MỞ ĐẦU Hiện nay, trên thị trường Việt Nam có hơn mười nghìn hợp chất hữu cơ có hoạt tính sinh học dùng làm thuốc chữa bệnh cho con người. Theo sự phát triển của dịch vụ y tế, ngành Dược Việt Nam cũng đang trên đà lớn mạnh, tính đến tháng 9 năm 2015, cả nước có 171 doanh nghiệp sản xuất thuốc, trong đó có 93 doanh nghiệp sản xuất tân dược nhưng chỉ có 53 doanh nghiệp đạt chuẩn GMP – WHO [1]. Theo WHO, thuốc giả chiếm tới 30% và thậm chí, có khi còn lên tới 50% lượng dược phẩm lưu hành ở một số nước đang phát triển, còn tại Nigeria và Guinee, cứ 10 viên thuốc bán ra có tới 6 viên là thuốc giả[12]. Các mẫu thuốc giả chủ yếu là những thuốc được sử dụng khá phổ biến, được bệnh nhân sử dụng thường xuyên thuốc như thuốc điều chỉnh huyết áp, thuốc giảm đường huyết, giảm cholesterol, thuốc kháng sinh, thuốc giảm đau…Điều khiến nhiều người quan tâm là tỉ lệ thuốc giả ở Việt Nam ngày một diễn biến phức tạp, nên công tác kiểm tra ngày càng khó khăn hơn.
Trương Quốc Cường, Cục trưởng Cục Quản lý dược, Bộ Y tế, tỷ lệ thuốc kém chất lượng ở Việt Nam hiện dao động khoảng 3% và thuốc giả dưới 0,02% [12]. Vì vậy, vấn đề kiểm định lại hàm lượng của thuốc theo đúng tiêu chuẩn là một vấn đề rất quan trọng và thực sự cần thiết. Mặt khác, ngoài việc định lượng và kiểm định chất lượng thuốc ở dạng bào chế, thì cần phải có phương pháp phân tích một lượng thuốc nhỏ trong các mẫu sinh học để có thể tìm hiểu khả năng tồn tại, cũng như khả năng hấp thu của thuốc trong cơ thể. Ngày nay, có rất nhiều phương pháp được sử dụng để định lượng các hoạt chất trong thuốc chủ yếu là nhóm các phương pháp sắc ký (HPLC, GC, GC- MS/MS, LC-MS/MS) và nhóm các phương pháp quang phổ (UV-VIS, IR…), phương pháp cực phổ và phương pháp von-ampe hòa tan hấp phụ.
Dược điển Việt Nam sử dụng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp thường quy để định lượng hoạt chất trong thuốc [1]. Phương pháp HPLC có ưu điểm có độ nhạy, độ chọn lọc cao, khả năng tách tốt, nhưng khó áp dụng rộng rãi do thiết bị, hóa chất đắt tiền và không phân tích nhanh được. Phương pháp trắc quang tương đối phổ biến nhưng phải qua nhiều giai đoạn chiết tách mất thời gian, tốn hóa chất, hay mất chất phân tích và độ phân giải không cao. Vì vậy, việc nhiên cứu lựa chọn phương pháp phân tích đảm bảo độ đúng, độ chọn lọc, đơn giản, giá thành không cao, thời gian phân tích nhanh có thể kiểm tra song hành với các phương pháp phân tích trong dược điển và đánh giá tương đương hoạt tính sinh học thuốc là 1 rất cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn.
Vì vậy, chúng tôi đã chọn phương pháp Von- ampe hòa tan hấp phụ để thực hiện đề tài luận văn của mình “Nghiên cứu các đặc tính điện hóa của atorvastatin, fenofibrat và ứng dụng trong phân tích bằng phương pháp Von-ampe”. Atorvastatin và fenofibrat là hai thuốc được sử dụng khá phổ biến hiện nay, có tác dụng làm giảm hàm lượng Cholesterol và triglicelid trong máu. 2 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1. GIỚI THIỆU VỀ CHẤT NGHIÊN CỨU ATORVASTATIN 1.
Cấu tạo của atorvastatin Atorvastatin có tên khoa học theo IUPAC: (3R,5R)-7-[2-(4-fluorophenyl)- 3-phenyl-4-(phenylcarbamoyl)-5-propan-2-ylpyrrol-1-yl]-3,5- axit dihydroxyheptanoic và được biết đến với tên thương mại là Lipitor hay Atorva [1]. Công thức cấu tạo của atorvastatin là Hình 1.1: Công thức cấu tạo của Atorvastatin. Công thức phân tử là C33H35FN2O5, khối lượng mol là 558,64 (g/mol) Ngoài hoạt chất hay sử dụng trong các thuốc là atorvastatin còn có hoạt chất atorvastatin canxi có công thức cấu tạo như hình 1.2: Công thức cấu tạo của Atorvastatin canxi Atorvastatin canxi có tên khoa học theo IUPAC là: (bR, dR)-2-(r- fluorophenyl)-b,ddihydroxy-5-isopropyl-3-phenyl-4-(phenylcarbamoyl) pyrrole-1- hepatanoicacid(1:2)trihydrate. Công thức phân tử là C18H68CaF2N4O10.
3 Atrovastatin canxi có khối lượng mol là1155,34 g/mol[1] Atorvastatin và dạng muối Atorvastatin canxi tồn tại ở dạng bột tinh thể rất ít tan trong nước: 20,4 µg/mL (pH = 2,1); 1,23 mg/mL (pH = 6,0), tan ít trong etanol, tan tốt trong methanol [1]. Dƣợc lực học và động học của Atorvastatin Dược lực học Atorvastatin là chất ức chế cạnh tranh và chọn lọc men khử 3-hydroxy-3- methylglutaryl-coemzym A (HMG-CoA), ức chế quá trình chuyển hóa HMG-CoA thành mevalonat, một tiền chất của sterol, bao gồm cholesterol. Do vậy atovasttin có tác dụng làm giảm hàm lượng cholesterol và triglicelid trong máu. Dược động học Atorvastatin được hấp thu nhanh chóng sau khi uống, nồng độ thuốc trong huyết tương tối đa đạt được trong vòng 1-2 giờ.
Mức độ hấp thu và nồng độ atorvastatin tăng tỉ lệ với liều lượng atorvastatin. Atorvastatin dạng viên nén có độ khả dụng sinh học 95-99% so với dạng dung dịch. Độ khả dụng sinh học tuyệt đối của Atorvastatin là khoảng 14% và độ khả dụng toàn thân của hoạt động ức chế men khử HMG-CoA là khoảng 30%. Khoảng 98 % atorvastatin gắn kết với các protein trong huyết tương.Nồng độ thuốc trong huyết tương khi dùng thuốc buổi chiều tối thấp hơn khi dùng buổi sáng, tuy nhiên nồng độ thuốc trong huyết tương xấp xỉ 0,25 % cho thấy sự thấm thuốc vào tế bào hồng cầu thấp, nhưng hiệu quả giảm LDL thì như nhau [2, 3] Thời gian bán hủy atovastatin trong huyết tương của người 14 giờ.
Dưới 2% lượng atorvastatin uống vào được tìm thấy trong nước tiểu [2, 3]. GIỚI THIỆU VỀ CHẤT NGHIÊN CỨU FENOFIBRAT 1. Cấu tạo của fenofibrat Fenofibrat có tên khoa học theo IUPAC là propan-2-yl{2-4-[(4-clophenyl) cacbonyl] phenoxy}-2-methylpropanoat được biết với tên thương mại là tricor, là một dẫn xuất của axit fibric. 4 Công thức cấu tạo của fenofibrat: Hình 1.
Công thức cấu tạo của Fenofibrat Công thức phân tử của fenofibrat: C20H21ClO4 Khối lượng mol (g/mol): 360,831 1. Dƣợc lực học và động lực học của Fenofibrat Dược lực học Fenofibrat, dẫn chất của acid fibric, là thuốc hạ lipid máu. Thuốc ức chế sinh tổng hợp cholesterol ở gan, làm giảm các thành phần gây xơ vữa động mạch và còn làm giảm triglycerid máu. Do đó, cải thiện đáng kể sự phân bố cholesterol trong huyết tương.
Dược động học Fenofibrat được hấp thu tốt từ đường dạ dày ruột sau khi uống. Trong một nghiên cứu ở người tình nguyện khoẻ mạnh, khoảng 80% liều duy nhất fenofibrat đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ xuất hiện trong nước tiểu chủ yếu dưới dạng acid fenofibric và các phức hợp glucuronide và 25% bài tiết trong phân. Nồng độ đỉnh trong huyết tương của acid fenofibric xảy ra trong vòng 6 đến 8 giờ sau khi uống. Không tìm thấy fenofibrat nguyên dạng trong huyết tương.
CÁC PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ATORVASTATIN, FENOFIBRAT Atovastatin, fenofibrat có thể xác định bằng nhiều phương pháp khác nhau như phương pháp quang học, phương pháp sắc ký, phương pháp von-ampe. Các phƣơng pháp xác định atorvastin Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) Atorvastatin trong các mẫu dược phẩm được xác định bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử dụng cột C18 [18,20,24], detector UV và detector huỳnh quang. Các tác giả đã sử dụng một số pha động có thành phần khác nhau như acetonnitril: nước cất (85:15) tại pH=4,5, khoảng tuyến tính của atorvastatin trong khoảng 2-12 mg/ml, hiệu suất thu hồi của atorvastatin được xác định là đạt 99,03% [24]; acetonitril: photphat (C = 0,015 M, pH = 3, tỉ lệ thể tích v/v = 45 : 55) [18] hay pha động là hỗn hợp acetonitril : nước = 48 : 52, = 2 được điều chỉnh bằng axit orthophotphoric, khoảng tuyến tính của thuốc là 0,04 - 0,4 mg/mL, hệ số tương quan là R2 = 0,999 [20]. Thời gian lưu của atorvastatin phụ thuộc vào thành phần pha động, detector sử dụng.
Phương pháp HPLC có ưu điểm rất cao về độ nhạy, độ chính xác cao, nhưng rất tốn kém do thiết bị đắt tiền và quy trình phân tích phức tạp. Phương pháp HPLC rất phù hợp với những phòng thí nghiệm kiểm soát chất lượng tuyến trung ương. Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử Baldha [19] và cộng sự đã sử dụng phương pháp quang phổ vùng tử ngoại để xác định atorvastatin trong thuốc ở hai bước sóng hấp thụ λ = 227 nm và 246,5 nm, khoảng tuyến tính từ 5 - 30 mcg/ml. Tác giả Jadhav đã xác định atorvastatin bằng cách cho tạo phức màu xanh với FeCl30,3 % và K3[Fe(CN)6]0,02 %.
Phức màu xanh được đo tại ước sóng hấp thụ cực đại 787 nm. Hiệu suất thu hồi atorvastatin canxi đạt được trong khoảng từ 99,26 % đến 100,12 % [19]. Phương pháp von-ampe Tác giả Ramadan [17] và cộng sự đã sử dụng phương pháp cực phổ xung vi phân trên điện cực giọt thủy ngân tĩnh (SMDE) để xác định atorvastatin trong mẫu dược phẩm. Các điều kiện đo được tiến hành ở pH = 7,5, biên độ xung 100mV, khoảng quét thế - 0,9 V ÷ -1,5V, bước thế 8 mV, thời gian xung 40 ms, tốc độ quét thế 5,714 mV/s, giới hạn phát hiện (LOD)là 0,024μg.ml-1 và giới hạn định lượng (LOQ) là 0,071 μg.ml-1, hiệu suất thu hồi từ 97,0 đến 100,5 %.
Tác giả Wli Mohammadi [23] đã xác định đồng thời amlodipin và atorvastatin canxi trên điện cực graphit được biến tính bề mặt bằng nano cacbon. So 6 với điện cực glassy cabon thì điện cực graphit có diện tích bề mặt và độ dẫn điện tốt hơn nên có độ nhạy tốt hơn. Bằng phương pháp Von-ampe hòa tan hấp phụ thì xác định được khoảng tuyến tính là 2,5 đến 100 µg/ml với độ lệch chuẩn của amlodipin là 2,7 đến 7,1% và đối với atorvastatin canxi là 1,8 đến 8,3%, giới hạn phát hiện đối với 2 chất là 1 µg/ml ở điều kiện pH=6. Các điện cực glassy các bon và điện cực graphene oxit đã được sử dụng để xác định atorvastatin trong môi trường pH từ 2,0 đến 4,5 bằng phương pháp von- ampe hòa tan hấp phụ.
Hơn nữa, điện cực rắn biến tính rất có triển vọng trong ứng dụng phân tích dược và môi trường vì điện cực rắn có khoảng làm việc rộng, không độc hại, thân thiện với môi trường, có thể tự chế tạo được. Các phƣơng pháp xác định fenofibrat Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử Tác giả [29] đã nghiên cứu xác định fenofibrat bằng phương pháp đo quang trong mẫu dược phẩm sử dụng hai thuốc thử khác nhau. Với thuốc thử methylen xanh (MTB) thì fenofibrat phản ứng với MTB trong dung môi cloroform và dùng dịch đệm axit phthalat pH = 2,4 tạo ra phức chất màu xanh, có cực đại hấp thụ là 630nm, khoảng tuyến tính tuân theo Định luật Beer là 5 đến 15 mg/ml với độ lệch chuẩn của phương pháp là 0,86%. Ở phương pháp thứ hai, cũng tiến hành như phương pháp đầu nhưng dựa trên phản ứng của fenofibrat với saffarin tạo thành phức màu hồng và độ hấp thụ quang đo được ở 520nm, khoảng tuyến tính thu được: 10 – 30µg/ml và độ lệch chuẩn của phương pháp là 0,903%.