CHƯƠNG 1 TỎNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về sản xuất protein tái tổ hop Sản xuất protein tái tổ hợp (RPP- Recombinant protein production) cho mục đích chan đoán và điều tri nhiéu loai bénh trén người tạo thành một thi trường trị giá hàng tỷ đô la. Các protein này thường được tông hợp bằng cách nuôi cấy tế bào “vật chủ” chứa các gen được chuyên nạp mã hóa cho các protein mục tiêu. Quá trình này gọi là công nghệ sản xuất protein tái tổ hợp.
Quá trình sản xuất một protein tái tổ hợp gồm các bước sau i) tách chiết và tinh sạch DNA bộ gene hoặc mRNA của sinh vật cần tạo dong, ii) khuéch dai doan gene ma hoa cho protein mong muốn bang phản ứng chuỗi (PCR), iii) tạo dong gene mục tiêu vào plasmid DNA, (iv) chuyên nạp plasmid mang gene mục tiêu vào tế bào nhận và tạo dong tế bào, (v) phát hiện và phân lập các dòng tế bào nhận mang plasmid chứa gene mục tiêu và có khả năng sản xuât nhiêu protein tái tô hợp nhat. Sản xuất protein tái tô hợp thường được bắt đầu bằng lựa chọn đối tượng sản xuất, đó có thé là vi khuẩn, nam men hoặc tế bào động vật, phổ biến là từ vi khuẩn hoặc tế bào động vật hữu nhũ. Vi khuẩn thường được sử dụng do ưu điểm dễ thực hiện, hệ thông lên men đơn giản, không đòi hỏi trang thiết bị, vật tư đắt tiền. Tuy nhiên khi sản xuất các protein có nguồn gốc từ người và động vật hữu nhũ gặp nhiều bất lợi vì vi khuẩn thiếu khả năng sửa đổi sau dịch mã, bao gồm cả bước phân cắt protein, liên kết các tiểu đơn vị hoặc nhiều phản ứng kết hợp khác nhau như glycosyl hóa, methyl hóa.
Chính vì vậy khi sản xuất những sản phẩm là kháng thể, người ta thường hay dùng tế bào động vật (Jayapal K. Tuy nhiên tế bào động vật được chọn cần đảm bảo những yêu cầu sau: thứ nhất, tế bảo động vật được sử dụng cần phải đảm bảo không được phép lan truyền bất kỳ tác nhân gây bệnh nào trên người; có thể nuôi cấy huyền phù ở quy mô công nghiệp, có khả năng tiếp nhận và duy trì DNA ngoại lai, và biểu hiện gene tái tổ hợp thành protein mong muốn. Thứ hai, quá trình hiệu chỉnh sau dịch mã có ảnh hưởng đến tính hoa tan, tinh ồn đỉnh, hoạt tính sinh học và thời gian ton tại của protein mục tiêu trong tế bảo cũng như trong co thé vật chủ. Vì vậy, dé liệu pháp điều trị bằng protein có hiệu quả, protein tái tổ hợp phải được tổng hợp ở dạng có hoạt tính sinh học đề đảm bảo gấp cuộn đúng theo cấu trúc không gian tự nhiên của chúng.
Việc sử dụng tế bảo động vật có vú dé sản xuất mAbs được coi là tiêu chuẩn vàng và đã được phê duyệt để đảm bảo thực hành sản xuất tốt GMP. Với hai mươi năm kinh nghiệm sử dụng tế bào buồng trứng chuột đồng Trung Quốc (CHO) trong nghành dược phẩm sinh học đã chứng minh được chúng sở hữu đầy đủ các yêu cầu về sản xuất protein. Protein sản xuất từ tế bào CHO có các dạng glycosyl hóa tương thích sinh học với người, có khả năng tạo dòng tế bào đồng nhất trong nuôi cấy (Karthik và ctv, 2007). Cuối cùng, điều kiện quyết định nên thành công của quá trình sản xuất thuốc theo con đường tái tổ hợp là thiết kế hệ thống biểu hiện protein và tôi ưu hóa dé cho năng suất và chất lượng cao nhất.
Tuy nhiên, bên cạnh ưu điểm thì toàn bộ quy trình này cũng có nhược điểm là yêu cầu chi phí sản xuất và bảo trì cao, quản lý tốn kém dẫn đến giá thành sản phẩm cao, sự biểu hiện của protein ngoài dòng tế bào bố mẹ ban đầu còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó có điều kiện nuôi cấy, môi trường nuôi cấy, phương pháp tinh sạch, các vector, vật chủ, phương pháp chuyên gen (Ritacco và ctv, 2018). Hiện nay, khoảng 95% tổng số kháng thé đơn dong (mAbs) được sản xuất từ tế bào động vật có vú. Các kỹ thuật được sử dụng có thé ké đến là công nghệ hybridoma. Đây là một trong những kỹ thuật nền tảng để sản xuất mAbs từ tế bào động vật có vú được sử dụng lần đầu tiên vào năm 1975 bởi Georges Köhler và Cesar Milstein, cả hai đạt được giải Nobel về sinh lý học và y học năm 1984.
Kỹ thuật lai truyền thống này liên quan đến việc tiêm kháng nguyên mục tiêu cho chuột nhằm kích thích phản ứng miễn dịch và từ đó tạo ra tương bào là tế bào sản xuất kháng thê chống lại kháng nguyên đó. Sau đó tương bào được phân lập từ lá lách của chuột và được hợp nhất với dòng tế bao u tủy bất tử dé tạo ra tế bào lai. Mặc dù công nghệ hybridoma đã đi đầu trong sản xuất mAbs nhiều năm liền, tuy nhiên công nghệ này chỉ có thế sản xuất mAbs ổn định với quy mô nhỏ trong phòng thí nghiệm, không có khả năng tạo ra số lượng kháng thé ôn định với quy mô công nghiệp. Để khắc phục điều này các nhà nghiên cứu đã cho ra đời công nghệ DNA tái tổ hợp để sản xuất mAbs quy mô lớn trên đối tượng là tế bào buồng trứng của chuột đồng Trung Quốc (CHO).
Hiện có hai hãng được phẩm lớn cũng đang áp dung công nghệ này là Merck và Bristol-Myers Squibb. Các mAbs được nhân tính hóa bằng cách gây miễn dịch ban đầu cho chuột bằng protein mục tiêu của con người nhằm kích hoạt phản ứng miễn dịch. Sau đó các kháng thé đặc hiệu với protein mục tiêu sẽ được xác định va DNA mã hóa chuỗi nặng và chuỗi nhẹ được tạo ra từ tương bào ở lách sau đó được chuyền hóa ôn định vào tế bào CHO tạo ra dòng tế bào sản xuất mAbs tái tổ hợp (Lu và ctv, 2020). Tetrahydrofolate và các dẫn xuất của nó rat cần thiết cho quá trình tổng hợp, tăng sinh và tăng trưởng tế bào đặc biệt là tổng hợp glycine, purine và thymidine.
Trong điều kiện có kháng sinh, enzyme nay làm biến đôi các phân tử diaminoheterocycle dẫn đến các liên kết khác nhau ở các tế bào vi khuẩn, vì vậy ở vi khuan sẽ hình thành nên nhiều lớp DHER. Ở người, enzyme DHFR được mã hóa bởi gen DHFR nằm trên nhiễm sắc thé số 5 và được giữ 6n định không bị biến đổi ngay cả trong điều kiện có kháng sinh. Chính vì điều này mà hệ thống biểu hiện protein sử dụng (CHO)/DHER là một trong những hệ thống tế bào động vật có vú được sử dụng phổ biến nhất đề biểu hiện protein tái tổ hợp ở mức độ cao (Chusainow và ctv, 2009). Ngoài ra, tế bào CHO được chứng minh là an toàn dé sản xuất các protein sử dụng cho điều trị đích.
Tính an toàn của tế bào CHO được chứng minh thực tế sau hơn 20 năm sử dụng dé sản xuất các protein điều trị đích và nhiều sản phẩm được FDA phê duyệt (Karthik, 2007). Về hiệu quả trong sản xuất, tế bào CHO thích nghi nhanh và tăng trưởng ở mật độ cao khi nuôi cấy huyền phù trong môi trường không chứa huyết thanh. Do đó, protein mục tiêu được sản xuất đễ đàng mở rộng quy mô đến lò phản ứng sinh học trong những bồn lên men thê tích lớn trên 10. Đối với tinh chế, các sản phẩm từ tế bao CHO có thé được tinh sạch ở mức độ dư lượng DNA tế bào CHO nhỏ hon vài picogam trên 1 miligam sản pham.
Với những ưu điểm như vậy hiện nay dòng tế bào CHO dang được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất sinh được phẩm với 70% các protein tái tổ hợp được sản xuất từ dòng tế bao này và doanh thu hàng năm hiện tại cho các sinh phẩm được sản xuất từ tế bào CHO đã vượt quá 30 tỷ đô la Mỹ trên toàn thế giới (Beck và ctv, 2013). Cơ chế miễn dịch của kháng thé khang PD - 1 trong điều trị ung thư phối Ung thư phổi có hai loại chính là ung thư phổi tế bào nhỏ (UTPTBN) và ung thư phổi không tế bào nhỏ (UTPKTBN). Ung thư phổi không tế bào nhỏ là loại ung thư phố biến nhất chiếm 84% trong tất cả các chân đoán ung thư phối. Với mỗi loại bệnh sẽ có phương pháp điều trị khác nhau.
UTPKTBN xảy ra khi các tế bào bất thường tăng sinh mạnh mẽ ở biểu mô phế quản của phổi và chiếm đại đa số (khoảng 84%) các trường hợp được chân đoán mắc ung thư phổi. Bệnh có xu hướng tiến triển rất nhanh và thời gian chuyền sang giai đoạn di căn khá ngắn. Liệu pháp sử dụng các thuốc ức chế kiểm soát miễn dịch đã mở ra những cơ hội điều trị mới có hiệu quả cho bệnh nhân ung thư phối giai đoạn bệnh tiến triển nhanh, đáp ứng kém hoặc không đáp ứng với hoá xạ trị. Hệ miễn dịch của cơ thể được tạo thành từ mạng lưới các tế bào, các mô, các cơ quan và các loại dịch thé (protein); cụ thé đó là các loại bạch cầu và các loại kháng thé.
Hệ miễn dịch có chức năng bảo vệ cơ thể chống lại các tác nhân lạ từ bên ngoài vào cơ thể như virus, vi khuẩn, kí sinh trùng, nam và các tế bào lạ. Các tế bao ung thư trong cơ thé cũng được hệ miễn dịch xem như tác nhân lạ tấn công cơ thể và hệ thống miễn dịch sẽ tìm tế bào ung thư để tiêu diệt. Điều trị miễn dịch trong ung thư ngày càng trở thành một phương thức can thiệp điều trị có hiệu quả trong các bệnh lý ác tính. Phương pháp này khác biệt với các biện pháp khác như phẫu thuật, hoá chất, xạ trị, điều trị đích ở việc nâng cao vai trò của hệ thống miễn dịch để chống lại tế bào ung thư một cách tự nhiên và hiệu quả (Allen và ctv, 2008).
Trước đây, điều trị miễn dịch trong ung thư chủ yếu là các biện pháp thuộc nhóm miễn dịch không đặc hiệu, tăng cường chức năng của hệ miễn dịch nói chung hoặc làm giảm các điêu kiện vi môi trường thuận lợi cho sự phát triển và lan rộng của tế bào ung thư, cụ thể như tiêm vaccin phòng các loại virus gây ra các bệnh có thé dẫn đến ung thư, sử dụng các cytokin (IL2; IFN) với vai trò chất trung gian thông tin và hoạt hoá tế bao (Valerie và ctv, 2012).