Tổng quan luận án

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Kháng sinh nhóm fluoroquinolon (FQL) là các hợp chất kháng khuẩn tổng hợp có phổ kháng khuẩn rộng và hoạt lực mạnh trên nhiều vi sinh vật gây bệnh nguy hiểm, bao gồm cả vi khuẩn Gram âm, vi khuẩn Gram dương và các vi sinh vật không điển hình. Nhóm thuốc này giữ vai trò điều trị quan trọng trong các bệnh lý nhiễm trùng đường tiết niệu, đường tiêu hóa, hô hấp, tình dục, da và mô mềm, cũng như các nhiễm khuẩn nặng do các chủng vi sinh vật đã kháng penicillin và macrolid. Cơ chế tác dụng chính của fluoroquinolon là ức chế enzym ADN gyrase và mARN, từ đó ngăn cản sự tổng hợp acid nucleic và protein của vi khuẩn.

Trong thực hành điều trị lâm sàng, việc áp dụng mức liều chuẩn có thể dẫn đến hiện tượng phơi nhiễm quá mức ở một số cá thể gây ra các tác dụng không mong muốn nghiêm trọng, hoặc ngược lại, dẫn đến tình trạng thiếu hụt nồng độ thuốc tại vị trí tác dụng, làm thất bại phác đồ điều trị và gia tăng nguy cơ kháng thuốc. Các yếu tố sinh lý bệnh nhân, vị trí nhiễm khuẩn và đặc tính dược động học của từng hoạt chất FQL tạo ra sự biến thiên lớn về nồng độ thuốc trong cơ thể. Do đó, việc theo dõi và định lượng nồng độ thuốc trong các dịch sinh học (huyết tương và nước tiểu) là công cụ cần thiết nhằm hỗ trợ giám sát điều trị và hiệu chỉnh liều.

Tuy nhiên, việc phân tích kháng sinh FQL trong nền mẫu sinh học gặp nhiều khó khăn do thành phần nền mẫu rất phức tạp (chứa nhiều protein, lipid, sắc tố, chất nội sinh) và nồng độ thuốc thường ở mức vi lượng. Tại Việt Nam, moxifloxacin – một fluoroquinolon thế hệ 4 có hoạt tính mạnh và ít độc tính hơn các thế hệ trước – chưa được đưa vào Dược điển Việt Nam và chưa có công trình nào công bố quy trình định lượng trong huyết tương bằng các phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối đầu dò diod quang (HPLC-PDA) cũng như phương pháp quang phổ huỳnh quang phân tử (FLS) kết hợp chất hoạt động bề mặt. Đồng thời, việc phân tích đồng thời nhiều FQL thuộc các thế hệ khác nhau trong cùng một điều kiện phân tích vẫn là một thách thức kỹ thuật lớn đối với các phòng kiểm nghiệm trong nước.

Mục tiêu nghiên cứu

  1. Nghiên cứu cơ bản nhằm phát triển phương pháp phân tích định lượng thuốc kháng sinh fluoroquinolon trong nền mẫu dịch sinh học (huyết tương và nước tiểu) bằng hai phương pháp: phương pháp quang phổ huỳnh quang (FLS) và phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối với hai loại detector (HPLC-PDA và HPLC-FLD).
  2. Xây dựng và tối ưu hóa 3 quy trình phân tích cụ thể:
    • Quy trình xác định hàm lượng moxifloxacin trong huyết tương bằng phương pháp HPLC-PDA.
    • Quy trình xác định hàm lượng moxifloxacin trong huyết tương bằng phương pháp FLS.
    • Quy trình xác định đồng thời 4 fluoroquinolon (norfloxacin, ciprofloxacin, levofloxacin, moxifloxacin) trong nước tiểu và huyết tương bằng phương pháp HPLC-FLD.
  3. Đánh giá độ tin cậy của các phương pháp phân tích đã xây dựng theo các hướng dẫn thẩm định phân tích sinh học và áp dụng thử nghiệm định lượng moxifloxacin trên mẫu huyết tương thực tế.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng nghiên cứu: Bốn kháng sinh thuộc nhóm fluoroquinolon đại diện cho các thế hệ 2, 3 và 4 bao gồm: norfloxacin (NOR), ciprofloxacin (CIP), levofloxacin (LEVO) và moxifloxacin (MOXI) trong nền mẫu dịch sinh học (huyết tương người và nước tiểu).
  • Phạm vi nghiên cứu:
    • Khảo sát các điều kiện sắc ký, điều kiện quang phổ huỳnh quang, và các kỹ thuật xử lý nền mẫu sinh học (kết tủa protein, chiết lỏng - lỏng, chiết pha rắn).
    • Thẩm định độ tin cậy của các quy trình phân tích theo các chỉ tiêu: độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ đúng (độ thu hồi) và độ lặp lại.
    • Áp dụng thử nghiệm quy trình phân tích xác định moxifloxacin trên mẫu huyết tương của người bệnh sử dụng thuốc tiêm truyền Avelox.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước đây

Tác giả luận án đã tổng hợp có hệ thống các công trình nghiên cứu và phương pháp phân tích quinolon và fluoroquinolon đã được công bố:

  1. Phương pháp tiêu chuẩn trong Dược điển:

    • Dược điển Việt Nam V: Quy định phương pháp HPLC-UV xác định levofloxacin (bước sóng 360 nm, cột RP-C18, pha động MeOH : đệm amoni acetat/đồng sulfat/L-isoleucin tỷ lệ 3:7) và ciprofloxacin (bước sóng 278 nm, cột RP-C18, pha động ACN : acid phosphoric 0,245% pH 3 tỷ lệ 13:87); phương pháp chuẩn độ điện thế bằng acid perchloric 0,1N trong acid acetic khan đối với norfloxacin.
    • Dược điển Mỹ 43 (USP 43): Quy định định lượng moxifloxacin hydrochlorid trong dược phẩm bằng HPLC-UV ở bước sóng 293 nm, cột phân tích L11 (4,0 mm x 25 mm, nhiệt độ 45 °C), pha động gồm methanol và đệm chứa tetrabutylammonium hydrogen sulfat, kali phosphat monobasic và acid phosphoric (28:72 v/v).

  2. Phương pháp điện hóa:

    • Sử dụng cực phổ xung vi phân và von-ampe trên điện cực giọt thủy ngân treo (HMDE) khảo sát norfloxacin ở dải pH 1–10; von-ampe vòng và sóng vuông trên điện cực glassy carbon cho norfloxacin với LOD đạt 1,1 µg/mL.
    • Silvina Kergaravat và cộng sự phát triển phương pháp von-ampe hòa tan sử dụng điện cực màng bitmut (BiFE) xác định moxifloxacin và ciprofloxacin với LOD đạt 0,5 ng/L.
    • Jaber và cộng sự sử dụng von-ampe hòa tan hấp phụ catot với ion Cu(II) trung gian định lượng enrofloxacin.
    • Yongnian Ni và cộng sự áp dụng phương pháp quét dải điện áp tuyến tính xác định đồng thời ofloxacin, norfloxacin và ciprofloxacin trên điện cực thủy ngân trong đệm Britton-Robinson pH 3,78.
    • Radi và cộng sự xác định levofloxacin trong nước tiểu người bằng von-ampe hòa tan hấp phụ anot sóng vuông trên điện cực glassy carbon (thế oxy hóa 0,4 V, đệm acetat pH 5,0, LOD 5×10⁻⁹ M).

  3. Phương pháp điện di mao quản (CE):

    • Phân tách đồng thời ciprofloxacin, gatifloxacin, levofloxacin, moxifloxacin và sparfloxacin ở bước sóng 282 nm (LOD từ 1,02 đến 2,48 mg/mL).
    • Yu và cộng sự dùng heptakis(2,6-O-dimethyl)-β-CD (DM-β-CD) nồng độ 40 mM ở pH 2,5 để phân tách đồng phân đối quang của ofloxacin.
    • Zhou và cộng sự dùng HP-β-CD trong đệm phosphat 70 mM tách đối quang lomefloxacin, gatifloxacin, pazufloxacin, ofloxacin.
    • Cho và cộng sự phân tích gemifloxacin sử dụng acid (+)-(18-crown-6)-tetracarboxylic kết hợp bổ sung EDTA để loại bỏ ảnh hưởng của ion Na⁺.
    • Horimai và cộng sự tách đồng phân ofloxacin và DU-6859 bằng phức γ-CD-D-Phe-Zn(II) trong đệm amoni acetat pH 6,5.

  4. Phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS / LC-MS/MS):

    • Trần Thanh Trúc và cộng sự phân tích 8 quinolon trong mẫu thịt gà, thịt heo, tôm và cá diêu hồng bằng hệ thống microQTOF kết hợp chiết lỏng - lỏng.
    • Cao Công Khánh và cộng sự xây dựng quy trình phân tích đồng thời 14 quinolon trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi bằng LC-MS/MS Triple Quad ESI(+), chế độ MRM kết hợp kỹ thuật xử lý mẫu QuEChERS.
    • Các công trình phân tích đồng thời macrolid và quinolon trong thức ăn trẻ em tại Rio de Janeiro (Brazil) theo quyết định 2002/657/EC của EURL.

  5. Phương pháp HPLC và kỹ thuật xử lý mẫu dịch sinh học:

    • Laban-Djurdjevic và cộng sự chứng minh việc bổ sung SDS giúp cải thiện mạnh tín hiệu huỳnh quang của moxifloxacin.
    • Aoki và cộng sự phát triển phương pháp HPLC-UV-FL xác định sitafloxacin trong huyết thanh và nước tiểu.
    • Các nghiên cứu xử lý mẫu dịch sinh học bằng kỹ thuật chiết lỏng - lỏng (LLE), chiết pha rắn (SPE) và kết tủa protein (PP) với các dung môi methanol, acetonitril, TCA hoặc acid perchloric 7% (độ thu hồi dao động từ 86,4% đến 106%).
Hoạt chất Nền mẫu Kỹ thuật xử lý Dung môi chiết / Rửa giải Độ thu hồi (%) Tài liệu
CIP Nước tiểu SPE Acetonitril – TFA 2% (25:75) 92,3 – 97,0 [13]
CIP / OFL Huyết tương SPE Na₃PO₄·H₂O (0,1% TFA, pH 2,4) – ACN (80:20) 91,2 – 103,6 [55]
FLE Huyết tương LLE TEA 1% pH 4,8 + ACN (80:20) 99,1 – 100,9 [13]
FLE Huyết thanh LLE Natri lauryl sulfat 2% 98,0 [55]
CIP / OFL / MOXI Huyết tương PP Acetonitril 86,4 – 95,0 [56], [58]
LEVO Nước tiểu / Huyết tương LLE Diclometan / Acetonitril 87,0 – 106,0 [57], [58]
MOXI Huyết tương LLE / PP Acetonitril / Acid perchloric 7% 97,0 – 106,0 [52], [60]

Khoảng trống luận án lựa chọn giải quyết

Mặc dù các phương pháp LC-MS/MS có độ nhạy rất cao nhưng chi phí thiết bị và vận hành đắt đỏ, khó áp dụng rộng rãi trong điều kiện thực tế tại các bệnh viện và phòng thí nghiệm ở Việt Nam; phương pháp điện di mao quản có độ lặp lại chưa cao trên nền mẫu sinh học; phương pháp HPLC-UV thường bị nhiễu nền nghiêm trọng ở nồng độ thấp. Luận án lựa chọn giải quyết bài toán:

  • Phát triển phương pháp quang phổ huỳnh quang phân tử (FLS) tăng cường độ nhạy nhờ tạo phức với ion europi Eu(III) và chất hoạt động bề mặt sodium dodecyl benzene sulfonat (SDBS) để định lượng moxifloxacin trong huyết tương.
  • Phát triển phương pháp HPLC-PDA cho moxifloxacin và phương pháp HPLC-FLD sử dụng hai kênh bước sóng huỳnh quang để định lượng đồng thời 4 kháng sinh FQL (NOR, CIP, LEVO, MOXI) trong huyết tương và nước tiểu, tối ưu hóa các quy trình xử lý mẫu (PP, LLE, SPE) phù hợp với trang thiết bị sẵn có tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và cấu trúc hóa học của fluoroquinolon

Fluoroquinolon có cấu trúc cơ bản gồm nhân quinolin hoặc naphthyridin, mang nhóm ceton ở vị trí C-4 và nhóm acid carboxylic ở vị trí C-3. Sự có mặt của nguyên tử fluor ở vị trí C-6 và các dị vòng (như piperazinyl, pyrrolidinyl) ở vị trí C-7 tạo nên các phân nhóm thế hệ 2, 3 và 4.

Đặc tính acid - base:
- Nhóm 3-COOH thể hiện tính acid (pKa1 từ 5,5 đến 6,6).
- Nguyên tử Nitơ trên vòng piperazin hoặc cấu trúc amin ở C-7 thể hiện tính base yếu (pKa2 từ 7,2 đến 9,14).
- Trong dung dịch nước, FQL tồn tại ở 3 dạng cân bằng: Cation -> Zwitterion (lưỡng cực) -> Anion.

Tại điểm đẳng điện (pI), dạng ion lưỡng cực chiếm ưu thế, phân tử có tính kỵ nước cao nhất, thuận lợi cho việc chiết xuất bằng dung môi hữu cơ.

Thông số hóa lý Moxifloxacin (MOXI) Levofloxacin (LEVO) Norfloxacin (NOR) Ciprofloxacin (CIP)
Công thức phân tử C₂₁H₂₄FN₃O₄ C₁₉H₂₂FN₃O₄ C₁₉H₂₂FN₃O₄ C₁₇H₁₈FN₃O₃
Khối lượng mol (g/mol) 401,431 361,368 319,331 331,340
Hằng số phân ly (pKa) Acid: 6,20; Base: 9,14 Acid: 6,00; Base: 8,60 Acid: 6,05; Base: 8,51 Acid: 6,16; Base: 8,62
Độ tan trong nước 1146 mg/L (25 °C) Ít tan trong nước 0,28 mg/mL (25 °C) 36 mg/mL (25 °C)
Nhiệt độ nóng chảy (°C) 238 – 242 225 – 227 227 – 228 255 – 257
Hệ số Log Kow 0,95 - - -

Đặc tính quang học và cơ chế phát huỳnh quang

Phổ hấp thụ UV-Vis và phổ phát xạ huỳnh quang của FQL bắt nguồn từ hệ electron π liên hợp của nhân thơm. Các chuyển dịch điện tử chính gồm $\pi \rightarrow \pi^$ và $n \rightarrow \pi^$. Cường độ phát huỳnh quang phụ thuộc chặt chẽ vào pH môi trường: trong môi trường acid và trung tính, các dạng cation và ion lưỡng cực phát huỳnh quang mạnh; trong môi trường kiềm mạnh hoặc dung môi không proton (như ACN), hiệu suất huỳnh quang giảm rõ rệt.

Phương pháp FLS xác định moxifloxacin dựa trên phản ứng tạo phức chelat giữa moxifloxacin và ion kim loại đất hiếm Europi $\text{Eu}^{3+}$. Sự có mặt của chất hoạt động bề mặt anion SDBS tạo môi trường micell kỵ nước, ngăn cản sự dập tắt huỳnh quang của các phân tử nước, giúp tăng cường tín hiệu phát xạ huỳnh quang của phức chất tại bước sóng kích thích $\lambda_{ex} = 405\text{ nm}$ và bước sóng phát xạ $\lambda_{em} = 614\text{ nm}$.

Phương pháp thực nghiệm và kỹ thuật phân tích

  1. Phương pháp quang phổ huỳnh quang (FLS):

    • Thiết bị: Máy đo quang phổ huỳnh quang Nanolog (Horiba, Hoa Kỳ) trang bị đèn hồ quang Xenon 450 W, bộ đơn sắc kép.
    • Phản ứng tạo phức: Khảo sát tương tác giữa $\text{Eu}^{3+}$ ($1,0 \times 10^{-3}\text{ M}$), MOXI ($1,0 \times 10^{-3}\text{ M}$), SDBS ($7,0 \times 10^{-3}\text{ M}$) trong hệ đệm Tris-HCl ở dải pH từ 8,0 đến 10,0; thời gian ổn định phức (đo lặp lại mỗi 5 phút).
    • Xử lý mẫu huyết tương: Kết tủa protein bằng 5 mL methanol, lắc vortex 2500 vòng/phút trong 10 phút, ly tâm 8000 vòng/phút trong 15 phút; bay hơi dịch nổi đến cắn, hòa tan lại bằng 1,0 mL nước cất 2 lần, lọc màng 0,45 µm và đưa vào phản ứng tạo phức.

  2. Phương pháp HPLC-PDA định lượng Moxifloxacin:

    • Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối đầu dò chuỗi diod quang PDA.
    • Bước sóng phát hiện: Lựa chọn cực đại hấp thụ $\lambda = 295\text{ nm}$.
    • Pha động: Khảo sát hệ dung môi Acetonitril : Đệm phosphat, tốc độ dòng 1,0 mL/phút.
    • Xử lý mẫu: Kết tủa protein bằng TCA (nồng độ 5% đến 25%) hoặc MeOH; khảo sát thời gian lắc vortex (30–180 giây), tốc độ ly tâm (1000–5000 vòng/phút) và thời gian ly tâm (5–25 phút).

  3. Phương pháp HPLC-FLD định lượng đồng thời 4 FQL:

    • Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối đầu dò huỳnh quang FLD hai kênh.
    • Cặp bước sóng kích thích / phát xạ: Kênh 1: $\lambda_{ex}/\lambda_{em} = 290/500\text{ nm}$ (dành cho LEVO và MOXI); Kênh 2: $\lambda_{ex}/\lambda_{em} = 280/445\text{ nm}$ (dành cho NOR và CIP).
    • Pha động: Khảo sát MeOH – H₂O chứa $\text{H}_3\text{PO}_4\text{ 0,025 M}$ (35:65 v/v), rửa giải gradient nồng độ MeOH; tốc độ dòng 0,8 – 1,5 mL/phút; nhiệt độ lò cột 20 – 40 °C; pH pha động 2 – 5.
    • Xử lý mẫu nước tiểu:
      • Chiết lỏng - lỏng (LLE): Khảo sát các dung môi cloroform, diclometan, ethyl acetat, diclometan/MeOH (9:1, 8:2, 7:3); thể tích dung môi (3–6 mL); thời gian lắc chiết (2–5 phút).
      • Chiết pha rắn (SPE): Khảo sát 3 loại cột chiết (Chromfilter C18 500 mg/6 mL, Waters Oasis HLB 500 mg/6 mL, Agilent Bond Elut PLEXA 500 mg/6 mL); dung môi rửa tạp (nước deion, nước pH 3, đệm phosphat 20 mM pH 3, hỗn hợp nước/MeOH 95:5); dung môi rửa giải (ACN, MeOH, diclometan, ethyl acetat, MeOH/diclometan 1:9; thể tích 3–7 mL).

  4. Phương pháp thẩm định quy trình phân tích:

    • Thẩm định theo hướng dẫn phân tích sinh học và tiêu chuẩn AOAC.
    • Độ đặc hiệu: So sánh sắc ký đồ của mẫu trắng, mẫu thử tự tạo và mẫu thêm chuẩn.
    • Khoảng tuyến tính: Phương trình hồi quy tuyến tính $y = ax + b$, yêu cầu hệ số tương quan $R \ge 0,997$ ($R^2 \ge 0,995$).
    • Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ): Xác định theo tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu ($S/N = 3$ đối với LOD, $S/N = 10$ đối với LOQ) hoặc theo độ lệch chuẩn lặp lại ($LOD = 3SD$, $LOQ = 10SD$).
    • Giới hạn phát hiện/định lượng của phương pháp (MDL, MQL): Tính toán dựa trên nồng độ thêm chuẩn trên nền mẫu thực tế qua xử lý mẫu.
    • Độ lặp lại (độ chụm): Đánh giá trên 6 mẫu thử độc lập, yêu cầu độ lệch chuẩn tương đối $RSD% \le 2,0%$.
    • Độ đúng (hiệu suất thu hồi $H%$): Đánh giá tại 3 mức nồng độ (thấp, trung bình, cao) với ít nhất 3 lần lặp lại, yêu cầu $H%$ đạt $80,0% - 110,0%$ và $RSD% \le 2,0%$.

$$\text{Hiệu suất thu hồi } H (%) = \frac{C_{tt}}{C_{lt}} \times 100$$ (Trong đó: $C_{tt}$ là nồng độ thực tế tìm lại được từ đường chuẩn; $C_{lt}$ là nồng độ lý thuyết thêm vào).

  1. Xử lý số liệu: Phần mềm Analyst của hệ thống HPLC-UV/FLD, phần mềm Origin và Microsoft Excel.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 trình bày tổng quan về lịch sử phát triển của nhóm quinolon từ hợp chất đầu tiên là acid nalidixic (năm 1962), quá trình tổng hợp các dẫn xuất và phân loại thành 4 thế hệ dựa trên cấu trúc hóa học và phổ tác dụng lâm sàng:

Thế hệ Đại diện hoạt chất tiêu biểu Phổ kháng khuẩn Chỉ định lâm sàng chính
Thế hệ 1 Acid Nalidixic, Cinoxacin, Acid Oxolinic, Acid Pipemidic Vi sinh vật Gram (-) đường ruột (trừ Pseudomonas) Nhiễm trùng đường tiết niệu không biến chứng
Thế hệ 2 Norfloxacin, Ciprofloxacin, Ofloxacin, Lomefloxacin, Enoxacin Gram (-) mạnh (gồm Pseudomonas), một số Gram (+) và vi khuẩn không điển hình Nhiễm trùng tiết niệu phức tạp, viêm thận, nhiễm trùng da, mô mềm, bệnh lây truyền qua đường tình dục
Thế hệ 3 Levofloxacin, Sparfloxacin, Gatifloxacin Phổ thế hệ 2 mở rộng trên Gram (+) (S. pneumoniae kháng penicillin) Viêm phế quản cấp/mạn, viêm phổi mắc phải tại cộng đồng
Thế hệ 4 Moxifloxacin, Trovafloxacin, Gemifloxacin Phổ thế hệ 3 mở rộng trên vi sinh vật kỵ khí/yếm khí Viêm phổi bệnh viện, nhiễm trùng ổ bụng, vùng chậu, nhiễm khuẩn nặng

Chương này cũng tổng hợp sâu các thông số dược động học lâm sàng của 4 hoạt chất:

  • MOXI: Sinh khả dụng đường uống ~90%; liên kết protein huyết thanh 30–50%; thể tích phân bố $1,7 - 2,7\text{ L/kg}$; độ thanh thải toàn phần $12 \pm 2\text{ L/h}$; nồng độ đỉnh huyết tương $C_{max}$ đạt từ $0,29\text{ µg/mL}$ (liều 50 mg) đến $4,73\text{ µg/mL}$ (liều 800 mg) sau 0,4–4 giờ.
  • LEVO: Sinh khả dụng ~99%; $C_{max}$ liều 500 mg tiêm tĩnh mạch đạt $6,2 \pm 1,0\text{ µg/mL}$, liều 750 mg đạt $11,5 \pm 4,0\text{ µg/mL}$; thanh thải toàn phần $8,64 - 13,56\text{ L/h}$, thanh thải thận $5,76 - 8,52\text{ L/h}$; nồng độ điều trị tối đa $2,8 - 12,1\text{ µg/mL}$.
  • NOR: Thải trừ qua lọc cầu thận và bài tiết ống thận (tốc độ thanh thải $275\text{ mL/phút}$); liên kết protein 10–15%; nồng độ đỉnh huyết tương đạt $0,8\text{ µg/mL}$ (liều 200 mg) đến $2,4\text{ µg/mL}$ (liều 800 mg).
  • CIP: Sinh khả dụng đường uống 60–80%; $C_{max}$ đạt $0,94\text{ mg/L}$ sau 0,81 giờ (liều 250 mg); nồng độ điều trị tối đa đạt $1,2\text{ µg/mL}$ (liều 250 mg) đến $5,4\text{ µg/mL}$ (liều 1000 mg); độ thanh thải thận $4,42\text{ mL/phút/kg}$.

Đồng thời, chương 1 phân tích chi tiết cơ chế quang hóa, quang phổ dừng, quang phổ phân giải thời gian và tổng kết ưu nhược điểm của các kỹ thuật phân tích hiện đại (Điện hóa, CE, LC-MS/MS, HPLC-UV/FLD) cùng các phương pháp xử lý nền mẫu sinh học.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm, hóa chất chuẩn, trang thiết bị và các bước khảo sát đơn biến:

  • Xây dựng phản ứng tạo phức phát huỳnh quang $\text{Eu}^{3+}\text{ - MOXI - SDBS}$: Lập dãy tỷ lệ nồng độ, khảo sát ảnh hưởng của pH đệm Tris-HCl (8,0; 8,5; 9,0; 9,3; 9,5; 10,0), khảo sát lượng ion $\text{Eu}^{3+}$ ($1,0 \times 10^{-3}\text{ M}$ từ 50 đến 225 µL) và thể tích SDBS ($7,0 \times 10^{-3}\text{ M}$ từ 0 đến 35 µL).
  • Thiết lập điều kiện sắc ký HPLC-PDA cho moxifloxacin: Khảo sát phổ hấp thụ UV (207 nm và 295 nm), lựa chọn thành phần dung môi pha động ACN : Đệm phosphat, tốc độ dòng và thể tích tiêm.
  • Thiết lập điều kiện HPLC-FLD tách đồng thời 4 FQL: Đo phổ kích thích/phát xạ sơ bộ trên thiết bị Nanolog; tối ưu hóa hai cặp bước sóng $\lambda_{ex}/\lambda_{em}$ trên HPLC; khảo sát 5 hệ dung môi pha động, nồng độ đệm $\text{H}_3\text{PO}_4$, tỷ lệ gradient MeOH, tốc độ dòng (0,8 – 1,5 mL/phút), nhiệt độ cột (20, 30, 40 °C) và pH pha động (2, 3, 4, 5).
  • Tối ưu hóa kỹ thuật xử lý mẫu:
    • Mẫu huyết tương: Khảo sát tác nhân kết tủa protein (MeOH tỷ lệ mẫu/dung môi 1:3, 1:4, 1:5; TCA 20% tỷ lệ 6:1, 5:1, 2:1, 1:1, 1:2); nồng độ TCA (5%, 10%, 15%, 20%, 25%); thời gian lắc vortex (30–180 giây); thời gian ly tâm (5–25 phút).
    • Mẫu nước tiểu: Khảo sát chiết lỏng - lỏng LLE (thể tích dung môi 3–6 mL, thời gian lắc 2–5 phút); khảo sát chiết pha rắn SPE (so sánh 3 loại cột Chromfilter C18, Waters Oasis HLB, Agilent Bond Elut PLEXA; 5 hệ dung môi rửa tạp; 5 dung môi rửa giải với thể tích 3–7 mL).
  • Phương pháp đánh giá độ tin cậy và xử lý số liệu theo các tiêu chuẩn thẩm định phân tích hiện hành.

Chương 3: Kết quả và bàn luận

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được:

  1. Quy trình phân tích Moxifloxacin bằng HPLC-PDA trong huyết tương:

    • Phổ hấp thụ UV: Moxifloxacin có hai cực đại hấp thụ tại 207 nm và 295 nm. Bước sóng 295 nm được lựa chọn do có độ chọn lọc cao, hạn chế tối đa độ hấp thụ nền của dung môi và các hợp chất nội sinh trong huyết tương.
    • Điều kiện sắc ký: Hệ pha động Acetonitril : Đệm phosphat với tốc độ dòng 1,0 mL/phút cho pic sắc ký của MOXI đối xứng, sắc nhọn, đường nền ổn định, thời gian lưu phù hợp.
    • Xử lý mẫu huyết tương: Quy trình kết tủa protein được tối ưu hóa cho hiệu suất thu hồi cao và loại bỏ triệt để protein huyết tương.

  2. Quy trình phân tích Moxifloxacin bằng phương pháp FLS:

    • Phức chất $\text{Eu}^{3+}\text{ - MOXI - SDBS}$ phát huỳnh quang mạnh tại $\lambda_{ex} = 405\text{ nm}$ và $\lambda_{em} = 614\text{ nm}$.
    • Tối ưu hóa điều kiện phản ứng: pH tối ưu đạt được tại giá trị pH 9,3 (dung dịch đệm Tris-HCl); xác định được lượng tối ưu của ion $\text{Eu}^{3+}$ và chất hoạt động bề mặt SDBS giúp cường độ phát quang đạt cực đại và ổn định theo thời gian.
    • Đường chuẩn huỳnh quang biểu diễn mối quan hệ tuyến tính chặt chẽ giữa nồng độ MOXI và cường độ huỳnh quang trong khoảng nồng độ khảo sát.

  3. Quy trình phân tích đồng thời 4 FQL bằng HPLC-FLD trong huyết tương và nước tiểu:

    • Thiết lập thành công điều kiện chạy sắc ký sử dụng detector huỳnh quang 2 kênh với hai cặp bước sóng kích thích/phát xạ chuyên biệt: $\lambda_{ex}/\lambda_{em} = 290/500\text{ nm}$ (cho LEVO và MOXI) và $\lambda_{ex}/\lambda_{em} = 280/445\text{ nm}$ (cho NOR và CIP), giúp tín hiệu của cả 4 chất đều đạt cực đại.
    • Hệ pha động MeOH : $\text{H}_2\text{O}$ ($\text{H}_3\text{PO}_4\text{ 0,025 M}$) kết hợp chương trình gradient nồng độ MeOH tách hoàn toàn 4 pic sắc ký trong thời gian phân tích hợp lý.
    • Quy trình chiết pha rắn (SPE) trên mẫu nước tiểu và kết tủa protein trên mẫu huyết tương đạt độ thu hồi cao, đáp ứng các tiêu chuẩn AOAC.

  4. Kết quả thẩm định và ứng dụng thử nghiệm:

    • Các phương pháp phân tích đều đạt độ đặc hiệu cao, khoảng tuyến tính có $R^2 \ge 0,995$, giới hạn phát hiện và định lượng thấp, độ đúng ($H% = 80,0 - 110,0%$) và độ lặp lại ($RSD% \le 2,0%$).
    • Áp dụng phân tích thành công moxifloxacin trong mẫu huyết tương thực tế của bệnh nhân điều trị bằng thuốc tiêm truyền Avelox.

Kết quả và những đóng góp mới

Ý nghĩa khoa học

  • Xây dựng thành công phương pháp quang phổ huỳnh quang phân tử (FLS) định lượng moxifloxacin trong huyết tương thông qua phản ứng tạo phức với ion europi $\text{Eu}^{3+}$ có sự hỗ trợ của chất hoạt động bề mặt sodium dodecyl benzene sulfonat (SDBS). Việc ứng dụng chất hoạt động bề mặt SDBS tạo môi trường micell kỵ nước làm tăng mạnh cường độ huỳnh quang, nâng cao độ nhạy và hạ thấp giới hạn phát hiện là một đóng góp mới trong phân tích moxifloxacin tại Việt Nam.
  • Phát triển phương pháp HPLC-FLD sử dụng detector huỳnh quang hai kênh bước sóng ($\lambda_{ex}/\lambda_{em} = 290/500\text{ nm}$ và $280/445\text{ nm}$) để định lượng đồng thời 4 kháng sinh fluoroquinolon đại diện cho 3 thế hệ (thế hệ 2, 3 và 4), tận dụng tối đa đặc tính huỳnh quang tự nhiên của khung cấu trúc FQL để đạt độ chọn lọc và độ nhạy phân tích cao.

Ý nghĩa thực tiễn

  • Cung cấp hai quy trình định lượng đơn kháng sinh moxifloxacin trong huyết tương (bằng HPLC-PDA và FLS) đã được thử nghiệm thành công trên mẫu bệnh phẩm người bệnh, phục vụ giám sát nồng độ thuốc trong điều trị nhiễm khuẩn nặng.
  • Cung cấp quy trình định lượng đồng thời 4 kháng sinh fluoroquinolon (norfloxacin, ciprofloxacin, levofloxacin, moxifloxacin) trong cả hai nền mẫu huyết tương và nước tiểu bằng HPLC-FLD. Quy trình cho phép phân tích nhiều mẫu bệnh nhân đang sử dụng các kháng sinh FQL khác nhau trong cùng một điều kiện phân tích, giúp tiết kiệm thời gian, giảm chi phí hóa chất và dung môi.
  • Quy trình phân tích được thiết kế đơn giản, sử dụng các trang thiết bị, hóa chất, dung môi phổ biến, có tính khả thi cao khi triển khai tại các phòng thí nghiệm, trung tâm kiểm nghiệm và bệnh viện tại Việt Nam.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

  • Việc áp dụng thử nghiệm trên mẫu lâm sàng thực tế mới chỉ được tiến hành đối với đơn kháng sinh moxifloxacin trên mẫu huyết tương bệnh nhân sử dụng thuốc tiêm truyền Avelox; chưa mở rộng thử nghiệm đồng thời cả 4 FQL trên cỡ mẫu bệnh nhân lớn trong cả hai nền mẫu huyết tương và nước tiểu.
  • Chưa khảo sát sâu sự ảnh hưởng của các chất chuyển hóa thứ cấp của FQL trong các trường hợp bệnh nhân suy giảm chức năng gan hoặc thận nặng.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

  • Mở rộng triển khai quy trình HPLC-FLD đồng thời 4 FQL trên các cỡ mẫu lâm sàng lớn tại các khoa Hồi sức tích cực, Truyền nhiễm nhằm xây dựng cơ sở dữ liệu giám sát nồng độ thuốc điều trị (TDM) và cá thể hóa liều dùng FQL.
  • Nghiên cứu ứng dụng quy trình phân tích mở rộng trên các nền mẫu sinh học khác như dịch rửa phế quản, dịch màng phổi hoặc mô sinh thiết.

Giá trị tham khảo

Đối tượng thụ hưởng

  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên chuyên ngành Hóa phân tích, Kiểm nghiệm thuốc và Dược lý: Là tài liệu tham khảo hệ thống về lý thuyết quang hóa, cân bằng acid-base của hợp chất dị vòng, cơ chế tạo phức phát huỳnh quang đất hiếm và kỹ thuật thiết lập sắc ký ghép nối detector huỳnh quang đa kênh.
  • Kỹ thuật viên, kiểm nghiệm viên tại các trung tâm kiểm nghiệm và phòng xét nghiệm sinh hóa - dược lâm sàng: Cung cấp quy trình thao tác chuẩn (SOP) chi tiết từ khâu xử lý mẫu sinh học (kết tủa protein, LLE, SPE) đến khâu cài đặt thông số sắc ký và thẩm định phương pháp theo hướng dẫn quốc tế (AOAC, ICH).
  • Bác sĩ và dược sĩ lâm sàng tại các cơ sở khám chữa bệnh: Cung cấp công cụ phân tích tin cậy hỗ trợ theo dõi điều trị, đánh giá tương đương sinh học / sinh khả dụng của các thuốc FQL thế hệ mới và tối ưu hóa phác đồ kháng sinh cho người bệnh.

Câu hỏi thường gặp

1. Việc bổ sung chất hoạt động bề mặt SDBS có vai trò gì trong phương pháp FLS xác định moxifloxacin?

Chất hoạt động bề mặt sodium dodecyl benzene sulfonat (SDBS) tạo ra môi trường micell kỵ nước bao bọc xung quanh phức chất giữa $\text{Eu}^{3+}$ và moxifloxacin. Môi trường này giúp che chắn phức chất khỏi sự va chạm và tương tác với các phân tử nước trong dung môi (vốn là tác nhân dập tắt huỳnh quang), từ đó làm tăng đáng kể cường độ phát xạ huỳnh quang tại $\lambda_{ex} = 405\text{ nm}$ và $\lambda_{em} = 614\text{ nm}$, giúp nâng cao độ nhạy và hạ thấp giới hạn phát hiện của phương pháp.

2. Tại sao phương pháp HPLC-FLD định lượng đồng thời 4 FQL phải cài đặt 2 kênh bước sóng huỳnh quang khác nhau?

Do 4 kháng sinh FQL có cấu trúc nhóm thế khác nhau nên cực đại kích thích và phát xạ huỳnh quang của chúng có sự khác biệt. Việc cài đặt 2 kênh bước sóng chuyên biệt gồm kênh $\lambda_{ex}/\lambda_{em} = 290/500\text{ nm}$ cho levofloxacin và moxifloxacin cùng kênh $\lambda_{ex}/\lambda_{em} = 280/445\text{ nm}$ cho norfloxacin và ciprofloxacin đảm bảo mỗi chất đều được phát hiện ở điều kiện phát quang cực đại, cho diện tích pic lớn nhất, đường nền sạch và độ chọn lọc tối ưu.

3. Quy trình xử lý mẫu dịch sinh học nào được tối ưu hóa cho nền mẫu huyết tương và nước tiểu trong luận án?

Đối với mẫu huyết tương, phương pháp kết tủa protein (PP) được lựa chọn và tối ưu hóa với tác nhân methanol hoặc dung dịch acid trichloroacetic (TCA), kết hợp lắc vortex và ly tâm phân đoạn. Đối với mẫu nước tiểu, luận án khảo sát và xây dựng hai quy trình: chiết lỏng - lỏng (LLE) sử dụng dung môi hữu cơ và chiết pha rắn (SPE) sử dụng các cột chiết polymer pha đảo (như Waters Oasis HLB, Agilent Bond Elut PLEXA, Chromfilter C18) kết hợp dung dịch rửa tạp đệm phosphat pH 3 và dung dịch rửa giải thích hợp.

4. Các thông số dược động học lâm sàng chính của 4 kháng sinh fluoroquinolon được tổng kết như thế nào?

MOXI có sinh khả dụng ~90%, liên kết protein 30–50%, $C_{max}$ đạt $0,29 - 4,73\text{ µg/mL}$; LEVO có sinh khả dụng ~99%, $C_{max}$ đạt $2,8 - 12,1\text{ µg/mL}$, thải trừ chính qua thận; NOR có tỷ lệ liên kết protein thấp 10–15%, tốc độ thanh thải thận cao $275\text{ mL/phút}$, $C_{max}$ đạt $0,8 - 2,4\text{ µg/mL}$; CIP có sinh khả dụng đường uống 60–80%, $C_{max}$ đạt $1,2 - 5,4\text{ µg/mL}$ và độ thanh thải thận là $4,42\text{ mL/phút/kg}$.

5. Tiêu chuẩn đánh giá độ tin cậy của các phương pháp phân tích trong luận án gồm những chỉ tiêu nào?

Các phương pháp được đánh giá toàn diện theo tiêu chuẩn thẩm định phân tích sinh học gồm: độ đặc hiệu (không có pic tạp gây nhiễu tại thời gian lưu của chất phân tích), khoảng tuyến tính ($R^2 \ge 0,995$), giới hạn phát hiện LOD ($S/N = 3$), giới hạn định lượng LOQ ($S/N = 10$), độ lặp lại ($RSD% \le 2,0%$) và độ đúng/hiệu suất thu hồi ($H%$ nằm trong khoảng $80,0% - 110,0%$).

Kết luận

Luận án đã phát triển thành công các phương pháp phân tích định lượng đơn kháng sinh moxifloxacin bằng HPLC-PDA, quang phổ huỳnh quang phân tử FLS (thông qua phức phát huỳnh quang $\text{Eu}^{3+}\text{ - MOXI - SDBS}$) và phương pháp HPLC-FLD hai kênh bước sóng định lượng đồng thời 4 kháng sinh fluoroquinolon (norfloxacin, ciprofloxacin, levofloxacin, moxifloxacin) trong huyết tương và nước tiểu. Các quy trình xử lý mẫu dịch sinh học bằng kết tủa protein, chiết lỏng - lỏng và chiết pha rắn được tối ưu hóa chặt chẽ, đạt độ thu hồi cao và loại bỏ hiệu quả ảnh hưởng của nền mẫu. Toàn bộ các quy trình phân tích đều đạt các tiêu chuẩn thẩm định nghiêm ngặt về độ đặc hiệu, độ nhạy, độ lặp lại và độ đúng theo quy định quốc tế. Kết quả nghiên cứu đã được áp dụng thử nghiệm thành công trên mẫu huyết tương bệnh nhân lâm sàng, mang lại giá trị khoa học và khả năng ứng dụng thực tiễn cao cho công tác kiểm nghiệm và giám sát nồng độ thuốc điều trị tại Việt Nam.