MỞ ĐẦU Báo cáo toàn cầu về bệnh lao tháng 10 năm 2020 của Liên hợp quốc (LHQ) cho thấy năm 2019, bệnh lao vẫn là nguyên nhân phổ biến nhất gây tử vong trong số các bệnh do một mầm bệnh truyền nhiễm duy nhất. Trên toàn cầu, ước tính có khoảng 10,0 triệu người mắc mới và ước tính có khoảng 1,2 triệu trường hợp tử vong do Lao (âm tính với HIV) và 208.000 trường hợp tử vong có kết hợp Lao và HIV. Trong khi đó, Việt Nam hiện đứng thứ 16 về số người mắc Lao cao nhất trên thế giới và đứng hàng thứ 15 gánh nặng Lao kháng đa thuốc với 70 % người mắc bệnh Lao ở trong độ tuổi lao động1. Theo hướng dẫn chẩn đoán điều trị và dự phòng bệnh lao của Bộ Y Tế (2020), các thuốc chống lao thiết yếu (hàng 1) là: isoniazid (H), rifampicin (R), pyrazinamid (Z), streptomycin (S), ethambutol (E), rifabutin (Rfb) và rifapentin (Rpt).
Các phác đồ điều trị A và B trong 6-12 tháng đều có sử dụng rifampicin hàng ngày trong cả 2 giai đoạn tấn công và duy trì2. Điều này cho thấy tầm quan trọng của việc cung ứng các chế phẩm rifampicin có chất lượng một cách nhanh chóng và kịp thời. Rifampicin là một loại kháng sinh bán tổng hợp được sản xuất từ Streptomyces mediterranei, có phổ kháng khuẩn rộng, bao gồm một số chủng Mycobacterium. Đối với các chủng vi khuẩn nhạy cảm, rifampicin ức chế hoạt động của RNA polymerase bằng cách tạo thành một phức hợp ổn định với enzym.
Do đó, nó ngăn chặn sự khởi đầu của quá trình tổng hợp RNA. Rifampin có tác dụng diệt khuẩn và tác động lên cả sinh vật nội bào và ngoại bào3. Dược điển Việt Nam V, Dược điển Anh 2020, Dược điển Mỹ USP42-NF37 đều quy định phải kiểm tra tạp của rifampicin (rifampicin quinon – tạp A, rifampicin N-oxid – tạp B và 3-formylrifamycin SV) tùy theo nguyên liệu và dạng bào chế của chế phẩm trong đó yêu cầu có chất chuẩn đối chiếu tương ứng tùy theo chuyên luận và Dược điển. Cả 3 tạp này đều là sản phẩm của quá trình oxy hóa rifampicin dưới tác dụng của oxy không khí hoặc ánh sáng tử ngoại, không có hoặc hầu như không có hoạt tính kháng khuẩn, có khả năng gia tăng nguy cơ đề kháng rifampicin và có những tác dụng không mong muốn khác.
Các tạp này hiện. không có trong ngân hàng tạp chuẩn quốc gia. Các tạp chuẩn này có giá trung bình khoảng 250 USD/10 mg (chưa tính phí đưa về Việt Nam) và phải đặt mua trước một thời gian dài nếu có nhu cầu sử dụng. Cho đến nay, chưa thấy tài liệu nào công bố đầy đủ quá trình tổng hợp các tạp A và tạp B của rifampicin.
Chỉ thấy nó được tạo ra trong quá trình lão hóa và trong các điều kiện đặc biệt. Từ nhu cầu thực tế trên, nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu tổng hợp hai tạp A và B đạt độ tinh khiết cao, có thể dùng làm nguyên liệu để thiết lập chất đối chiếu mong muốn góp phần chủ động trong việc kiểm tra tạp chất của rifampicin trong nguyên liệu và thành phẩm, làm giàu thêm ngân hàng chất chuẩn trong nước để nâng cao công tác kiểm tra đánh giá chất lượng thuốc. Chính vì những lý do trên, đề tài “Tổng hợp tạp chất A và B của rifampicin” được tiến hành nhằm thực hiện các mục tiêu cụ thể sau: − Tổng hợp tạp A của rifampicin ở quy mô phòng thí nghiệm, đạt khoảng 500 mg, độ tinh khiết tối thiểu 98%. − Tổng hợp tạp B của rifampicin ở quy mô phòng thí nghiệm, đạt khoảng 500 mg, độ tinh khiết tối thiểu 98%.
TỔNG QUAN VỀ RIFAMPICIN 1. Tính chất − Tên hóa học: (2S,12Z,14E,16S,17S,18R,19R,20R,21S,22R,23S,24E)-5,6,9,17,19- Pentahydroxy-23-methoxy-2,4,12,16,18,20,22-heptamethyl-8-[[(4- methylpiperazin-1-yl)imino]methyl]-1,11-dioxo-1,2-dihydro-2,7- (epoxypentadeca[1,11,13]trienimino)naphto[2,1-b]furan-21-yl acetat4. − Công thức phân tử: C43H58N4O124. − Phân tử lượng: 823 g/ mol5.
− Tên khác: rifampin7. − Cảm quan: Bột kết tinh màu nâu đỏ hoặc nâu đỏ4. − Độ tan:8 + tan trong dimethylsulfoxid (~100 mg/ml), dimethylformamid, methanol (16 mg/ml, 25 °C), chloroform (349 mg/ml, 25 °C), ethyl acetat (108 mg/ml, 25 °C), aceton (14 mg/ml, 25 °C). + Ít tan trong nước ở 25 °C: 2,5 mg/ml ở pH 7,3; 1,3 mg/ml ở pH 4,3; + ít tan trong 95 % ethanol (∼10 mg/ml).
+ Tan trong nước ở 37 °C: 200 mg/ml trong dung dịch HCl 0,1 N; 9,9 mg/ml trong dung dịch đệm phosphat pH 7,4. − Nhiệt độ nóng chảy: 194 °C9 − log Po/w10: 4,24. − Huyền phù 1% trong nước có pH từ 4,5-6,56. − Chỉ số khúc xạ: 1,61312.
4 − Quang phổ IR: 3583,9-3449,9 (-OH); 2925,5 (-CH3); 2894,3 (-CH3O); 2781,0- 2682,7 (-CH3N);1712,1 1732,5 (-C=O); 1676,6, 1655,2 1620,7 (-C=N-); 1567,0 (-C=C-); 1461,0-1332,6 (-C-N-); 1290,8-1021,0 (-C-O-C-).13 − Quang phổ UV-Vis: Bước sóng hấp thu cực đại + Trong đệm phosphat, pH 7,38 (10 µg/ml) có λmax: 237 nm; 255 nm; 334 nm; 475 nm6,8. + Trong methanol (10 µg/ml) có λmax 337 nm14. − Phổ MS: m/z 822, 424, 398, 300 và 9813. Công thức cấu tạo của rifampicin6 Hình 1.
Phổ hồng ngoại của rifampicin6. Phổ Attenuated Total Reflectance Infrared (ATR-IR) của rifampicin (Kỹ thuật ATR-Neat trên thiết bị DuraSamplIR II)15 Hình 1. Phổ UV-Vis của rifampicin trong methanol (10 µg/ml) có λmax 337 nm14. Phổ MS của rifampicin16 Hình 1.
Phổ 13C Nuclear Magnetic Resonance (NMR), dung môi: Chloroform-d5 .Phổ 1H-NMR của rifampicin trong CDCl3 (nồng độ 10-1 M, 300 MHz); Phổ 13C-NMR của rifampicin in CDCl3 (nồng độ 10-1 M, 75. Vị trí H Độ dịch chuyển Vị trí C Độ dịch chuyển NH δ13,19 C-1 138,56 OH-1 12,8-13,8 C-2 120,43 OH-4 11,98 C-3 110,88 OH-8 12,8-13,8 C-4 147,92 H-13 1,80 C-5 104,53 H-14 2,21 C-6 174,74 H-17 6,39 C-7 106,05 H-18 6,57 C-8 169,19 H-19 5,93 C-9 112,82 H-20 2,37 C-10 117,90 H-21 3,77 C-11 195,42 OH-21 3,50 C-12 108,74 H-22 1,70 C-13 21,40 H-23 3,00 C-14 7,50 OH-23 3,71 C-15 169,67 H-24 1,52 C-16 129,37 H-25 4,95 C-17 135,05 H-26 1,33 C-18 123,21 H-27 3,47 C-19 142,64 H-28 5,10 C-20 38,54 H-29 6,20 C-21 70,62 H-30 2,08 C-22 33,36 H-31 0,88 C-23 76,89 H-32 0,10 C-24 37,49 H-33 0,59 C-25 74,41 H-34 -0,31 C-26 39,48 H-36 2,05 C-27 76,74 H-37 3,04 C-28 118,64 CH=N 8,25 C-29 142,62 H-2’,6’ 3,13 C-30 20,66 H-3’,5’ 2,56 C-31 17,80. 8 NCH3 2,33 C-32 10,84 N(CH3)2 --- C-33 8,42 C-34 8,85 C-35 172 C-36 20,67 C-37 57,04 CH=N 134,41 C-2’,6’ 50,25 C-3’,5’ 53,93 NCH3 45,87 N(CH3)2 --- − Độ ổn định: + Rifampicin có tuổi thọ ít nhất hai năm khi được bảo quản trong bình hút ẩm ở -20 °C, tránh ánh sáng. Rifampicin ở thể rắn không bị phân hủy khi tăng nhiệt độ lên đến 70 °C.8 + Rifampicin với nồng độ 10 mg/ml trong DMSO bền trong khoảng 8 tháng ở 15 °C; với nồng độ 1 mg/ml trong nước-ethanol (8: 2) bền trong 8 tuần ở 4 °C hoặc 20 °C8.
Rifampicin khá bền trong acetonitril, bền trong 9 tuần ở -20 oC.18 + Rifampin trong huyết tương ổn định ở nhiệt độ môi trường trong 24 giờ hoặc ở -20 ° C trong 2 tuần. Rifampin phân hủy nhanh chóng trong huyết tương ở nhiệt độ môi trường lên đến 54% trong vòng 8 giờ, nếu thêm axit ascorbic có thể kéo dài sự ổn định ở nhiệt độ môi trường lên đến 12 giờ, ở nhiệt độ -20 oC trong 14 ngày mà không quan sát thấy có sự phân hủy.19 + Độ ổn định của rifampicin dạng dung dịch phụ thuộc chủ yếu vào pH của môi trường. Ở pH 8,2 và nhiệt độ khoảng 20-22 °C, có hiện diện không khí, rifampicin chuyển thành rifampin quinon. Bổ sung natri ascorbat có thể ngăn chặn quá trình oxy hóa này.
Trong môi trường kiềm không có oxy tự do, rifampicin bị desacetyl hóa ở 22 °C tạo thành 25-desacetylrifampin (vẫn giữ được hoạt tính kháng khuẩn). Rifampicin phân hủy nhanh chóng trong điều kiện axit hoặc kiềm ở 25 ° C nhưng chậm trong điều kiện trung tính, với nồng độ 200 µg/ml, pH 2,3 rifampicin bị thủy phân thành 3-formylrifampicin8. 9 này có thể tiếp tục bị oxy hóa để tạo thành dẫn xuất quinon không hoạt tính (rifampicin quinon).20-22 + Rifampicin tồn tại dưới dạng đa hình với hai chính dạng I và dạng II và cả dạng vô định hình. Dạng I là ổn định nhất, trong khi dạng II là nhiều nhất.
Bên cạnh hai dạng chính này, rifampicin còn tồn tại dưới dạng hydrat hóa và solvat hóa, chuyển thành dạng vô định hình sau khi loại bỏ dung môi. Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng các dạng I và dạng II của rifampicin có độ hòa tan khác nhau trong môi trường nước. Những khác biệt về độ hòa tan trong môi trường nước có thể ảnh hưởng đến sự hấp thu và sinh khả dụng của thuốc dạng uống. Độc tính − LD50 đường uống trên chuột: 1,570 mg/kg.
Tác dụng dược lý − Hoạt tính kháng khuẩn Dữ liệu cấu trúc tinh thể và dữ liệu sinh hóa gợi ý rằng rifampicin liên kết với tiểu đơn vị RNA polymerase β, nhưng cách xa vị trí hoạt động. Điều này gây ức chế sự tổng hợp RNA bằng cách ngăn chặn sự kéo dài về mặt vật lý, và do đó ngăn chặn sự tổng hợp protein của vi khuẩn. Bằng cơ chế "tắc mạch" này, rifampicin ngăn chặn tổng hợp liên kết phosphodiester thứ hai hoặc thứ ba giữa các nucleotid trong chuỗi RNA, ngăn cản sự kéo dài đầu 5 'của phiên mã RNA qua hơn 2 hoặc 3 nucleotide.23,24 Rifampicin tương tác với RNA polymerase của vi khuẩn nhưng không ức chế enzym của động vật có vú. Nó có tác dụng diệt khuẩn và có phổ hoạt động rất rộng đối với hầu hết các sinh vật gram dương và gram âm (bao gồm cả Pseudomonas aeruginosa) và đặc biệt là Mycobacterium tuberculosis.25 Rifampicin có hoạt tính với các vi khuẩn thuộc chủng Mycobacterium.
Ở nồng độ 0,005 - 0,2 g/ml, rifampicin ức chế in vitro sự phát triển của Mycobacterium tuberculosis. Trong số các Mycobacterium thì Mycobacterium kansaii, bị ức chế ở nồng độ 0,25 - 1 g/ml. Đa số các chủng Mycobacterium scrofulaceum,. 10 Mycobacterium intracellulare và Mycobacteriuma vium bị ức chế ở nồng độ 4 g/ml và một số kháng ở nồng độ 16 g/ml.
Mycobacterium fortuitum rất kháng thuốc. Rifampicin làm tăng hoạt tính in vitro của streptomycin và isoniazid nhưng không làm tăng hoạt tính của ethambutol, đối với Mycobacterium tuberculosis. Rifampicin có tác dụng diệt khuẩn ở trực khuẩn đang tích cực nhân lên cũng như ở pha nghỉ. Rifampicin cũng có tác dụng đều đặn đến Mycobacterium leprae và Mycobacterium bovis.
Ngoài ra, rifampicin là một kháng sinh phổ rộng, in vitro có tác dụng tốt đối với đa số vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm như E. coli, Pseudomonas, Proteus indol dương tính và indol âm tính và Klebsiella. Rifampicin rất tác dụng đối với Staphylococcus aureus và Staphylococcus coagulase âm tính nồng độ diệt khuẩn từ 3 - 12 ng/ml. Thuốc cũng rất tác dụng đối với Neisseria meningitidis và Haemophilus influenzae, nồng độ ức chế tối thiểu: 0,1 - 0,8 g/ml.
Rifampicin cũng ức chế rất nhiều các chủng Legionella ở môi trường nuôi cấy và trên mô hình súc vật.