi cấy là gì?
    Hạ nhiệt độ từ 37°C xuống 32°C giúp kéo dài thời gian sống tế bào, giảm apoptosis và tăng biểu hiện protein nhờ cơ chế sốc lạnh, điều hòa phiên mã và dịch mã đặc hiệu.

  3. Tại sao cần bổ sung chất dinh dưỡng Feed a và Feed b?
    Chất bổ sung giúp duy trì nguồn dinh dưỡng thiết yếu trong quá trình nuôi cấy dài ngày, hỗ trợ tăng sinh tế bào và biểu hiện protein, tránh thiếu hụt và stress dinh dưỡng.

  4. Làm thế nào để đánh giá chất lượng protein kháng thể?
    Sử dụng các phương pháp SDS-PAGE để phân tách protein theo trọng lượng, Western blot để xác định đặc hiệu kháng thể, và phân tích cấu trúc glycan để kiểm tra tính đồng nhất và hoạt tính sinh học.

  5. Quy trình này có thể áp dụng cho sản xuất công nghiệp không?
    Kết quả nghiên cứu là cơ sở để mở rộng quy mô từ phòng thí nghiệm lên sản xuất công nghiệp, tuy nhiên cần khảo sát thêm các yếu tố kỹ thuật và kiểm soát chất lượng phù hợp với quy mô lớn.

Kết luận

  • Môi trường NanoT12 kết hợp bổ sung Feed a 1%, Feed b 0,1% là điều kiện tối ưu cho sự tăng sinh và biểu hiện protein kháng PD-1 trên tế bào CHO.
  • Hạ nhiệt độ nuôi cấy từ 37°C xuống 32°C từ ngày thứ 5 giúp kéo dài thời gian sống tế bào và tăng sản lượng protein.
  • Nồng độ protein kháng thể đạt tối đa 3141 ± 0,11 µg/mL, tương đương với thuốc đối chứng Keytruda về chất lượng và cấu trúc glycan.
  • Quy trình nuôi cấy và tinh sạch protein được thiết kế phù hợp cho phát triển thuốc tương đương sinh học trong nước.
  • Đề xuất tiếp tục nghiên cứu mở rộng quy mô sản xuất và tối ưu hóa các yếu tố môi trường để nâng cao hiệu quả và tính kinh tế của quy trình.

Hãy áp dụng những kết quả này để phát triển các liệu pháp miễn dịch hiệu quả, góp phần nâng cao chất lượng điều trị ung thư tại Việt Nam.