CHƯƠNG 1. Mục tiêu đề tài. - 25-5221 2221221212112121121111211112111121111211112111121111212112111 12a 2 LB IN Ot cure ttre THIẾT cexesse sa sicEEE S0 242308028001L1-3285080L6015330E bon g8 320g 3HU518-0-S5H21. TONG QUAN TAI LIBU .-- 2-5252 +S2EE2EE£EE£EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEErkrrkervee 3 2.
Sơ lược về cây cam. PHA IGA, MAGA, NOG Quang ng H-GOED HHÀNGGEE.HASGGEIG4XGSEASIEEESSERGEMELIGHSIGHE-EATESISEREIEEESEESLSLISEES 3 2. Nguồn gốc va phan B62. cc ccccc ces seeesesseeseeseeseesessesestesssseseeseesestsseessesiteseetseeseeeeees 3 215), Đặi điểm ;sĩnh hợo về le VAR cca ccrvencssnnrnerecnicivsnssisiondsttvinseniveutnscataeencedveasniitetedsi 4 2.
Điều kiện ngoại cảnh. 2-2 S2S2SE2E9SE2EEEE2E2125121221212212121121112121121112111 211121 xe 5 2. Tinh hinh san xuat 4+4. Tình hình sản xuất trên thé giới.---- 2¿©2222222E2EE22EE2EEE2E122E1271222122122212222222 2.
Tình hình sản xuất ở Việt Nam. 2-2 22s SE+SE2EE2EE2EE212212112112121211111 21. 6 A Ôn (KHI aT AOR cession esti netic 7 2. Giá trị dinh dưỡng và sử dụng.
Giá trị công nghiệp và được lu .-- ---- +5 22223322 *+2ES*EES+EErEerresrkrrrerrkererrerer 7 E5. 00 8í bí ti Tceeaaeraotrttrirrtinttt rcrptvigESSGSSUGEETAGESGSGTSHEGGTEGGIENENGREOSGBSGUEEIGUGE 8 sa hed Sa MG amt Tất] TR, THƯỜNG a cess casa ecu rm ncrsonuanneesinepeas se wsannatnenswsnmausavenisesmimcumuaemmianaes 8 2.1 TH KE HG DNS Vac catwsnsns cows cansontiosnacvatiesntenuveantveseuessibiana dananininenthinaritnebaanaweneea tees 9 2. Sơ lược về một số sâu, bệnh hại trên 24011. Bénh do virus Tristeza nh.
Bean Waid la CifØEfinifr (EGOS BTID ) saseuseeaageddnnninsbiagiasdbiod350004600010854650g4G1014000080 11 2. Ray chéng cánh Diaphorina citri Kuwayata. Một số phương pháp chuan đoán bệnh trên thực vật. Kỹ thuật chan đoán dựa vào triệu chứng.
Kỹ thuật chan đoán bằng cây chỉ thị. Kỹ thuật chan đoán dựa vào acid nuecÏeic.---2- 2 z+22z+2E+2++2z22z2z2zE+zxzzzzzzzxee 14 DG, CRG nin we lọ PC 5N NỚỹx. Giới thiệu về kỹ thuật Mutiplex PCR .ccccccccccsessessessessessessesseesesstsseestesesneeseeseess l6 CHƯƠNG 3. VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP.
Thời gian và địa điểm nghiên cứu.7, Vậi liệu trả Bữa GLUỆE: sec nen ng th nh G11 503 0 35136 tv5612300033310G36-G08 330x410 4,4436. 140002 g01 17 sat aloo 1 ea ee OB TIRE OW REỆTNhaekotueeoBonktiggiphliuiotISi6008050046)0160303030006088100001003403880A4/800380180)G800G08i140004608gnd/8 17 es a eae 17 3. Thiết bị và dụng Cụ. HMØWIE PG TIEHIST ĐỨNG cu «na nnndniidndDgOiBditikgBiniEGIGS0S60DE040:GG1G0301010⁄6.
Tạo mẫu chuẪn ưØng. Xây dựng quy trình phát hiện vi khuan Candidatus Liberibacter asiaticus va Citrus Tristeza Virus (CTV) bang kỹ thuật Multiplex PCT. Áp dụng quy trình Multiplex PCR phát hiện đồng thời vi khuẩn Candidatus Liberibacter asiaticus và Citrus Tristeza Virus (CTV) trên mẫu thực địa. KET QUA VÀ THẢO LUẬN.
Tao mẫu chuẩn dương cho quy trình phát hiện Candidatus Liberibacter asiaticus va Citrus Tristeza Virus (CTV) Nm. Xây dựng quy trình phát hiện vi khuân Candidatus Liberibacter asiaticus va Citrus Tristeza Virus (CTV) bằng kỹ thuật Multiplex PCR. Ap dụng quy trình Multiplex PCR phát hiện đồng thời vi khuẩn Candidatus Liberibacter asiaticus và Citrus Tristeza Virus (CTV) trên mẫu thực địa. KẾT LUẬN VA DE NGHỊ,.
¿2 +5 SS4+E£EEEE2E2EEEEEE2EEE212171112121 1 ce2 44 | | aa 44 5. DG ght ooo. 44 TÀI LIEU THAM KHẢO. 2-22 ©22+2E22EE22E22EE22E122122212212221221127112112211211221121122 c6 45 PHU LUC 1 PHU LUC 2 vil DANH SÁCH CAC CHỮ VIET TAT bp: base pairs CTV: Citrus Tristeza Virus cDNA: Complementary deoxyribonucleic acid NCBI: National Center for Biotechnology Information PCR: Polymerase Chain Reaction RNA: Ribonucleic acid DNA: Deoxyribonucleic acid ctv: cong tac vién SDS: Sodium Dodecyl Sulfate Ta: Annealing temperature NC CAQ: Nghiên Cứu Cây An Qua ĐBSCL: Đồng Bằng Sông Cửu Long FAO: Food and Agriculture Organization of the United Nations VAC: Vuon, Ao, Chuông VACR: Vườn, Ao, Chuông, Ruộng lúa RT — PCR: Reverse transcription — Polymerase Chain Reaction ELISA: Enzyme — Linked Immunosorbent Assay RPA: Recombinase polymerase amplification viii DANH SÁCH CÁC BANG Trang Bang 2.
Thanh phần dinh dưỡng của cam.- 2-22 22 522S22E22E£2EE2EE2EE2ZEZEzEzErzzvez 7 Bảng 2. Hàm lượng vitamin (mg/1Ũ8),.-- --- 5< E2 ***E*E*E SE ng re 8 Bang 3. Tên va trình tự primer dùng cho phản ứng PCT. 2 Thành phần hóa chất cho phản ứng tạo c€ÖDNA.
Thanh phần hóa chất cho phản ứng PCR phát hiện virus CTV. Chu trình nhiệt dùng cho phản ứng PCR phát hiện virus CT'V. Thanh phan hóa chất cho phản ứng PCR phát hiện vi khuẩn Cadidatus Liberibacter ASIQUiCUS 0080000808000. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR phát hiện vi khuẩn Cadidatus Liberibacter CSI HH ÍẲẨ toc sá516 16331513 53555355556580E5905.EESSLĐESABS6C8419583I2RESS3S01G845SGEESSEKGSE-S5488435E5S1SECG.
Thanh phần tham gia phan ứng ở nồng độ primer 1 WM —0,1 M. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCTR. Thanh phan tham gia phan ứng Multiplex PCR khảo sát nhiệt độ bắt cặp. Chu trình nhiệt cho một phản ứng Multiplex PCR khảo sát nhiệt độ.
Tông hợp nồng độ primer.-2- 2 2 222S222£2E2EE2EE2EE£2EE2E22E222222222zx re 28 Bảng 3. Thanh phần tham gia phản ứng ở nồng độ primer tông hợp. Chu trình nhiệt tham gia phản ứng Multiplex PCR khảo sat nồng độ primer29 Bảng 4. Nồng độ RNA được ly trích từ mẫu đối chứng đương.
Nong độ DNA được ly trích từ mau đối chứng dương. Tên và trình tự primer ding cho phản Ứng PCR cccccscecsnccscessssxenosnccvevossxcesvensns 34 DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 3. Sơ đồ quy trình thực hiện nghiên cứu. Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen mục tiêu của virus CTV với cặp primer (0À 2101410100210 00 2À14)/0100.
Kết qua điện di sản phẩm PCR đoạn gen mục tiêu của vi khuẩn Candidatus Liberibacter asiaticus với cặp mỗi LAS606/LSS. Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra độ đặc hiệu của primer ACT675-F/ACT-. ca ca acc. Kết quả điện di sản pham PCR khảo sát nồng độ primer ACT675-F/ACT-R.
Kết qua điện di sản phẩm PCR khảo sát nồng độ primer CTV TVM107-F/CTV i gtoiG000008003000070uã07888100300800208mIBAS8007008001001301000800g00 200818. Kết qua điện di sản phâm PCR khảo sát nồng độ primer LAS606/LSS. Kết qua điện di sản phẩm PCR khảo sát nhiệt độ bằng phan ứng Multiplex PCR. CE112112211211121122112111112112112111121112111 21111211 2111111121111112111211111121121111121 xe rea 38 Hình 4.
Kết quả điện di sản phẩm PCR khảo sát nồng độ bằng phản ứng Multiplex PCR =5. Kết quả điện di sản phẩm PCR các mẫu ở vườn l. Kết quả điện di sản phẩm PCR các mẫu ở vườn 2. Kết quả điện di san phẩm PCR các mẫu ở vườn 3.
Dat van đề Cây cam thuộc ho Rutaceae, là loại cây ăn qua có gia tri kinh tế cao, đem lại nguồn thu nhập lớn cho nhà vườn, là một loại quả phổ biến được sử dụng hàng ngày trong mỗi gia đình người Việt, là một cây trồng có giá trị dinh dưỡng và đóng góp không nhỏ vào ngân sách nhà nước. Tuy đem lại nguồn kinh tế cao nhưng cây cam lại nhiễm nhiều bệnh nguy hiểm và ngành trồng cây cam vẫn đang đứng trước những thách thức lớn. Với điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng 4m ở nước ta, là điều kiện tốt thích hợp cho dịch bệnh phát triển. Đây là bệnh rất nguy hiểm, lây lan nhanh và khó phòng trừ, bệnh gây thiệt hại rất lớn làm giảm năng suất và chất lượng cây trồng.
Hiện nay, dịch bệnh trên cây trồng diễn biến rất phức tạp, một loại cây trồng có thé bị nhiễm nhiều loại bệnh khác nhau, đặc biệt là các bệnh do virus và vi khuẩn gây nên, làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất cũng như chất lượng cây trồng. Trong đó bệnh vàng lá Greening là quan trọng nhất và đang được nhiều nước trên thế giới đầu tư nghiên cứu tìm biện pháp phòng trừ. Bên cạnh đó một số bệnh khác cũng không kém phần quan trọng, nhất là trong giai đoạn hiện nay đó là bệnh do virus Citrus Tristeza Virus (CTV) gây ra, bệnh vàng lá thôi rễ do nhiều loại nam và tuyến trùng gây ra. Do đó, cần có các phương pháp phát hiện kịp thời dé kiểm tra, phát hiện sớm và loại bỏ cây bị nhiễm để tránh lây lan trên điện rộng làm bùng phát dịch bệnh cũng như nâng cao bệnh pháp phòng trừ.
Hiện nay có nhiều kỹ thuật cũng như phương pháp phát hiện đồng thời cả hai bệnh do virus và vi khuẩn trên cây cam, trong đó Mutiplex PCR là một trong những phương pháp ưu việt nhất do có độ nhạy cao, chính xác, rút ngắn thời gian phát hiện bệnh. Ngoài ra, trong xét nghiệm sinh học phân tử, việc chân đoán gen mục tiêu rất quan trọng, nó phục thuộc nhiều vào quá trình tách chiết nucleic acid. Để kiểm soát quá trình nay, sử dụng đối chứng nội (Internal Control) áp dụng vào xét nghiệm cùng mẫu thử. Xuất phát từ tình hình thực tế trên dé tài “Xây dung quy trình phát hiện Candidatus Liberibacter asiaticus và Citrus Tristeza Virus (CTV) bằng kỹ thuật Multiplex PCR” được thực hiện 1.
Mục tiêu đề tài Xây dựng quy trình phát hiện Candidatus Liberibacter asiaticus va Citrus Tristeza Virus (CTV) bằng kỹ thuật Multiplex PCR nhằm chan đoán chính xác và hiệu quả nguồn bệnh trong quá trình phòng trừ bệnh hại do virus và vi khuẩn gây ra. Nội dung thực hiện Nội dung 1: Xây dựng quy trình phát hiện đồng thời Candidatus Liberibacter asiaticus và Citrus Tristeza Virus (CTV) bằng kỹ thuật Multiplex PCR. Nội dung 2: Ung dụng quy trình phát hiện đồng thời Candidatus Liberibacter asiaticus và Citrus Tristeza Virus (CTV) bằng kỹ thuật Multiplex PCR trên các mẫu thu thập từ thực dia. TONG QUAN TÀI LIEU 2.
Sơ lược về cây cam 2. Phân loại khoa học Theo Trần Thượng Tuấn (1994), cây có múi thuộc: Giới (Regnum): Plantae Lớp (Class): Angiospermae Bộ (Ordo): Sapindales Ho (Familia): Rutaceae Chi (Genus): Citrus Loai (Species): Citrus sinensis Cây cam thuộc họ Rutaceae và có khoảng 150 chi va 1600 loài được trồng ở vùng nhiệt đới và bán nhiệt đới. Họ Rutaceae được chia ra thành bay họ phụ gồm 93 chi (Enger, 1931), trong đó có 6 giống quan trọng là: Citrus, Poncirus, Fortunella, Eremocitrus, Microcitrus và Clymenia. Đặc điềm chung của 6 giỗng này là cho trái có múi với cuốn thon nhỏ mộng nước.
Số nhị đực nhiều bằng hay hơn 4 lần số cánh hoa, đây cũng là đặc điểm xác định các giống trồng, các giống hoang thường có số nhị đực ít hơn hay chỉ gấp đôi số cánh hoa và múi không phát triển. Ngoại trừ giống Poncitrus có lá rụng theo mùa, có giống còn lại đều có lá xanh quanh năm. Hai trong 6 giống này có khả năng chịu lạnh tốt, đó là Poncinus (rụng lá hằng năm, lá có 3 lá chét) và Fortunella, hai giống này có thé lai với giống Citrus và các giống khác. Giống Eremocitrus và Microcitrus được tìm thay ở dạng hoang dai, hầu hết là ở Uc và Eremocitrus là giống chịu hạn tốt nhất.
Nguồn gốc và phân bố Theo Trần Thượng Tuấn (1994), nguồn gốc của cây cam phát sinh từ vùng Đông Nam Á, trong đó sự phát triển của một số loài cam được kéo đài từ biên giới Đông Bắc của Ấn Độ qua Miến Điện và một số vùng phía nam của đảo Hải Nam. Cam được phát triển trong thế kỷ thứ 10 ở phía đông Địa Trung Hải và muộn hơn ở Châu Phi và phía nam Châu Au. Hiện nay cam được trồng khắp nơi trên thới giới trong vùng khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới. Những vùng trồng phân bố từ 35° Nam va Bắc, những vùng thương mại chính là cận nhiệt đới tại vĩ độ 209 Nam hay Bắc của xích đạo.
có khoảng 49 nước sản xuất cam có diện tích trồng khoảng 2,8 triệu ha. Đặt điểm sinh học và thực vật 2. Rễ Theo Trần Thượng Tuấn (1994), trong năm hoạt động của rễ có các thời kỳ nhất định như: Trước lúc mọc cành mùa xuân. Sau khi rụng trái đợt đầu đến trước lúc mọc cành mùa hè.