ĐẶT VẤN ĐỀ Cùng với sự phát triển của xã hội, mô hình bệnh tật ngày càng trở nên phức tạp. Bệnh tật không chỉ làm rút ngắn tuổi thọ mà còn ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng cuộc sống con người. Khoa học và y – dược học ngày nay đã có những bước tiến vượt bậc và đạt được nhiều thành tựu to lớn trong việc ngăn ngừa và điều trị bệnh. Sự phát triển này đã góp phần phong phú hóa số lượng và đa dạng hóa chủng loại thuốc và thực phẩm bảo vệ sức khỏe (TPBVSK) trên thị trường, trong đó thuốc và sản phẩm có nguồn gốc thảo dược ngày càng tỏ ra ưu thế và chiếm được niềm tin của người sử dụng vì sự an toàn của các hợp chất thiên nhiên.
Tại Việt Nam, với mục tiêu bảo vệ, chăm sóc và nâng cao sức khỏe nhân dân, nhiều chính sách, chiến lược quốc gia trong lĩnh vực y – dược học được đưa ra, trong đó bảo tồn và phát triển ngành dược liệu Việt Nam là một định hướng quan trọng trong thời gian tới [6], [15]. Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.), họ Thủy tiên (Amaryllidaceae) là loại dược liệu quý được biết đến với tác dụng hỗ trợ điều trị u xơ tử cung, phì đại tuyến tiền liệt và ung thư tuyến tiền liệt [10]. Lá trinh nữ hoàng cung (TNHC) chứa nhiều thành phần, trong đó đáng quan tâm nhất là nhóm alkaloid vì có tác dụng sinh học, điển hình như crinamidin, ambellin, lycorin,.Sự hiện diện của TNHC được biểu thị qua hoạt chất đặc trưng điển hình, đồng thời là hoạt chất chính trong cây cho tác dụng sinh học là crinamidin. Chế phẩm chứa TNHC được bán tại các nhà thuốc, quầy thuốc, cửa hàng đông y, thậm chí cửa hàng tạp hóa và các kênh bán hàng online.
Mỗi chế phẩm lại có một công thức bào chế khác nhau, từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau, hệ quả là hàm lượng crinamidin trong từng chế phẩm cũng không như nhau. Trong khi tiêu chuẩn cho các chế phẩm này chưa được hoàn thiện, nhà sản xuất đã lợi dụng kẽ hở để trục lợi, sử dụng nhiều nguồn nguyên liệu không rõ nguồn gốc đưa vào sản xuất, sử dụng các nguyên liệu khác thay thế mà không có tác dụng sinh học theo công bố trên nhãn. Đây cũng chính là mấu chốt của vấn nạn thuốc và TPBVSK thật hay giả hiện đang là chủ đề mang tính thời sự, nhận được nhiều sự quan tâm của báo chí và dư luận thời gian qua. Vì vậy, việc tiêu chuẩn hóa chất lượng chế phẩm chứa TNHC là vô cùng quan trọng và cấp thiết.
1 Hiện nay, Dược điển Việt Nam IV bản bổ sung năm 2015 quy định hàm lượng crinamidin (C17H19NO5) trong nguyên liệu lá TNHC không thấp hơn 0,08% tính theo khối lượng khô kiệt bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [3], mà chưa đưa ra quy định đối với các chế phẩm chứa thành phần TNHC. Để xác định chất lượng sản phẩm TNHC, hàm lượng crinamidin là đại lượng quy chiếu được lựa chọn. Bên cạnh đó, phương pháp sắc ký khí khối phổ hai lần (GC- MS/MS) là phương pháp ưu việt, có khả năng xác định các hợp chất hữu cơ trong hỗn hợp với độ phân giải cao, chọn lọc và đặc hiệu hơn nhiều so với phương pháp HPLC. GC-MS/MS là phương pháp rất thích hợp cho việc định lượng hoạt chất trong các chế phẩm thuốc và TPBVSK với nền mẫu phức tạp đồng thời hàm lượng crinamidin giảm nhiều lần so với hàm lượng trong nguyên liệu lá TNHC.
Để góp phần kiểm soát chất lượng của các chế phẩm trên thị trường, đảm bảo quyền lợi của người sử dụng và sự chặt chẽ trong quản lý, chúng tôi thực hiện đề tài nghiên cứu: “Xác định hàm lượng crinamidin trong thuốc và thực phẩm bảo vệ sức khỏe bằng sắc ký khí khối phổ”, với các mục tiêu sau: 1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng crinamidin trong thuốc và TPBVSK bằng sắc ký khí khối phổ. Ứng dụng phương pháp xây dựng để xác định hàm lượng crinamidin trong thuốc và TPBVSK. Tổng quan về cây trinh nữ hoàng cung 1.
Đặc điểm thực vật Cây trinh nữ hoàng cung (TNHC), còn gọi là hoàng cung trinh nữ, tây nam văn châu lan, thập bát học sĩ (Trung Quốc), tỏi Thái Lan, tỏi lơi lá rộng, có tên khoa học là Crinum latifolium L., thuộc họ Thủy tiên (Amaryllidaceae) [7], [10]. TNHC là một loại cây cỏ, thân hành như củ hành tây to, đường kính 10 – 15cm, bẹ lá úp vào nhau thành một thân giả dài 10 – 15cm, có nhiều lá mỏng kéo dài từ 80 – 100cm, rộng 3 – 8cm, hai bên mép lá lượn sóng. Gân lá song song, mặt trên lá lõm thành rãnh, mặt dưới lá có một sống lá nổi rất rõ, đầu bẹ lá nơi sát đất có màu đỏ tím. Hoa mọc thành tán gồm 6 – 18 hoa, trên một cán hoa dài 30 – 60cm.
Cánh hoa màu trắng có điểm màu tím đỏ, từ thân hành mọc rất nhiều củ con có thể tách ra trồng riêng dễ dàng [10], [14], [39].1: Cây trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L. Nguồn gốc và phân bố, bộ phận sử dụng TNHC là cây ưa ẩm, ưa sáng hoặc có thể chịu bóng một phần, sinh trưởng và phát triển tốt trong điều kiện khí hậu nóng và ẩm của vùng nhiệt đới. Cây TNHC hiện được trồng rộng rãi ở nhiều nước trong khu vực như Thái Lan, Malaysia, Philippin, Campuchia, Lào, Việt Nam, Ấn Độ, Trung Quốc. Ở Việt Nam, cây mọc hoang ven suối trong rừng một số nơi thuộc tỉnh Đồng Nai và Bà Rịa-Vũng Tàu, tự mọc và được trồng chủ yếu ở Huế, Đà Nẵng, Nha Trang và một số tỉnh phía Nam, sau được trồng ở các tỉnh phía Bắc [7], [18].
TNHC được xếp vào nhóm Thanh nhiệt giải độc [5]. Bộ phận sử dụng là lá (Folium Crinii latifolii) dùng tươi hay phơi hoặc thái nhỏ sao vàng dùng dần. Thành phần hóa học của cây Crinum latifolium L. Các nhà khoa học Ấn Độ, Nhật Bản và Việt Nam đã nghiên cứu thành phần hóa học của cây Crinum latifolium L.
như sau: + Crinum latifolium L. Ấn Độ: 11-O-Acetylambellin, 11-O-Acetyl-1,2-β- epoxyambellin, Ambelin, Crinafolidin, Crinafolin, (-) 2-Epilycorin, 2- Epipancrassidin, 1,2-β-epoxyambellin, Hippadin (Pratorin, Alkalois N3), Latindin, Latisodin, Latisolin (Latisodin-O-β-D-glucopyranosyl), (-) Lycorin, (-) Lycorin-1- 0-β-glucosid, Pratorimin, Pratorinin, Pratosin, Pseudolycorin-1-0-β-D-glucosid [27]. Nhật Bản: 3-O-Acetylhamayn, (-) Acetyllycorin, Cheryllin (S), (+) Crinamin, (-) Crinin (Vittatin, Crinidin), Hamayn (Bulbispermin, Demethylcrinamin), Hipeastrin, Latifin (S), Powellin, Undulatin [35]. Việt Nam: 9-Octadecenamid, Dihydro-oxo- demethoxyhaemanthamin, Augustamin, Oxoassoanin, Crinan-3-α-ol, Buphannidrin, Powellin, Undulatin, Ambellin, 6-hydroxybuphannidrin, 1β,2β-epoxyambellin, 6-hydroxycrinamidin, Epoxy-3,7-dimethoxycrinan-11-one, Lycorin và Pratorin (Hippadin) và các flavonoid: 4’7-dihydroxy-3-vinyloxyflavan, 4’7-dihydroxyflavan, kaemperol-3-O-β-glucopyranosid [8], [14], [39].
Từ lá cây TNHC, Võ Thị Bạch Huệ cũng đã tách được 18 vết bằng kỹ thuật sắc ký ghép khối phổ, trong đó xác định được cấu trúc của 3 vết là ambellin, 4 crinamidin và 6 – OH – crinamidin sau khi so sánh thời gian lưu, khối phổ với 3 alkaloid đơn chất [8]. Thành phần hóa học khác của cây Crinum latifolium L. Nhật Bản có Glucan a và Glucan b. Việt Nam có 32 chất bay hơi và saponin, acid hữu cơ, amino acid, p-hydroxycinnamat metyl, 3,4’-dihydroxycinnamat ethyl, keampferol- 3-4-di-O-β-D-glucopyranosit.
Tác dụng sinh học Ở Ấn Độ, người ta dùng bẹ của cây xào nóng giã đắp làm thuốc trị bệnh thấp khớp; cũng dùng đắp mụn nhọt và áp xe để gây mưng mủ. Còn dịch lá dùng làm thuốc nhỏ tai chữa đau tai [18]. Từ những năm 1989 – 1990, người dân Việt Nam đã biết cách sử dụng TNHC để chữa những trường hợp u xơ và ung thư cổ tử cung (ở phụ nữ) và ung thư tuyến tiền liệt (ở nam giới) [10], [31]. TNHC còn được sử dụng để hỗ trợ điều trị bệnh u xơ tử cung, ung thư vú, tử cung, dạ dày, phổi và tuyến tiền liệt, viêm da lở loét, dị ứng mẩn ngứa.
Hoạt tính chống oxi hóa, giảm đau, chống viêm, chống lại sự tăng sinh quá mức của các tế bào và sự phát triển của khối u [32]. Ngoài ra còn có khả năng chống ngưng kết tiểu cầu, chống độc tế bào [29], ức chế sự hình thành mạch máu của các tế bào nội mô tĩnh mạch rốn của người (HUVECs) và điều hòa hệ miễn dịch của cơ thể [33], [40]. Các tác giả Nguyễn Thị Ngọc Trâm, E. Zvetkova và cộng sự cũng đã chứng minh dịch chiết nước nóng từ lá cây TNHC Việt Nam có thể kích thích hữu hiệu sự sinh sản của tế bào lympho T và đặc biệt có tác dụng kích thích trực tiếp lên các tế bào TCD3, TCD4 invitro [20].
Lá tươi và thân hành dùng ngoài, hơ nóng xoa bóp vào chỗ sưng đau do thấp khớp, sang chấn [3]. Tổng quan về crinamidin Crinamidin là alkaloid trong cây TNHC (Crinum latifolium L.), có công thức cấu tạo như hình 1.2: Công thức cấu tạo crinamidin Bảng 1.1: Tính chất lý hóa và tác dụng sinh học của crinamidin Crinamidin Công thức phân tử C17H19NO5 (Khối lượng phân (M = 317,34 g/mol) tử) Tên IUPAC (1β,2β,3α)-7-Methoxy-1,2-epoxycrinan-3-ol Phổ IR có các băng hấp thụ cực đại (cm-1) ở 3200 – 3400 (- OH), 1499, 1278 (epoxy), 1035, 918 (-OCH2O-), 802 (epoxy). Phổ hấp thụ Phổ UV – VIS có bước sóng hấp thụ cực đại ở 220 và 285 nm. Phổ HR – MS cho mảnh có số khối 318,1369 m/z tương ứng với mảnh ion phân tử giả [M+H]+ [19], [26].
Tính chất vật lý, hóa Crinamidin là chất bột kết tinh màu trắng, điểm chảy 215 – học 217oC, – 10o (CHCl3; 0,1 g/ml) [19], [26]. 6 Crinamidin là một alkaloid trong cây TNHC, cùng với các alkaloid khác cho tác dụng hỗ trợ điều trị ung thư tử cung, ung thư tuyến tiền liệt, kháng khối u, kháng viêm, chống oxi hóa và kích thích miễn dịch [20], [32]. Các nhà khoa học đã chứng minh tác dụng đối một số bệnh ung thư như ung thư vú, tử cung, dạ dày, phổi và các bệnh Tác dụng sinh học viêm da lở loét, dị ứng mẩn ngứa, chống oxi hóa, giảm đau, chống viêm, chống lại sự tăng sinh quá mức của các tế bào và sự phát triển của khối u [32]. Ngoài ra còn có khả năng chống ngưng kết tiểu cầu, chống độc tế bào [29], ức chế sự hình thành mạch máu của các tế bào nội mô tĩnh mạch rốn của người [33], [40].
Một số nghiên cứu xác định crinamidin Các nghiên cứu xác định crinamidin bao gồm khảo sát, định tính, định lượng và tinh chế, trong đó có tiêu chuẩn DĐVN IV đưa ra quy định về hàm lượng crinamidin trong lá TNHC. Kỹ thuật chính được sử dụng để định lượng là HPLC. Kỹ thuật GC-MS được sử dụng để khảo sát thành phần trong cây và định tính. Chưa có nghiên cứu về định lượng crinamidin bằng GC-MS/MS.
Các nghiên cứu xác định crinamidin được tổng hợp trong bảng 1.