Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ hóa học của nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Minh Diệp, chuyên ngành Hóa học (mã số: 9440112), được thực hiện tại Trường Đại học Bách khoa Hà Nội dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Nguyễn Xuân Trường và GS. Trần Tứ Hiếu, hoàn thành vào năm 2022 với đề tài: "Nghiên cứu phân tích một số kháng sinh thuộc nhóm fluoroquinolon trong mẫu huyết tương và nước tiểu".

Về tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu, nhóm kháng sinh fluoroquinolon (FQL) là các hợp chất kháng khuẩn tổng hợp phổ rộng, có hiệu lực diệt khuẩn cao đối với các nhiễm trùng đường tiết niệu, tiêu hóa, hô hấp, sinh dục, da và mô mềm. Cơ chế tác dụng chính là ức chế enzym ADN gyrase dẫn đến ức chế tổng hợp ADN của vi khuẩn, đồng thời tác động lên mARN làm cản trở quá trình tổng hợp protein. Do tác động vào acid nucleic, nhóm thuốc có nguy cơ gây đột biến gen và sẩy thai. Trong thực hành lâm sàng, việc áp dụng liều chuẩn cố định có thể gây ra hiện tượng phơi nhiễm thuốc quá mức dẫn đến độc tính, hoặc ngược lại, không đạt nồng độ điều trị tối thiểu tại ổ nhiễm khuẩn do sự dao động lớn về dược động học giữa các cá thể. Điều này dẫn tới nguy cơ thất bại trong điều trị hoặc gia tăng đề kháng kháng sinh.

Đối với việc phân tích dịch sinh học (huyết tương, nước tiểu), khó khăn lớn nhất là nền mẫu phức tạp chứa nhiều protein, lipid và hợp chất nội sinh gây nhiễu, trong khi nồng độ kháng sinh thường rất thấp. Tại thời điểm nghiên cứu, moxifloxacin (thế hệ thứ tư) là kháng sinh mới chưa có chuyên luận kiểm nghiệm trong Dược điển Việt Nam, đồng thời chưa có công trình nào trong nước công bố quy trình định lượng hoạt chất này trong huyết tương người. Bên cạnh đó, các phương pháp hiện hành thường chỉ định lượng đơn lẻ từng chất, trong khi thực tế điều trị tại các bệnh viện có nhu cầu phân tích đồng thời nhiều hoạt chất FQL trên cùng một hệ thống thiết bị sẵn có nhằm tối ưu hóa thời gian và chi phí.

Mục tiêu nghiên cứu tổng quát của đề tài là nghiên cứu cơ bản nhằm phát triển phương pháp phân tích định lượng thuốc kháng sinh fluoroquinolon trong nền mẫu dịch sinh học (huyết tương và nước tiểu) bằng hai phương pháp: phương pháp quang phổ huỳnh quang (FLS) và phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối với hai loại detector (HPLC-PDA và HPLC-FLD).

Luận án đặt ra ba kết quả dự kiến đạt được, được đánh số cụ thể như sau:

  1. Quy trình xác định hàm lượng moxifloxacin trong huyết tương bằng phương pháp HPLC-PDA.
  2. Quy trình xác định hàm lượng moxifloxacin trong huyết tương bằng phương pháp FLS.
  3. Quy trình xác định đồng thời bốn fluoroquinolon (norfloxacin, ciprofloxacin, levofloxacin, moxifloxacin) trong nước tiểu và huyết tương bằng phương pháp HPLC-FLD.

Nội dung nghiên cứu chi tiết bao gồm sáu nhiệm vụ:

  • Nghiên cứu khảo sát điều kiện phân tích xác định kháng sinh moxifloxacin trên hai hệ thống: HPLC-PDA và FLS.
  • Nghiên cứu khảo sát quy trình xử lý mẫu huyết tương, các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi moxifloxacin, lựa chọn điều kiện tối ưu khi xác định moxifloxacin bằng HPLC-PDA.
  • Nghiên cứu khảo sát điều kiện phân tích xác định đồng thời bốn FQL trên hệ thống HPLC-FLD.
  • Nghiên cứu khảo sát các quy trình xử lý mẫu huyết tương và nước tiểu, các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi đồng thời bốn FQL, lựa chọn điều kiện tối ưu khi xác định đồng thời bốn FQL bằng HPLC-FLD.
  • Đánh giá độ tin cậy của các phương pháp phân tích đã xây dựng (độ đặc hiệu, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, khoảng nồng độ tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại).
  • Áp dụng thử nghiệm quy trình xác định hàm lượng kháng sinh moxifloxacin trong nền mẫu thử huyết tương bằng HPLC-PDA và FLS.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Bốn kháng sinh nhóm fluoroquinolon thuộc thế hệ 2, 3 và 4 gồm norfloxacin (NOR), ciprofloxacin (CIP), levofloxacin (LEVO) và moxifloxacin (MOXI).
  • Nền mẫu phân tích: Huyết tương và nước tiểu người. Mẫu trắng được thu thập từ người khỏe mạnh không mắc bệnh suy thận và không sử dụng kháng sinh. Mẫu bệnh phẩm thực tế thu thập từ bệnh nhân sau 1, 2 và 3 giờ sử dụng thuốc tiêm truyền Avelox (chứa MOXI) tại Bệnh viện Bạch Mai và Bệnh viện Quân y 108 (Hà Nội).
  • Địa điểm thực nghiệm: Bộ môn Hóa phân tích - Viện Kỹ thuật Hóa học (Trường Đại học Bách khoa Hà Nội), Khoa Hóa học (Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội) và Trung tâm Nghiên cứu và Chuyển giao Công nghệ Dược (Trường Cao đẳng Y Dược Phú Thọ).

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án điểm lại lịch sử phát triển của nhóm quinolon từ hợp chất đầu tiên là acid nalidixic (tổng hợp năm 1962, công bố hoạt tính kháng khuẩn Gram âm năm 1964), tiếp theo là các dẫn xuất fluoroquinolon thế hệ sau như norfloxacin (1978), pefloxacin (1979), ofloxacin (1982), levofloxacin và moxifloxacin.

Về các phương pháp chuẩn hóa trong Dược điển: Dược điển Việt Nam V quy định định lượng levofloxacin bằng HPLC-UV ở bước sóng 360 nm (pha động methanol : dung dịch hỗn hợp amoni acetat, đồng sulfat và L-isoleucin tỷ lệ 3:7), ciprofloxacin bằng HPLC-UV ở bước sóng 278 nm (pha động acetonitril : acid phosphoric 0,245% chỉnh pH 3 bằng triethylamin tỷ lệ 13:87) và norfloxacin bằng chuẩn độ điện thế với acid perchloric 0,1 N trong acid acetic băng. Dược điển Mỹ USP 43 hướng dẫn định lượng moxifloxacin trong chế phẩm thuốc bằng HPLC-UV tại bước sóng 293 nm trên cột L11 với pha động gồm methanol và hệ đệm chứa tetrabutylammonium hydrogen sulfat kết hợp kali phosphat (28:72 v/v). Các phương pháp này được thiết kế cho dạng bào chế tinh khiết, chưa đáp ứng trực tiếp yêu cầu phân tích nền dịch sinh học.

Về phương pháp điện hóa: Luận án phân tích các nghiên cứu định lượng FQL dựa trên hoạt tính điện hóa của cầu proton tại nguyên tử nitơ (thế pic khử khoảng 1,4-1,5 V). Tác giả dẫn chứng nghiên cứu cực phổ xung vi phân và von-ampe hòa tan hấp phụ của norfloxacin trên điện cực giọt thủy ngân treo (HMDE), von-ampe vòng và sóng vuông của norfloxacin trên điện cực than thủy tinh (glassy carbon) cho khoảng tuyến tính 5-50 µg/mL với LOD 1,1 µg/mL. Silvina Kergaravat và cộng sự phát triển phương pháp von-ampe màng bismuth (BiFE) xác định moxifloxacin và ciprofloxacin với LOD đạt 0,5 ng/L. Jaber và cộng sự sử dụng von-ampe catot hòa tan hấp phụ xác định enrofloxacin qua phức đồng (II). Yongnian Ni và cộng sự xác định đồng thời ofloxacin, norfloxacin và ciprofloxacin trong thức ăn gia súc trên điện cực thủy ngân trong đệm Britton-Robinson pH 3,78. Radi và cộng sự định lượng levofloxacin trong nước tiểu người bằng von-ampe hòa tan hấp phụ anot trên điện cực glassy carbon tại thế oxy hóa 0,4 V (so với Ag/AgCl), đạt khoảng tuyến tính $6 \times 10^{-6}\text{ M}$ đến $5 \times 10^{-7}\text{ M}$ và LOD là $5 \times 10^{-9}\text{ M}$.

Về phương pháp điện di mao quản: Các công trình được khảo sát gồm nghiên cứu tách đồng thời ciprofloxacin, gatifloxacin, levofloxacin, moxifloxacin và sparfloxacin ở bước sóng 282 nm với LOD từ 1,02 đến 2,48 mg/mL. Yu và cộng sự tách đồng phân đối quang ofloxacin bằng heptakis(2,6-O-dimethyl)-$\beta$-CD (DM-$\beta$-CD) 40 mM ở pH 2,5. Zhou và cộng sự phân tích lomefloxacin, gatifloxacin, pazufloxacin và ofloxacin bằng đệm phosphat 70 mM kết hợp 40 mM HP-$\beta$-CD. Cho và cộng sự tách gemifloxacin sử dụng acid (+)-(18-crown-6)-tetracarboxylic kết hợp EDTA để triệt tiêu ảnh hưởng của cation natri. Horimai và cộng sự tách đồng phân đối quang của DU-6859 bằng phức $\gamma$-CD-D-Phe-Zn(II) tại pH 6,5.

Về phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS): Trần Thanh Trúc và cộng sự phân tích 8 quinolon trong thực phẩm thủy sản và gia súc bằng chiết lỏng - lỏng và microQTOF với LOD từ 0,1 đến 1,3 ng/g. Cao Công Khánh và cộng sự phát triển quy trình LC-MS/MS chế độ MRM trên cột Xbridge và Symmetry xác định đồng thời 14 quinolon trong thức ăn chăn nuôi xử lý bằng kỹ thuật QuEChERS. Tại Brazil, nghiên cứu của EURL xác định 8 quinolon và 7 macrolid trong thức ăn trẻ em bằng QuEChERS kết hợp LC-MS/MS theo Quyết định 2002/657/EC.

Về phương pháp HPLC và xử lý mẫu dịch sinh học: Bảng tổng hợp các kỹ thuật tiền xử lý mẫu của luận án ghi nhận hiệu suất thu hồi của chiết pha rắn (SPE) đối với ciprofloxacin trong nước tiểu đạt 92,3-97%, trong huyết tương đạt 91,2%; chiết lỏng - lỏng (LLE) đối với fleroxacin trong huyết tương đạt 99,1-100,9%; kết tủa protein (PP) bằng acetonitril đối với ofloxacin đạt 95,0%; kết tủa protein bằng acid perchloric 7% đối với moxifloxacin đạt 97-106%. Các nghiên cứu sắc ký pha đảo (RP-HPLC) của Nguyen và cộng sự đã đánh giá ảnh hưởng của các chất tạo cặp ion gồm tetrabutylammonium bromid (TBAB), tetramethylammonium bromid (TMAB) và hexadecyl-trimethylammonium clorid (HDTACl), qua đó chỉ ra 2 mM TBAB ở pH 2,5 giúp tối ưu hóa phân tách levofloxacin, gatifloxacin và moxifloxacin. Liang và cộng sự cùng Nemutlu nghiên cứu việc bổ sung natri dodecyl sulfat (SDS) từ 5 đến 20 mM và tetrabutylammonium acetat (TBAA) 10 mM nhằm khắc phục hiện tượng kéo đuôi pic do tương tác của amin với nhóm silanol tự do trên pha tĩnh silica. Kim và cộng sự chứng minh việc thêm $N,N$-dimethyloctylamin (DMOA) 30-40 mM vào pha động giúp phong bế vị trí silanol, làm gọn pic chất phân tích. Chamseddin và cộng sự ghi nhận cột pha đảo hạt 2,4 µm (BDS Hypersil C18) mang lại hiệu quả tách vượt trội so với hạt 3 µm và 5 µm.

Về phương pháp quang phổ huỳnh quang: Li Ming Du và cộng sự định lượng 4-FQL thông qua phản ứng chuyển dịch điện tử tạo phức với acid chloranilic (CL) trong dung môi aceton với tỷ lệ mol 1:1, làm tăng cường độ huỳnh quang từ 4 đến 14 lần. Tác giả này tiếp tục công bố phản ứng tạo phức huỳnh quang giữa FQL với 7,7,8,8-tetracyanoquinodimethan (TCNQ) làm tăng huỳnh quang 15-90 lần. Phức chelate giữa ion đất hiếm europi $\text{Eu}^{3+}$ ($1,7 \times 10^{-5}\text{ M}$) với moxifloxacin kết hợp chất hoạt động bề mặt tạo micell natri dodecyl benzen sulfonat (SDBS) ở pH 5,5 phát xạ huỳnh quang tại cặp bước sóng 373/614 nm đạt LOD $2,8 \times 10^{-3}\text{ ng/mL}$.

Từ bức tranh tổng quan, luận án xác định khoảng trống nghiên cứu cần giải quyết: Phát triển các quy trình phân tích moxifloxacin đơn lẻ và phân tích đồng thời bốn kháng sinh FQL đại diện cho ba thế hệ (thế hệ 2: NOR, CIP; thế hệ 3: LEVO; thế hệ 4: MOXI) trong huyết tương và nước tiểu bằng HPLC-PDA, FLS và HPLC-FLD. Điểm cốt lõi là tối ưu hóa hệ tạo phức micell $\text{Eu}^{3+}$-MOXI-SDBS trong đo quang phổ huỳnh quang và thiết lập kỹ thuật HPLC-FLD chuyển kênh bước sóng huỳnh quang linh hoạt, phù hợp với năng lực kỹ thuật và trang thiết bị thực tế tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết của luận án dựa trên đặc tính cấu trúc phân tử, cân bằng acid-base và tính chất quang của nhóm fluoroquinolon. Khung phân tử cơ bản gồm nhân quinolin hoặc naphthyridin có gắn nhóm 4-oxo (carbonyl) và nhóm 3-carboxylic, cùng nguyên tử fluor tại vị trí C-6. Tại vị trí C-7, các phân tử mang nhóm thế piperazinyl (đối với NOR, CIP) hoặc nhóm methyl-piperazinyl (đối với LEVO) hoặc nhóm pyrrolo-pyridin (đối với MOXI). Các nhóm chức này chứa các tâm cho - nhận proton, tạo nên tính chất lưỡng tính (amphoteric).

Hằng số phân ly acid ($pK_{a1}$) của nhóm 3-carboxylic dao động từ 5,59 đến 6,34; trong khi hằng số phân ly base ($pK_{a2}$) của nitơ trên vòng dị vòng dao động từ 7,94 đến 9,29. Cụ thể:

  • Norfloxacin ($\text{C}{17}\text{H}{19}\text{FN}3\text{O}3$, phân tử lượng 319,3): $pK{a1} = 6,34$; $pK{a2} = 8,75$.
  • Ciprofloxacin ($\text{C}{17}\text{H}{18}\text{FN}3\text{O}3$, phân tử lượng 331,3): $pK{a1} = 5,76$; $pK{a2} = 8,68$.
  • Levofloxacin ($\text{C}{18}\text{H}{20}\text{FN}3\text{O}4$, phân tử lượng 361,4): $pK{a1} = 5,59$; $pK{a2} = 7,94$.
  • Moxifloxacin ($\text{C}{21}\text{H}{24}\text{FN}3\text{O}4$, phân tử lượng 401,4): $pK{a1} = 6,25$; $pK{a2} = 9,29$.

Trong dung dịch nước, tùy thuộc vào pH của môi trường mà FQL tồn tại ở bốn dạng cân bằng: Cation (môi trường acid mạnh, $\text{pH} < pK_{a1}$), phân tử trung hòa hoặc ion lưỡng cực zwitterion (chiếm ưu thế tại điểm đẳng điện giữa hai $pK_a$, kỵ nước nhất), và anion (môi trường kiềm, $\text{pH} > pK_{a2}$). Đặc tính này quyết định hệ số phân bố pha tĩnh - pha động trong sắc ký pha đảo và hiệu suất chiết xuất mẫu. Về quang học, hệ liên hợp $\pi$-$\pi^*$ trên nhân thơm quy định phổ hấp thụ tử ngoại cực đại ở vùng 260-300 nm và khả năng tự phát huỳnh quang. Dạng cation và ion lưỡng tính phát huỳnh quang mạnh hơn dạng anion. Khi tạo phức với ion lanthanid $\text{Eu}^{3+}$, moxifloxacin đóng vai trò chất hấp thụ năng lượng (ligand ăng-ten) và truyền năng lượng không bức xạ sang ion trung tâm $\text{Eu}^{3+}$, làm kích thích và phát xạ huỳnh quang hẹp đặc trưng của europi ở bước sóng 614 nm; sự hiện diện của chất hoạt động bề mặt SDBS tạo vi môi trường micell kỵ nước giúp giảm thiểu hiện tượng tắt huỳnh quang do va chạm với dung môi nước.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm:

  • Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao: RP-HPLC ghép nối detector chuỗi diod quang (HPLC-PDA) xác định MOXI và HPLC ghép nối detector huỳnh quang hai kênh (HPLC-FLD) xác định đồng thời bốn chất. Cột sắc ký sử dụng là pha đảo silica C18: MRC-ODS C18 ($250 \times 4,5\text{ mm}$, $5\ \mu\text{m}$), YMC-pack ODS-A ($150 \times 4,6\text{ mm}$, $5\ \mu\text{m}$) và SUPELCO-C18 ($250 \times 4,6\text{ mm}$, $5\ \mu\text{m}$).
  • Phương pháp quang phổ huỳnh quang phân tử: Đo cường độ phát xạ huỳnh quang của phức $\text{Eu}^{3+}$-MOXI-SDBS trên máy quang phổ huỳnh quang Nanolog (Horiba) trang bị đèn hồ quang Xenon 450 W và máy quang phổ Brolight 6102.
  • Phương pháp xử lý mẫu: Kết tủa protein huyết tương bằng dung môi phân cực methanol hoặc acid trichloroacetic (TCA) nồng độ 5-25%; xử lý nước tiểu bằng chiết lỏng - lỏng (LLE) và chiết pha rắn (SPE) trên cột pha đảo C18.
  • Phương pháp đánh giá độ tin cậy: Thẩm định theo hướng dẫn của Hội đồng quốc tế về hài hòa hóa (ICH) và AOAC với các chỉ tiêu: Độ chọn lọc (đặc hiệu), khoảng tuyến tính và phương trình hồi quy, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), giới hạn phát hiện phương pháp (MDL), giới hạn định lượng phương pháp (MQL), độ đúng (hiệu suất thu hồi) và độ lặp lại (độ lệch chuẩn tương đối RSD%).

Hóa chất, thiết bị và nguồn dữ liệu:

  • Chất chuẩn: Moxifloxacin hydroclorid (độ tinh khiết 97,0%, lô QT187041117), Levofloxacin (98,2%, lô QT165080417), Norfloxacin (99,54%, lô QT068050316), Ciprofloxacin hydroclorid (98,3%, lô QT012120318) do Viện Kiểm nghiệm thuốc Thành phố Hồ Chí Minh cung cấp. Dung dịch $\text{Eu}^{3+}\ 10^{-3}\text{ M}$ pha từ $\text{Eu}_2\text{O}_3$ (0,0088 g trong HCl 1:1 định mức 50 mL). Các dung môi ACN, MeOH, $\text{CHCl}_3$, $\text{CH}_2\text{Cl}_2$ và hóa chất $\text{KH}_2\text{PO}_4$, $\text{H}_3\text{PO}_4$, $\text{CH}_3\text{COONH}_4$, SDBS, TEA đạt độ tinh khiết phân tích hoặc sắc ký.
  • Thiết bị chính: Hệ thống HPLC Shimadzu 10Avp với PDA SPD-M10vp; HPLC Shimadzu Auto sampler SIL-20AC XR với detector huỳnh quang RF-20A, lò cột CTO-10AS; máy quang phổ UV-Vis Agilent 8453; cân phân tích Shimadzu AUW220D (sai số 0,00001 g) và Precisa X 220 A (sai số 0,0001 g); máy ly tâm Mrc, máy lắc vortex Velp ZX-Classic, máy rung siêu âm Branson, cô quay chân không Büchi.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan chung về nhóm fluoroquinolon và các phương pháp phân tích

Chương này hệ thống hóa toàn diện các dữ liệu khoa học về nhóm fluoroquinolon từ nguồn gốc lịch sử, phân loại theo phổ kháng khuẩn - chỉ định điều trị lâm sàng và cấu trúc hóa học (nhân naphthyridon và quinolon). Tác giả làm rõ các thông số dược động học của từng chất: MOXI có sinh khả dụng đường uống 90%, liên kết protein 30-50%, $C_{max}$ huyết tương từ 0,29 µg/mL (liều 50 mg) đến 4,73 µg/mL (liều 800 mg) đạt được sau 0,4-4 giờ, thải trừ qua thận 2,6 L/h; LEVO có sinh khả dụng đạt 99%, $C_{max}$ liều 500 mg đạt 6,2 µg/mL và liều 750 mg đạt 11,5 µg/mL sau 1-2 giờ; NOR hấp thu nhanh, nồng độ huyết tương từ 0,8 µg/mL (liều 200 mg) đến 2,4 µg/mL (liều 800 mg) sau 1-2 giờ, tốc độ thanh thải qua thận 275 mL/phút; CIP có sinh khả dụng 70-80%, $C_{max}$ từ 1,2 µg/mL (liều 250 mg) đến 5,4 µg/mL (liều 1000 mg).

Về mặt phổ học, chương tổng quan phân tích các chuyển dịch electron $\pi \rightarrow \pi^$ và $n \rightarrow \pi^$ của hệ vòng thơm, sự phụ thuộc của hệ số hấp thụ phân tử ($\varepsilon_{max} = 2,0-2,5 \times 10^4\text{ M}^{-1}\text{cm}^{-1}$) và bước sóng phát xạ vào tính phân cực của dung môi (nước, PBS, ACN) cũng như pH môi trường. Số liệu quang lý ghi nhận hiệu suất lượng tử huỳnh quang ($\Phi_f$) và thời gian sống huỳnh quang ($\tau_f$) của LEVO lần lượt là 0,35 và 6,2 ns trong đệm PBS, nhưng giảm mạnh xuống $5 \times 10^{-4}$ trong ACN; đối với MOXI là 0,21 và 3,2 ns trong PBS, đạt $4 \times 10^{-2}$ trong ACN.

Chương 1 cũng tổng kết các khó khăn thường gặp khi phân tích FQL bằng sắc ký pha đảo RP-HPLC: Phân tử dễ bị dãn rộng pic và kéo đuôi mạnh do tương tác tĩnh điện giữa nhóm amin của chất phân tích với gốc silanol còn tự do trên bề mặt hạt pha tĩnh silica. Tác giả tổng thuật các giải pháp xử lý đã công bố gồm điều chỉnh pH pha động về vùng acid (2,0-3,5) kết hợp bổ sung các chất đệm (phosphat, citrat), các tác nhân ion đối như SDS (5-20 mM) hoặc các amin hữu cơ (TEA, TMAB, TBAB, DMOA) để phong bế nhóm silanol. Đồng thời, chương so sánh chi tiết ưu nhược điểm của ba kỹ thuật chuẩn bị mẫu dịch sinh học (PP, LLE, SPE) và các detector quang học (UV-Vis, PDA, FLD, MS), làm tiền đề cho việc thiết kế các phương pháp thực nghiệm trong Chương 2 và Chương 3.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 trình bày chi tiết về nguồn gốc mẫu, hóa chất, thông số các thiết bị phân tích và quy trình khảo sát tối ưu hóa các điều kiện thực nghiệm bằng phương pháp đơn biến. Mẫu máu toàn phần được chống đông bằng EDTA, ly tâm loại bỏ huyết khối để thu nhận huyết tương, bảo quản ở -20°C và rã đông ở nhiệt độ phòng trước khi xử lý. Mẫu thử tự tạo (spiked samples) được điều chế bằng cách thêm dung dịch chuẩn FQL vào mẫu trắng huyết tương hoặc nước tiểu, làm bay hơi dung môi dưới dòng khí nitơ hoặc cô quay chân không, sau đó hòa tan lại trong dịch sinh học và rung siêu âm 2 phút.

Quy trình khảo sát tối ưu hóa bao gồm các nội dung thực nghiệm:

  • Đối với phương pháp HPLC-PDA xác định MOXI: Khảo sát bước sóng hấp thụ trên dải 190-800 nm (chọn cố định 295 nm tại nồng độ chuẩn 10 µg/mL); khảo sát bốn hệ pha động (ACN : đệm phosphat 20 mM pH 3,5 tỷ lệ 60:40; MeOH : đệm phosphat 20 mM pH 3,5 tỷ lệ 60:40; MeOH : HCOOH tỷ lệ 80:20; ACN : HCOOH tỷ lệ 70:30); khảo sát pH dung dịch đệm phosphat (2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0); khảo sát nồng độ đệm phosphat (10, 20, 50 mM); khảo sát tốc độ dòng pha động (0,6; 0,8; 1,0; 1,2; 1,5 mL/phút). Về xử lý mẫu huyết tương, tác giả tiến hành khảo sát tác nhân kết tủa TCA với sáu tỷ lệ thể tích TCA/huyết tương (1:4, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1 v/v), năm nồng độ TCA (5%, 10%, 15%, 20%, 25%), thời gian lắc xoáy vortex (30, 60, 90, 120, 180 giây), tốc độ ly tâm (1000-5000 vòng/phút) và thời gian ly tâm (5-25 phút).
  • Đối với phương pháp quang phổ huỳnh quang (FLS) xác định MOXI: Khảo sát sự tạo phức huỳnh quang giữa MOXI với $\text{Eu}^{3+}$ ($1,0 \times 10^{-3}\text{ M}$) trong sự có mặt của SDBS ($7,0 \times 10^{-3}\text{ M}$) thông qua dãy bình định mức 5 mL; khảo sát thời gian ổn định của phức theo các khoảng cách 5 phút một lần; khảo sát ảnh hưởng của pH dung dịch đệm Tris-HCl ở các giá trị 8,0; 8,5; 9,0; 9,3; 9,5; 10,0; khảo sát thể tích dung dịch $\text{Eu}^{3+}$ thêm vào và nồng độ chất tạo micell SDBS.
  • Đối với phương pháp HPLC-FLD xác định đồng thời bốn FQL: Khảo sát thành phần pha động MeOH kết hợp dung dịch acid $\text{H}3\text{PO}4$ 0,025 M theo chương trình rửa giải gradient nồng độ; khảo sát pH pha động, nhiệt độ lò cột và tốc độ dòng; khảo sát lựa chọn các bước sóng kích thích ($\lambda{ex}$ từ 270 đến 300 nm) và bước sóng phát xạ ($\lambda{em}$ từ 430 đến 515 nm) cho từng cặp chất; so sánh hiệu suất thu hồi khi kết tủa protein huyết tương bằng MeOH và TCA 20%; khảo sát các điều kiện chiết lỏng - lỏng (loại dung môi, tỷ lệ thể tích, thời gian lắc) và chiết pha rắn (loại cột C18) đối với mẫu nước tiểu.

Chương 3: Kết quả và bàn luận

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được, các điều kiện phân tích tối ưu và số liệu thẩm định phương pháp được tổng hợp qua hệ thống bảng biểu và sắc ký đồ:

  1. Quy trình phân tích MOXI trong huyết tương bằng HPLC-PDA:
  • Điều kiện phân tích tối ưu: Cột MRC-ODS C18 ($250 \times 4,5\text{ mm}$, $5\ \mu\text{m}$); pha động ACN : đệm phosphat 20 mM pH 3,5 (60:40 v/v); tốc độ dòng 1,0 mL/phút; nhiệt độ lò cột 30°C; detector PDA đo ở bước sóng 295 nm. Quy trình xử lý mẫu tối ưu: Tỷ lệ thể tích dung dịch TCA 20%/huyết tương là 1:1 (v/v), lắc xoáy vortex trong 90 giây, ly tâm ở tốc độ 4000 vòng/phút trong thời gian 15 phút.
  • Kết quả thẩm định: Phương pháp đạt độ đặc hiệu cao, pic MOXI tách biệt hoàn toàn khỏi nhiễu nền dịch sinh học tại thời gian lưu xác định. Phương trình đường chuẩn đạt độ tương quan tuyến tính tốt ($R^2 > 0,999$). Thử nghiệm trên mẫu bệnh phẩm người bệnh sử dụng thuốc tiêm truyền Avelox tại Bệnh viện Bạch Mai và Bệnh viện Quân y 108 cho kết quả định lượng rõ ràng, không bị ảnh hưởng bởi các chất chuyển hóa nội sinh.
  1. Quy trình định lượng MOXI trong huyết tương bằng quang phổ huỳnh quang (FLS):
  • Điều kiện tối ưu: Phức chelate phát huỳnh quang mạnh nhất và ổn định tại pH 9,3 (đệm Tris-HCl); nồng độ chất chuẩn MOXI tỷ lệ tuyến tính với cường độ phát xạ huỳnh quang tại bước sóng phát xạ $\lambda_{em} = 614\text{ nm}$ khi kích thích ở $\lambda_{ex} = 405\text{ nm}$ (hoặc 373 nm); nồng độ tối ưu của $\text{Eu}^{3+}$ và SDBS đảm bảo phức huỳnh quang đạt tín hiệu cực đại sau thời gian phản ứng xác định.
  • Kết quả thẩm định: Độ thu hồi và độ lặp lại đáp ứng tiêu chuẩn phân tích vi lượng; phương pháp được áp dụng thành công trên mẫu huyết tương thực tế của bệnh nhân dùng thuốc Avelox, cho kết quả tương đồng với phương pháp sắc ký HPLC-PDA.
  1. Quy trình định lượng đồng thời bốn FQL trong huyết tương và nước tiểu bằng HPLC-FLD:
  • Điều kiện sắc ký tối ưu: Sử dụng cột pha đảo C18 (YMC-pack ODS-A hoặc SUPELCO-C18); pha động gồm MeOH và dung dịch đệm acid $\text{H}3\text{PO}4$ 0,025 M vận hành theo chương trình gradient nồng độ MeOH. Thiết lập chương trình chuyển bước sóng detector huỳnh quang hai kênh theo thời gian lưu: Đo LEVO và MOXI ở cặp bước sóng $\lambda{ex}/\lambda{em} = 290/500\text{ nm}$, đo NOR và CIP ở cặp bước sóng $\lambda_{ex}/\lambda_{em} = 280/445\text{ nm}$. Kỹ thuật này giúp tín hiệu phân tích của cả bốn chất đạt cực đại và triệt tiêu đáng kể nhiễu nền sinh học.
  • Xử lý mẫu huyết tương: So sánh thực nghiệm cho thấy kết tủa protein bằng TCA 20% và bằng MeOH đều mang lại hiệu suất thu hồi cao, trong đó TCA 20% cho nền dịch nổi trong và đường nền sắc ký ổn định.
  • Xử lý mẫu nước tiểu: Khảo sát các thông số chiết lỏng - lỏng (thể tích dung môi chiết, tỷ lệ dung môi, thời gian lắc chiết) và chiết pha rắn trên cột SPE C18. Cả hai phương pháp tiền xử lý đều cho hiệu suất thu hồi tốt, làm sạch tạp chất nội sinh và bảo vệ cột sắc ký.
  • Thẩm định phương pháp: Bốn chất phân tích đạt độ tuyến tính cao trong khoảng nồng độ khảo sát; giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), giới hạn phát hiện phương pháp (MDL) và giới hạn định lượng phương pháp (MQL) đều đạt mức vết (ppb đến ppm). Độ đúng và độ lặp lại được kiểm tra tại các mức nồng độ 1,0 µg/mL; 5,0 µg/mL và 10,0 µg/mL với số lần lặp $n = 6$, hệ số biến thiên RSD đều nằm trong giới hạn cho phép theo hướng dẫn của ICH.

Bảng tổng hợp các thông số kỹ thuật tối ưu và kết quả thẩm định phương pháp phân tích trong luận án:

Thông số / Kỹ thuật HPLC-PDA (MOXI trong huyết tương) FLS (MOXI trong huyết tương) HPLC-FLD (4 FQL trong huyết tương và nước tiểu)
Pha tĩnh / Cột tách MRC-ODS C18 ($250 \times 4,5\text{ mm}$, $5\ \mu\text{m}$) Cuvet huỳnh quang $1,0\text{ cm}$ YMC-pack ODS-A / SUPELCO C18 ($5\ \mu\text{m}$)
Pha động / Môi trường phản ứng ACN : đệm phosphat 20 mM pH 3,5 (60:40 v/v) Đệm Tris-HCl pH 9,3; $\text{Eu}^{3+}$; micell SDBS MeOH - dung dịch $\text{H}_3\text{PO}_4$ 0,025 M (gradient)
Thông số phát hiện Bước sóng tử ngoại PDA 295 nm Cặp bước sóng $\lambda_{ex}/\lambda_{em} = 405/614\text{ nm}$ Chuyển kênh: 290/500 nm (LEVO, MOXI) và 280/445 nm (NOR, CIP)
Tốc độ dòng / Nhiệt độ $1,0\text{ mL/phút}$; $30^\circ\text{C}$ Nhiệt độ phòng Tối ưu theo gradient; kiểm soát nhiệt độ lò cột
Phương pháp tiền xử lý mẫu Kết tủa protein bằng TCA 20% (tỷ lệ 1:1 v/v) Kết tủa protein loại tạp kết hợp tạo phức Huyết tương: TCA 20% hoặc MeOH; Nước tiểu: LLE hoặc SPE
Độ tin cậy phương pháp Tuyến tính $R^2 > 0,999$; lặp lại tốt ($n=5$) Tuyến tính cao, tín hiệu huỳnh quang ổn định Đánh giá tại 1,0; 5,0; 10,0 µg/mL ($n=6$, RSD đạt chuẩn ICH)
Đối tượng áp dụng thực tế Huyết tương bệnh nhân dùng thuốc Avelox Huyết tương bệnh nhân dùng thuốc Avelox Mẫu tự tạo và mẫu dịch sinh học người

Kết quả và những đóng góp mới

Về ý nghĩa khoa học:

  • Luận án đã xây dựng quy trình định lượng moxifloxacin trong huyết tương người bằng hai kỹ thuật độc lập là HPLC-PDA và quang phổ huỳnh quang (FLS). Đây là các quy trình phân tích đầu tiên đối với moxifloxacin trong dịch sinh học được nghiên cứu và công bố tại Việt Nam.
  • Trong phương pháp quang phổ huỳnh quang, việc ứng dụng phản ứng tạo phức chelate giữa moxifloxacin và ion đất hiếm $\text{Eu}^{3+}$ có bổ sung chất hoạt động bề mặt natri dodecyl benzen sulfonat (SDBS) tạo hệ micell $\text{Eu}^{3+}$-MOXI-SDBS là đóng góp khoa học mới trong nước. Hiệu ứng micell hóa giúp gia tăng đáng kể cường độ phát xạ huỳnh quang tại bước sóng 614 nm, nâng cao độ nhạy và hạ thấp giới hạn phát hiện của phương pháp.
  • Phát triển kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối detector huỳnh quang (HPLC-FLD) hai kênh bước sóng. Việc lập trình chuyển đổi hai cặp bước sóng kích thích/phát xạ tối ưu ($\lambda_{ex}/\lambda_{em} = 290/500\text{ nm}$ cho LEVO/MOXI và $280/445\text{ nm}$ cho NOR/CIP) theo thời gian lưu của từng nhóm chất đã tận dụng tối đa độ nhạy và độ chọn lọc cao của detector huỳnh quang, cho phép tách và định lượng đồng thời bốn kháng sinh FQL thuộc ba thế hệ khác nhau trong cùng một lần chạy sắc ký.

Về ý nghĩa thực tiễn:

  • Luận án đã chuẩn hóa các quy trình phân tích đơn kháng sinh (moxifloxacin) và đa kháng sinh (đồng thời norfloxacin, ciprofloxacin, levofloxacin, moxifloxacin) trong mẫu huyết tương và nước tiểu. Các quy trình này cho phép áp dụng trên cùng một hệ thống thiết bị và một quy trình xử lý mẫu thống nhất, giúp rút ngắn thời gian phân tích, tiết kiệm hóa chất và dung môi khi kiểm tra đồng thời nhiều bệnh nhân đang điều trị bằng các phác đồ kháng sinh khác nhau.
  • Các điều kiện thực nghiệm được xây dựng trên cơ sở hóa chất, dung môi và thiết bị sắc ký, quang phổ phổ biến trong các phòng thí nghiệm, phòng kiểm nghiệm và cơ sở y tế tại Việt Nam, đảm bảo tính khả thi cao trong triển khai thực tế.
  • Kết quả của luận án cung cấp công cụ phân tích tin cậy phục vụ công tác giám sát nồng độ thuốc trong điều trị (TDM), hỗ trợ bác sĩ lâm sàng điều chỉnh chế độ liều cá thể hóa cho bệnh nhân nhiễm khuẩn nặng, đồng thời phục vụ các nghiên cứu đánh giá tương đương sinh học và dược động học của thuốc chứa FQL.

Kiến nghị và đề xuất của tác giả:

  • Tiếp tục mở rộng nghiên cứu ứng dụng quy trình phân tích đồng thời bốn FQL trong các nghiên cứu dược động học lâm sàng và giám sát nồng độ thuốc điều trị tại các cơ sở khám chữa bệnh.
  • Đề xuất bổ sung quy trình phân tích moxifloxacin vào hệ thống tiêu chuẩn kiểm nghiệm của Dược điển Việt Nam cho các dạng bào chế và dịch sinh học.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Về mặt hạn chế:

  • Luận án mới chỉ dừng lại ở việc áp dụng thử nghiệm quy trình định lượng moxifloxacin trên một số lượng hạn chế mẫu huyết tương thu thập từ bệnh nhân điều trị thực tế bằng thuốc tiêm truyền Avelox tại Bệnh viện Bạch Mai và Bệnh viện Quân y 108; chưa triển khai khảo sát trên cỡ mẫu bệnh nhân lớn ở quy mô dịch tễ hoặc thử nghiệm lâm sàng đa trung tâm.
  • Đối với ba kháng sinh còn lại (norfloxacin, ciprofloxacin, levofloxacin), quy trình định lượng đồng thời bằng HPLC-FLD chủ yếu được thẩm định trên các mẫu sinh học tự tạo (spiked samples) trong phòng thí nghiệm, chưa thực hiện thu thập và phân tích trên các chuỗi mẫu bệnh phẩm lâm sàng thực tế theo thời gian sau khi dùng thuốc.
  • Kỹ thuật xử lý mẫu nước tiểu bằng chiết pha rắn (SPE) và chiết lỏng - lỏng (LLE) tuy đạt hiệu suất thu hồi cao nhưng đòi hỏi các bước làm bay hơi dung môi và hòa tan lại cặn, tốn nhiều thời gian hơn so với kỹ thuật kết tủa protein trực tiếp.

Hướng nghiên cứu tiếp theo:

  • Mở rộng ứng dụng phương pháp HPLC-FLD và FLS trên cỡ mẫu lâm sàng lớn hơn đối với cả bốn kháng sinh FQL để xây dựng đường cong dược động học đầy đủ ($C_{max}$, $T_{max}$, $AUC$, thời gian bán thải $t_{1/2}$) trên bệnh nhân Việt Nam.
  • Khảo sát mở rộng quy trình phân tích trên các loại dịch sinh học phức tạp khác như dịch não tủy, dịch phế quản, dịch mật hoặc nước bọt nhằm phục vụ đánh giá nồng độ thuốc tại các ổ nhiễm trùng chuyên biệt.
  • Nghiên cứu phát triển phương pháp phân tích đồng thời các kháng sinh FQL cùng với các chất chuyển hóa chính của chúng trong cơ thể nhằm cung cấp dữ liệu toàn diện hơn cho công tác nghiên cứu độc tính và tương tác thuốc.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên khảo hữu ích cho nhiều nhóm đối tượng:

  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên chuyên ngành Hóa phân tích, Hóa dược và Kiểm nghiệm thuốc: Cung cấp tài liệu tham khảo chi tiết về phương pháp luận tối ưu hóa điều kiện sắc ký pha đảo cho các hợp chất lưỡng tính; kỹ thuật tạo phức micell làm tăng cường độ quang phổ huỳnh quang; và quy trình thẩm định phương pháp phân tích dịch sinh học theo các tiêu chuẩn quốc tế ICH, AOAC.
  • Giảng viên và cán bộ nghiên cứu tại các trường đại học, viện nghiên cứu chuyên ngành Hóa học và Dược học: Sử dụng làm tài liệu giảng dạy chuyên đề phân tích công cụ sắc ký - quang phổ nâng cao và cơ sở hóa lý của các quá trình phân tách dược chất.
  • Cán bộ kiểm nghiệm và chuyên viên phân tích tại các viện kiểm nghiệm thuốc, trung tâm kiểm nghiệm dược phẩm - mỹ phẩm: Tham khảo các điều kiện sắc ký HPLC-PDA, HPLC-FLD và quy trình xử lý nền mẫu sinh học thực tế để xây dựng tiêu chuẩn cơ sở hoặc tiêu chuẩn kiểm nghiệm thuốc.
  • Bác sĩ lâm sàng, dược sĩ lâm sàng và chuyên gia dược động học tại các bệnh viện: Tham khảo số liệu về nồng độ thuốc, phương pháp theo dõi điều trị (TDM) nhằm đánh giá mức độ phơi nhiễm thuốc trên từng cá thể, từ đó tối ưu hóa phác đồ sử dụng kháng sinh FQL trong điều trị nhiễm trùng nặng.

Phần có giá trị tham khảo chuyên môn cao nhất trong văn bản là Chương 2 và Chương 3, đặc biệt là các thông số thực nghiệm khảo sát gradient pha động, kỹ thuật chuyển kênh bước sóng huỳnh quang hai kênh và quy trình kết tủa protein bằng TCA 20% loại bỏ tạp chất hiệu quả cho dịch sinh học.

Câu hỏi thường gặp

1. Vai trò của việc bổ sung chất hoạt động bề mặt SDBS trong phương pháp quang phổ huỳnh quang xác định moxifloxacin là gì? Trong phương pháp FLS, moxifloxacin tạo phức chelate với ion đất hiếm $\text{Eu}^{3+}$ tại pH 9,3 (đệm Tris-HCl). Chất hoạt động bề mặt natri dodecyl benzen sulfonat (SDBS) ở nồng độ thích hợp tạo ra môi trường micell kỵ nước bao bọc phức chất $\text{Eu}^{3+}$-MOXI. Cấu trúc micell này giúp bảo vệ trạng thái kích thích của phức, hạn chế các quá trình phân tán năng lượng không bức xạ do va chạm với các phân tử nước của dung môi, từ đó làm tăng đáng kể cường độ phát huỳnh quang đặc trưng của europi ở bước sóng 614 nm, nâng cao độ nhạy và hạ thấp giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp.

2. Tại sao luận án lại ứng dụng kỹ thuật HPLC-FLD chuyển kênh bước sóng thay vì cố định một bước sóng huỳnh quang duy nhất? Bốn kháng sinh FQL thuộc các thế hệ khác nhau có phổ kích thích và phát xạ huỳnh quang cực đại khác nhau: Cặp levofloxacin và moxifloxacin phát huỳnh quang mạnh nhất tại bước sóng kích thích/phát xạ $\lambda_{ex}/\lambda_{em} = 290/500\text{ nm}$, trong khi cặp norfloxacin và ciprofloxacin đạt tín hiệu tối ưu tại $\lambda_{ex}/\lambda_{em} = 280/445\text{ nm}$. Việc lập trình chuyển kênh bước sóng detector theo thời gian rửa giải tương ứng của từng cặp chất cho phép thu nhận tín hiệu diện tích pic cực đại cho cả bốn hoạt chất, đồng thời loại trừ tối đa các tín hiệu nhiễu nền từ thành phần sinh học của huyết tương và nước tiểu.

3. Tác nhân nào được lựa chọn tối ưu để xử lý mẫu huyết tương trong phương pháp HPLC-PDA và điều kiện thực hiện ra sao? Luận án lựa chọn tác nhân kết tủa protein là acid trichloroacetic (TCA) nồng độ 20%. Tỷ lệ thể tích tối ưu giữa dung dịch TCA 20% và mẫu huyết tương là 1:1 (v/v). Hỗn hợp sau khi thêm chất kết tủa được lắc xoáy vortex trong 90 giây để giải phóng hoàn toàn thuốc liên kết với protein, sau đó đem ly tâm ở tốc độ 4000 vòng/phút trong thời gian 15 phút để tách riêng phần kết tủa và phần dịch nổi trong suốt trước khi tiêm vào hệ thống sắc ký.

4. Vì sao việc kiểm soát pH pha động trong khoảng acid (pH 2,0 - 3,5) lại có tính chất quyết định khi tách sắc ký fluoroquinolon trên cột C18? Fluoroquinolon là các chất lưỡng tính có chứa đồng thời nhóm chức carboxylic ($pK_a \sim 5,5-6,3$) và nhóm amin ($pK_a \sim 7,9-9,3$). Ở vùng pH trung tính, thuốc tồn tại ở dạng lưỡng cực hoặc trung hòa, tương tác mạnh với pha tĩnh và dễ bị kéo đuôi nghiêm trọng do nhóm amin tự do tương tác tĩnh điện với các gốc silanol chưa bị alkyl hóa trên silica. Khi điều chỉnh pH pha động về vùng acid (2,0-3,5) bằng đệm phosphat hoặc acid phosphoric, nhóm carboxylic bị ức chế phân ly trong khi các gốc silanol của pha tĩnh được proton hóa hoàn toàn, làm giảm tương tác thứ cấp không mong muốn, từ đó giúp pic sắc ký trở nên đối xứng, tăng hiệu lực cột và độ phân giải giữa các chất.

5. Luận án đã áp dụng thử nghiệm quy trình phân tích trên những mẫu bệnh phẩm thực tế nào? Quy trình phân tích đơn kháng sinh moxifloxacin bằng HPLC-PDA và FLS đã được áp dụng thử nghiệm trên các mẫu huyết tương thực tế của bệnh nhân điều trị bằng thuốc tiêm truyền Avelox (chứa moxifloxacin). Các mẫu bệnh phẩm này được thu thập tại thời điểm 1, 2 và 3 giờ sau khi truyền thuốc tại Bệnh viện Bạch Mai và Bệnh viện Quân y 108. Kết quả sắc ký và đo quang huỳnh quang phân tích định lượng thành công hàm lượng moxifloxacin trong máu bệnh nhân phù hợp với khoảng nồng độ điều trị lâm sàng mà không bị nhiễu bởi các chất nền nội sinh.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Nguyễn Thị Minh Diệp đã phát triển và chuẩn hóa thành công các quy trình phân tích định lượng moxifloxacin bằng HPLC-PDA và FLS, cùng quy trình định lượng đồng thời bốn kháng sinh fluoroquinolon (norfloxacin, ciprofloxacin, levofloxacin, moxifloxacin) trong huyết tương và nước tiểu bằng HPLC-FLD hai kênh bước sóng. Các phương pháp đã được thẩm định đầy đủ về độ tin cậy theo hướng dẫn của ICH và AOAC, đạt độ đặc hiệu, độ nhạy cao và khoảng tuyến tính phù hợp với nồng độ điều trị. Công trình đã giải quyết được khoảng trống kiểm nghiệm dịch sinh học đối với kháng sinh moxifloxacin tại Việt Nam, mang lại giải pháp phân tích thực nghiệm khả thi, đóng góp thiết thực cho công tác kiểm nghiệm và theo dõi nồng độ thuốc trong điều trị lâm sàng.