Luận văn thạc sĩ: Nghiên cứu phân loại nấm men Moniliella phân lập tại Việt Nam

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu phân loại nấm men Moniliella phân lập tại Việt Nam, cung cấp cái nhìn sâu sắc về sinh học và ứng dụng.

• Tác giả: Đinh Đức Hiền
• Người hướng dẫn: PGS. Vũ Nguyên Thành
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Nghiên cứu phân loại nấm men Moniliella phân lập tại Việt Nam
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Nhóm nấm men đen
• 1.2. Một số chi nấm men đen
• 1.3. Một số phương pháp phân loại nấm men
• 1.3.1. Các phương pháp phân loại truyền thống
• 1.3.2. Các phương pháp hóa phân loại và sinh học phân tử
• 1.4. Một số phương pháp phát hiện và đánh giá đa dạng vi sinh vật
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Hóa chất, dụng cụ, trang thiết bị máy móc
• 2.1.1. Dụng cụ và trang thiết bị, máy móc
• 2.2. Thành phần môi trường sử dụng trong nghiên cứu
• 2.2.1. Môi trường làm giàu có nồng độ đường cao
• 2.2.2. Môi trường Malt-Glucose 2°Bx có axit lactic 1‰
• 2.2.3. Môi trường Malt-Glucose 2°Bx không có axit lactic
• 2.2.4. Môi trường thử khả năng chuyển hóa các nguồn cacbon khác nhau
• 2.2.5. Môi trường thử khả năng đồng hóa các nguồn nitơ khác nhau
• 2.2.6. Thử khả năng sinh trưởng trên môi trường có nồng độ đường và muối cao
• 2.2.7. Môi trường xác định khả năng sinh trưởng trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau
• 2.2.8. Môi trường thử khả năng hình thành tinh bột
• 2.2.9. Môi trường đánh giá hoạt tính phân giải urea
• 2.2.10. Môi trường đánh giá khả năng sinh trưởng khi có mặt Cycloheximide
• 2.2.11. Môi trường đánh giá khả năng chống chịu acid acetic 1 %
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Phương pháp phân lập
• 2.3.2. Quan sát hình thái khuẩn lạc, tế bào
• 2.3.3. Phương pháp tách chiết DNA tế bào nấm men
• 2.3.4. Phương pháp tinh chế DNA
• 2.3.5. Phương pháp tiến hành phản ứng PCR fingerprinting
• 2.3.6. Phương pháp điện di
• 2.3.7. Nhuộm gel và đọc kết quả
• 2.3.8. Phương pháp phân loại nấm men dựa vào đọc trình tự rDNA
• 2.3.9. Đánh giá khả năng sử dụng nguồn cacbon khác nhau
• 2.3.10. Đánh giá khả năng đồng hóa các nguồn nito khác nhau
• 2.3.11. Đánh giá khả năng sinh trưởng trên môi trường có nồng độ đường và nồng độ muối cao
• 2.3.12. Đánh giá khả năng sinh trưởng trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau
• 2.3.13. Thử khả năng hình thành tinh bột
• 2.3.14. Thử khả năng phân giải urea
• 2.3.15. Thử khả năng chống chịu với cycloheximide
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Kết quả phân lập
• 3.2. Quan sát hình thái khuẩn lạc, tế bào
• 3.3. Phân nhóm bằng kỹ thuật fingerprinting
• 3.4. Mô tả các nhóm loài mới thuộc chi Moniliella
• 3.4.1. Phân tích đặc tính di truyền của 3 loài mới
• 3.4.2. Đặc tính kiểu hình, sinh lý, sinh hóa của 3 loài mới
• 3.5. Sự đa dạng Moniliella phân lập tại Việt Nam
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu phân loại nấm men Moniliella tại Việt Nam

Nấm men Moniliella là một nhóm vi sinh vật quan trọng trong ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm. Nghiên cứu về phân loại nấm men Moniliella tại Việt Nam đã được thực hiện nhằm xác định sự đa dạng và phân bố của các loài nấm men này. Chi Moniliella được thiết lập từ năm 1966 và hiện nay đã có nhiều loài được mô tả. Việc phân loại chính xác các loài nấm men Moniliella không chỉ giúp hiểu rõ hơn về hệ sinh thái mà còn mở ra cơ hội ứng dụng trong công nghệ sinh học.

1.1. Đặc điểm sinh học và phân loại của nấm men Moniliella

Nấm men Moniliella có đặc điểm hình thái đa dạng, thường sinh sản vô tính bằng cách nảy chồi. Chúng có thể được tìm thấy trong các môi trường giàu đường và dầu mỡ. Việc phân loại nấm men Moniliella dựa trên các đặc điểm hình thái và di truyền, giúp xác định mối quan hệ giữa các loài.

1.2. Lịch sử nghiên cứu nấm men Moniliella tại Việt Nam

Nghiên cứu về nấm men Moniliella tại Việt Nam bắt đầu từ những năm gần đây, với mục tiêu phân lập và phân loại các loài nấm men này từ các nguồn mẫu khác nhau. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng Moniliella có sự phân bố rộng rãi và đa dạng tại nhiều địa phương.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu nấm men Moniliella

Mặc dù nấm men Moniliella có nhiều ứng dụng tiềm năng, nhưng việc phân loại và nghiên cứu chúng vẫn gặp nhiều thách thức. Sự đa dạng di truyền cao giữa các loài Moniliella gây khó khăn trong việc xác định và phân loại chính xác. Hơn nữa, các phương pháp phân loại truyền thống không đủ để giải quyết vấn đề này.

2.1. Khó khăn trong việc phân loại nấm men Moniliella

Sự khác biệt di truyền giữa các loài Moniliella có thể lên tới 15-16%, điều này làm cho việc phân loại trở nên phức tạp. Các phương pháp phân loại hiện tại cần được cải tiến để đáp ứng yêu cầu nghiên cứu.

2.2. Thiếu thông tin về sự phân bố của nấm men Moniliella

Thông tin về sự phân bố của các loài nấm men Moniliella tại Việt Nam còn hạn chế. Việc thu thập mẫu từ nhiều địa điểm khác nhau là cần thiết để có cái nhìn tổng quan về sự đa dạng của chúng.

III. Phương pháp nghiên cứu phân loại nấm men Moniliella

Để phân loại nấm men Moniliella, nhiều phương pháp đã được áp dụng, bao gồm phân lập, quan sát hình thái, và phân tích di truyền. Các phương pháp này giúp xác định các loài nấm men và mối quan hệ giữa chúng.

3.1. Phương pháp phân lập nấm men Moniliella

Phân lập nấm men Moniliella từ các mẫu môi trường khác nhau là bước đầu tiên trong nghiên cứu. Các mẫu được thu thập từ thực phẩm lên men, mật ong, và các nguồn khác để đảm bảo sự đa dạng.

3.2. Phân tích di truyền và hình thái

Phân tích di truyền thông qua phương pháp PCR fingerprinting giúp xác định mối quan hệ di truyền giữa các loài. Đồng thời, quan sát hình thái khuẩn lạc cũng cung cấp thông tin quan trọng về đặc điểm của từng loài.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn của nấm men Moniliella

Kết quả nghiên cứu cho thấy sự đa dạng cao của nấm men Moniliella tại Việt Nam. Các loài nấm men này không chỉ có giá trị trong nghiên cứu mà còn có tiềm năng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm và dược phẩm.

4.1. Đánh giá sự đa dạng của nấm men Moniliella

Nghiên cứu đã xác định được nhiều loài nấm men Moniliella mới, góp phần làm phong phú thêm hệ thống phân loại. Sự đa dạng này cũng cho thấy khả năng thích nghi của chúng trong các môi trường khác nhau.

4.2. Ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm

Nấm men Moniliella được sử dụng trong sản xuất erythritol, một loại đường chức năng có giá trị thương mại cao. Việc ứng dụng nấm men này trong công nghiệp thực phẩm hứa hẹn mang lại nhiều lợi ích.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu nấm men Moniliella

Nghiên cứu về nấm men Moniliella tại Việt Nam đã mở ra nhiều cơ hội mới trong lĩnh vực vi sinh vật học và công nghệ sinh học. Việc tiếp tục nghiên cứu và phát triển các ứng dụng của nấm men này là cần thiết để khai thác tiềm năng của chúng.

5.1. Tương lai của nghiên cứu nấm men Moniliella

Nghiên cứu trong tương lai cần tập trung vào việc phát hiện thêm nhiều loài mới và cải tiến các phương pháp phân loại. Điều này sẽ giúp làm rõ hơn về sự đa dạng và vai trò của nấm men Moniliella trong tự nhiên.

5.2. Khuyến nghị cho nghiên cứu tiếp theo

Cần có sự hợp tác giữa các nhà nghiên cứu và các tổ chức để thúc đẩy nghiên cứu về nấm men Moniliella. Việc chia sẻ thông tin và tài nguyên sẽ giúp nâng cao hiệu quả nghiên cứu và ứng dụng.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Nghiên cứu phân loại vi sinh vật đóng vai trò nền tảng trong việc khám phá và bảo tồn nguồn tài nguyên sinh học phục vụ công nghệ sinh học hiện đại. Chi nấm men đen Moniliella là nhóm vi sinh vật đặc biệt với khả năng chịu áp suất thẩm thấu cao và tiềm năng chuyển hóa vượt trội, nhưng hệ thống phân loại của chi này tồn tại nhiều khoảng trống khi mức độ sai khác di truyền giữa các loài lên tới 15% đến 16% ở đoạn gen D1/D2 LSU rRNA. Trước thời điểm nghiên cứu, toàn thế giới mới chỉ ghi nhận 9 loài thuộc chi Moniliella, trong khi nguồn gen bản địa tại Việt Nam chưa từng được khảo sát toàn diện.

Được thực hiện trong giai đoạn từ năm 2012 đến năm 2014, đề tài tập trung khảo sát 1.653 mẫu sinh học đa dạng thu thập tại 12 tỉnh thành trải dài từ Bắc vào Nam như Hà Nội, Hải Dương, Quảng Ninh, Lâm Đồng, Bình Thuận và Phú Yên. Mục tiêu trọng tâm của nghiên cứu là phân lập các chủng nấm men Moniliella bản địa, ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại kết hợp phương pháp phân loại truyền thống để định danh, phân tích mối quan hệ phát sinh loài và phát hiện các loài mới.

Kết quả đã phân lập thành công 126 chủng nấm men đen từ 55 mẫu dương tính, đạt tỷ lệ phát hiện trung bình khoảng 3,3%. Đề tài xác lập cơ sở khoa học vững chắc khi mô tả 3 nhóm loài mới cho khoa học, bổ sung dữ liệu phân loại quốc tế và cung cấp nguồn chủng giống giá trị cao cho đề tài cấp Nhà nước về sản xuất đường chức năng erythritol, enzyme lipase và chất kháng sinh tự nhiên zymocin.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu tích hợp hai trục lý thuyết chính gồm lý thuyết phân loại học nấm men truyền thống của Kurtzman và lý thuyết phát sinh chủng loại học phân tử hiện đại:

• Lý thuyết phân loại truyền thống: Dựa trên đặc điểm hình thái tế bào, phương thức sinh sản vô tính tạo bào tử đốt hoặc nảy chồi, và các chỉ số hóa sinh như khả năng đồng hóa 42 nguồn carbon, 5 nguồn nitơ, khả năng thủy phân urea, sinh sắc tố melanin và tính chịu áp suất thẩm thấu ở nồng độ glucose 50% đến 60%.
• Lý thuyết phát sinh loài phân tử: Ứng dụng phân tích đa hình các đoạn DNA vệ tinh microsatellite và giải trình tự nucleotide của các vùng gen bảo thủ gồm vùng D1/D2 của 26S rDNA và vùng đệm phiên mã nội ITS để xác định khoảng cách di truyền với ngưỡng sai khác loài chuẩn trên 1%.
• Các khái niệm cốt lõi: Nấm men đen (black yeasts), nấm men ưa thẩm thấu (osmophilic yeasts), chỉ số đa hình phân tử (fingerprinting pattern), zymocin và chất tạo ngọt erythritol.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu thực nghiệm được thu thập từ cỡ mẫu lớn gồm 1.653 mẫu tự nhiên, phân chia thành 3 nhóm sinh thái chính: 615 mẫu hoa và côn trùng, 329 mẫu tương truyền thống, cùng 709 mẫu bàn thái thịt và môi trường giàu lipid. Phương pháp chọn mẫu có chủ đích được áp dụng nhằm tối ưu hóa khả năng thu thập nấm men chịu thẩm thấu và ưa dầu mỡ tại 12 vùng sinh thái khác nhau.

Quy trình phân tích được thực hiện nghiêm ngặt qua 4 bước:

• Làm giàu và phân lập: Mẫu được nuôi cấy làm giàu trong môi trường glucose 50 độ Bx ở 28 độ C từ 3 đến 10 ngày, sau đó cấy gạt phân lập trên môi trường Malt-Glucose 2 độ Bx bổ sung acid lactic 1‰ để tạo pH 4,5 nhằm ức chế triệt để vi khuẩn tạp nhiễm.
• Phân nhóm nhanh bằng PCR Fingerprinting: Tách chiết DNA bằng phương pháp phá vỡ tế bào bằng hạt thủy tinh kết hợp Phenol/Chloroform và tinh chế qua cột Silica. Phản ứng PCR sử dụng mồi MST2 mang trình tự 5 prime GAC 5 3 prime giúp phân nhóm nhanh các chủng ở cấp độ dưới loài.
• Giải trình tự gen và phân tích phả hệ: Khuếch đại vùng D1/D2 và ITS bằng các cặp mồi NL1/NL4 và ITS1/ITS4. Trình tự được xử lý bằng phần mềm BioEdit, Vector NTI và xây dựng cây phát sinh loài bằng phần mềm MEGA 5.3 theo thuật toán Neighbor-Joining.
• Kiểm tra sinh lý sinh hóa: Đánh giá khả năng lên men, đồng hóa dưỡng chất, khả năng chịu nồng độ muối 10% NaCl, chịu acid acetic 1% và kháng kháng sinh cycloheximide 0,1%.

Lý do lựa chọn phương pháp: Kỹ thuật PCR Fingerprinting với mồi MST2 mang lại độ phân giải cao dưới mức loài với chi phí tối ưu, cho phép sàng lọc nhanh 126 chủng thành các nhóm đại diện trước khi tiến hành giải trình tự gen chuẩn xác.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Nghiên cứu mang lại 4 phát hiện khoa học quan trọng đóng góp vào hệ thống vi sinh vật học:

• Thứ nhất, hiệu suất phân lập nấm men Moniliella đạt tỷ lệ 3,3% trên tổng số 1.653 mẫu, thu nhận 126 chủng thuần khiết có khả năng thích nghi cao trong môi trường giàu đường và chất béo.
• Thứ hai, phương pháp PCR Fingerprinting với mồi MST2 đã phân chia thành công 126 chủng thành 25 nhóm di truyền riêng biệt, chứng minh sự đa dạng di truyền vượt trội của nguồn gen nấm men đen tại Việt Nam so với các công bố quốc tế trước đó.
• Thứ ba, phân tích giải trình tự vùng D1/D2 của 26S rDNA và vùng ITS đã phát hiện và mô tả thành công 3 loài mới hoàn toàn cho khoa học, gồm Moniliella carnis, Moniliella dehoogii và Moniliella byzovii, với độ sai khác trình tự nucleotide đều lớn hơn 1% so với các loài chuẩn CBS và NRRL.
• Thứ tư, quy luật phân bố sinh thái thể hiện sự khác biệt rõ rệt theo vĩ độ và khí hậu: Tần suất phân lập tại vùng khí hậu nhiệt đới phía Nam đạt 10,6% (20/188 mẫu), cao gấp hơn 3,2 lần so với vùng cận nhiệt đới phía Bắc với 3,3% (14/420 mẫu), trong khi vùng núi cao ôn đới Đà Lạt ghi nhận 0% (0/43 mẫu). Tại Hà Nội, tần suất bắt gặp vào mùa hè đạt 5,8% (3/52 mẫu) nhưng hoàn toàn không phát hiện vào mùa đông (0/45 mẫu).

Dữ liệu phân bố sinh thái và sự phân nhánh di truyền giữa các nhóm chủng có thể được trực quan hóa tối ưu thông qua sơ đồ cây phát sinh loài và biểu đồ cột so sánh tần suất xuất hiện theo mùa và vùng địa lý.

Thảo luận kết quả

Sự sai khác rõ rệt về tần suất phân lập giữa các vùng sinh thái được giải thích bởi vai trò trung gian truyền dẫn của côn trùng thụ phấn. Khí hậu nhiệt đới phía Nam và mùa hè ấm áp ở miền Bắc tạo điều kiện tối ưu cho côn trùng hoạt động mạnh mẽ, từ đó phát tán bào tử nấm men từ hoa này sang hoa khác. Ngược lại, nhiệt độ thấp tại Đà Lạt hoặc mùa đông miền Bắc làm suy giảm hoạt động của côn trùng, khiến nấm men không thể phát tán rộng rãi.

Về mặt hóa sinh và sinh lý, toàn bộ các chủng phân lập đều có khả năng sinh trưởng tốt ở môi trường nồng độ glucose 50% đến 60%, dương tính với phản ứng urease và chịu được acid acetic 1%. Khả năng này tương thích hoàn toàn với các mô tả của Rosa và cộng sự năm 2009 về các chủng Moniliella chịu áp suất thẩm thấu cao.

Việc phát hiện 3 loài mới có ý nghĩa phân loại học đặc biệt quan trọng, giúp thiết lập các mắt xích tiến hóa trung gian nhằm giải thích khoảng cách sai khác di truyền 15% đến 16% vốn gây tranh cãi trong phân loại học nấm men thế giới. Đồng thời, nguồn chủng bản địa này mở ra triển vọng lớn cho công nghệ sản xuất đường erythritol đạt hiệu suất cao và tổng hợp hương tự nhiên gamma-decalactone lên tới 180 mg trên mỗi kg chất khô.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các phát hiện thực nghiệm, đề tài đưa ra 4 khuyến nghị hành động cụ thể nhằm thương mại hóa và phát triển nguồn gen:

• Mở rộng phạm vi thu thập mẫu: Triển khai thu thập thêm tối thiểu 500 mẫu tại các hệ sinh thái rừng ngập mặn và các cơ sở sản xuất thực phẩm lên men truyền thống phía Nam nhằm gia tăng ngân hàng chủng giống lên trên 300 chủng trong vòng 12 đến 24 tháng tới. Chủ thể thực hiện là Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp thuộc Viện Công nghiệp Thực phẩm.
• Tối ưu hóa công nghệ lên men đường erythritol: Thiết lập quy trình công nghệ lên men chìm sử dụng các chủng Moniliella mới phân lập trên cơ chất tinh bột sắn thủy phân, hướng tới mục tiêu đạt hiệu suất chuyển hóa cơ chất trên 45% trong thời gian 18 tháng. Chủ thể thực hiện là các nhóm nghiên cứu công nghệ vi sinh phối hợp cùng các viện nghiên cứu chuyên ngành.
• Đăng ký lưu giữ chuẩn quốc tế: Hoàn thiện hồ sơ định danh và gửi mẫu giống chuẩn của 3 loài mới tới Bảo tàng giống Vi sinh vật Hà Lan CBS và Bảo tàng giống Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ NRRL trong quý 1 năm tiếp theo. Chủ thể thực hiện là nhóm tác giả và Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội.
• Khai thác hoạt chất sinh học zymocin và lipase: Tiến hành thử nghiệm tinh sạch enzyme lipase và độc tố kháng nấm zymocin trên quy mô pilot để ứng dụng trong bảo quản nước quả ép tự nhiên, giúp giảm thiểu 80% nguy cơ hư hỏng do nấm men dại trong thời gian 12 tháng. Chủ thể thực hiện là các doanh nghiệp chế biến thực phẩm và nước giải khát.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung luận văn mang lại giá trị học thuật và ứng dụng thực tiễn cao cho 4 nhóm đối tượng chính:

• Giảng viên và nhà nghiên cứu vi sinh vật học: Cung cấp nguồn tài liệu tham khảo chuẩn mực về phương pháp phân loại học đa pha, kết hợp giữa đặc tính hình thái, sinh hóa và công cụ chỉ thị phân tử để giải quyết các taxon vi sinh vật phức tạp.
• Học viên cao học và nghiên cứu sinh chuyên ngành Sinh học phân tử: Nắm bắt chi tiết quy trình thực hành tách chiết DNA từ nấm men đen vỏ dày, kỹ thuật PCR Fingerprinting với mồi MST2 và cách thức phân tích dữ liệu cây phát sinh loài bằng phần mềm chuyên dụng MEGA.
• Kỹ sư R&D tại các doanh nghiệp thực phẩm và dược phẩm: Tiếp cận quy trình sàng lọc và khai thác các chủng nấm men bản địa phục vụ sản xuất đường chức năng erythritol không calo cho người ăn kiêng và bệnh nhân tiểu đường.
• Cán bộ kỹ thuật kiểm soát chất lượng và công nghệ sinh học môi trường: Ứng dụng các đặc tính kháng nấm của zymocin và khả năng đồng hóa lipid của Moniliella để xử lý chất thải hữu cơ giàu dầu mỡ và bảo quản thực phẩm tự nhiên.

Câu hỏi thường gặp

Nấm men đen Moniliella có đặc điểm hình thái và sinh hóa nào nổi bật?

Nấm men Moniliella sở hữu thành tế bào nhiều lớp chứa sắc tố melanin tạo màu từ vàng xanh đến đen xám đặc trưng. Chúng có khả năng sinh sản vô tính bằng nảy chồi kết hợp phân đốt tạo bào tử, phản ứng dương tính với Diazonium Blue B, đồng hóa nitrat, sinh enzyme urease và chịu được áp suất thẩm thấu ở nồng độ glucose 60%.

Tại sao nghiên cứu sử dụng kỹ thuật PCR Fingerprinting trước khi giải trình tự gen?

Do chi phí giải trình tự toàn bộ 126 chủng là rất lớn, kỹ thuật PCR Fingerprinting với mồi MST2 mang trình tự 5 prime GAC 5 3 prime được lựa chọn làm công cụ sàng lọc nhanh. Phương pháp này có độ phân giải cao dưới mức loài, giúp gom 126 chủng thành 25 nhóm di truyền đại diện trước khi đọc trình tự gen.

Môi trường làm giàu glucose 50 độ Bx đóng vai trò gì trong quá trình phân lập?

Môi trường nồng độ đường cực cao 50 độ Bx tạo áp suất thẩm thấu lớn, đóng vai trò như một màng lọc sinh học chọn lọc. Môi trường này ức chế hầu hết các loại vi khuẩn và nấm men thông thường, chỉ cho phép các chủng nấm men đen ưa thẩm thấu phát triển mạnh mẽ, giúp nâng cao hiệu quả phân lập.

Đường chức năng erythritol sản xuất từ Moniliella có ưu điểm gì so với các loại đường khác?

Erythritol là đường 4 carbon tự nhiên có vị ngọt thanh tương đương 70% đến 80% đường sucrose nhưng mức năng lượng gần như bằng 0 calo. Khác với xylitol hay sorbitol, erythritol hấp thu nhanh qua ruột non và đào thải qua đường bài tiết nên hoàn toàn không gây rối loạn tiêu hóa hay đầy hơi.

Vì sao tần suất phân lập Moniliella ở miền Nam lại cao gấp 3 lần miền Bắc?

Yếu tố nhiệt độ và độ ẩm quanh năm tại miền Nam duy trì mật độ hoạt động liên tục của các loài côn trùng thụ phấn như ong, bướm và kiến. Côn trùng hoạt động như vật chủ trung gian mang bào tử nấm men từ mật hoa phát tán đến các sinh cảnh mới, tạo nên tần suất phân lập cao vượt trội 10,6%.

Kết luận

• Luận văn đã hoàn thành xuất sắc việc khảo sát quy mô lớn 1.653 mẫu sinh học tại 12 tỉnh thành Việt Nam, phân lập thành công 126 chủng nấm men đen Moniliella.
• Ứng dụng thành công phương pháp phân loại học đa pha, phân chia 126 chủng thành 25 nhóm di truyền bằng kỹ thuật PCR Fingerprinting với mồi MST2.
• Đóng góp to lớn cho phân loại học thế giới thông qua việc phát hiện và mô tả đặc tính sinh học của 3 loài mới: Moniliella carnis, Moniliella dehoogii và Moniliella byzovii.
• Chứng minh tiềm năng ứng dụng công nghệ vượt trội của các chủng bản địa trong sản xuất đường ăn kiêng erythritol, enzyme lipase và chất kháng nấm zymocin.
• Kế hoạch tiếp theo cần tập trung hoàn thiện quy trình công nghệ lên men quy mô pilot trong 18 tháng tới nhằm thương mại hóa sản phẩm, mời các đơn vị nghiên cứu và doanh nghiệp cùng hợp tác khai thác nguồn gen quý giá này.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Chi Moniliella đƣợc thiết lập bởi bởi Stolk và Dakin năm 1966 để xác lập vị trí phân loại cho 2 loài mới tìm đƣợc khi đó là Moniliella acetoabutens và Moniliella tomentosa. Năm 2009, căn cứ vào sự tƣơng đồng nhất định về di truyền cũng nhƣ một số đặc tính sinh lý, sinh hóa quan trọng, Rosa và cộng sự đã xếp một chi khác là Trichosporonoides vào Moniliella. Nhƣ vậy, trƣớc khi nghiên cứu của chúng tôi đƣợc thực hiện, chi Moniliella bao gồm 9 loài, đó là Moniliella acetoabutens, M. Phân loại của Moniliella thực sự vẫn chƣa rõ ràng.

Trình tự gần nhất của Moniliella fonsecae trong Genbank là Phylloporia pectinata, một thành viên của Agaricomycotina. Với những trình tự khác, Moniliella thuộc Ustilagionomycotina. Hơn nữa, sự khác biệt về mặt di truyền giữa các loài thuộc chi Moniliella lại rất lớn, có thể tới 15-16% trong đoạn D1/D2. Do vậy việc tìm kiếm những loài trung gian giữa các loài đã biết sẽ góp phần làm sáng tỏ phân loại của Moniliella.

Moniliella đƣợc sử dụng trong công nghiệp sản xuất erythriltol, một loại đƣờng chức năng có giá trị thƣơng mại cao. Gần đây, Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp, Viện Công nghiệp Thực phẩm đã phát hiện một số đặc tính công nghệ ít hoặc chƣa đƣợc biết tới của Moniliella nhƣ khả năng chuyển hóa thầu dầu thành γ-declactone (tinh dầu đào) với độ tinh khiết cao, khả năng sinh lipase, khả năng sinh một loại kháng sinh (zymocin) mới. Các nội dung nghiên cứu trong bản luận văn này đƣợc thực hiện nhằm đánh giá đa dạng nấm men Moniliella tại Việt Nam, góp phần củng cố hệ thống phân loại của chi và tạo cơ sở cho nghiên cứu công nghệ có sử dụng Moniliella, cụ thể những nội dung nghiên cứu bao gồm: - Phân lập nấm men Moniliella từ các nguồn mẫu khác nhau tại các địa điểm khác nhau ở Việt Nam. - Phân nhóm, phân loại Moniliella phân lập đƣợc bằng hình thái; PCR fingerprinting; giải trình tự DNA; phân tích cây phả hệ.

- Phân tích sự đa dạng nấm men Moniliella phân lập tại Việt Nam về số loài, phân bố. K20 – Vi sinh vật học 1 Đinh Đức Hiền LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ Chƣơng 1 - TỔNG QUAN 1. Nhóm nấm men đen Nấm men đen đƣợc phát hiện từ khoảng đầu thế kỷ 20 nhƣng khi đó ngƣời ta mới chỉ biết đến một vài chi trong số chúng. Nấm men đen sinh sản vô tính là chủ yếu, bằng nảy chổi, tạo sợi hay mô phân sinh.

Điều tạo nên sự khác biệt giữa chúng và các nhóm nấm men khác là chúng có melanin trong thành tế bào làm cho khuẩn lạc có thể có màu vàng lục, màu ô liu đến nâu sẫm, đen. Ngoài ra, nấm men đen còn chứa carotenoid và mycosporines. Một trong các lý do khiến những hiểu biết về nấm men đen kém xa so với các vi sinh vật khác có lẽ là do sự sinh trƣởng chậm, khả năng cạnh tranh thấp với loài khác nên dễ bị bỏ qua trong các nghiên cứu, thêm nữa cấu trúc bào tử đính của chúng lại ít đặc điểm phân biệt, trong khi hiện tƣợng đa hình thái của cùng một chủng lại khá phổ biến và gây khó khăn trong quá trình phân loại [9]. Một số chi nấm men đen 1.

Chi Phaeococcomyces Gồm 3 loài đã đƣợc công nhận là: P.nigricans Đặc điểm hình thái: Khuẩn lạc sinh trƣởng chậm, nhầy, bề mặt có nhiều nếp nhăn, màu đen. Tế bào dạng hình cầu đến elip. Bào tử đính chuyển từ không màu sang nâu đậm hoặc đen [5, 7]. Hình thái tế bào đặc trƣng của Phaeococcus catenatus CBS 650.org) K20 – Vi sinh vật học 2 Đinh Đức Hiền LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ 1.

Chi Exophiala Đƣợc mô tả đầu tiên vào năm 1966 bởi Carmichael với loài mới Exophiala salmonis [5]. Đến nay chi này gồm 28 loài: E. Exophiala phân bố nhiều trong đất, nƣớc, thực vật, gỗ mục,. và là nguyên nhân gây nhiều bệnh ở ngƣời.

Exophiala có đặc điểm hình thái và sinh lý rất đa dạng, hình thái cơ bản có thể tóm tắt nhƣ sau: Chiếm ƣu thế trong môi trƣờng nuôi cấy là tế bào là dạng phân đốt, thon dần về phía ngọn, một vài đốt hợp với nhau ở bên trong, mỗi đốt là một tế bào, đôi khi gồm hai tế bào. Khi còn trẻ, các tế bào có dạng hình cầu, sinh sản bằng nảy chồi giống nhƣ nấm men thông thƣờng, xếp thành chuỗi dài. Sau một thời gian nuôi cấy, bắt đầu hình thành các vách ngăn bên trong sợi nấm, tạo thành đốt. Các đốt này có hình trụ, mọc kiểu tia và đặc trƣng bởi các eo thắt hẹp.

Sau đó, từ các đốt sinh ra các bào tử hình elip kích thƣớc 1-3  3-6 μm. Các bào tử này thƣờng gồm một tế bào, tập trung ở đỉnh của đốt hay trên cuống bào tử đính [5, 7]. Hình ảnh tế bào của Exophiala salmonis CBS 157. Chi Aureobasidium Các loài thuộc Aureobasidium có phổ phân bố tƣơng đối rộng và đƣợc tìm thấy trong đất, xác thực vật, lá cây.

Aureobasidium gồm 14 loài trong đó A. pullulans đƣợc biết đến nhiều nhất. Về mặt hình thái, Aureobasidium tạo khuẩn lạc lúc đầu màu trắng, sau chuyển sang màu sẫm hoặc đen. Đƣờng kính sợi nấm từ 2-10 μm.

K20 – Vi sinh vật học 3 Đinh Đức Hiền LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ Không phát hiện thấy cuống bào tử đính. Aureobasidium sinh sản vô tính với bào tử đơn bào, kích thƣớc 2-3  4-6 µm, không màu, hình bầu dục đến hình trụ, tập trung thành từng đám. Các bào tử này sau đó tiếp tục sinh sản bằng nảy chồi hoặc hình thành túi bào tử thứ cấp [7]. Hình ảnh tế bào chủng Aureobasidium pullulans (Nguồn www.

Chi Moniliella Sau khi chi Moniliella đƣợc thiết lập bởi Stolk & Dakin (1966) cho hai loài mới là M. Tiếp theo hai loài Moniliella suaveolens và Moniliella mellis, đã đƣợc miêu tả bởi von Arx (1972) và Rao & de Hoog (1975), đến năm 1984, de Hoog miêu tả một loài mới là M. Chi Trichosporonoides đƣợc coi là tƣơng tự nhƣ chi Moniliella, khác biệt chủ yếu bởi kích thƣớc khuẩn lạc và tế bào nhỏ hơn [8]. Trong các nghiên cứu sau đó, cho thấy hai chi này tƣơng đồng với nhau [8].

Năm 2009, Rosa và cộng sự đã xác định các giả thuyết này bằng so sánh trình tự vùng D1/D2 của rDNA 26S và đi đến kết luận Moniliella và Trichosporonoides đƣợc xếp vào cùng một chi, loài M. pollinis có trình tự vùng D1/D2 giống với Trichosporonoide madida, chỉ khác nhau bởi tỉ lệ G+C tƣơng ứng là 50.2, do đó hai loài này thống nhất tên là M. pollinis đƣợc mô tả khác với M. tomemtosa về hình thái và mức độ chuyển hóa tạo erythritol, nhƣng về trình tự D1/D2 cho thấy chúng tƣơng đồng nhau.

Nhƣ vậy cho đến trƣớc nghiên cứu này chi Moniliella gồm 9 loài nhƣ sau [24]. K20 – Vi sinh vật học 4 Đinh Đức Hiền LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ Moniliella acetoabutens Stolk & Dakin (1966) Moniliella fonsecae Rosa, Jindamorakot, Limtong, Nakase, Lachance, Fidalgo- Jiménez, Daniel, Pagnocca, Inácio & Morais (2008) Moniliella megachiliensis (Inglis & Sigler) Rosa & Lachance (2008) Moniliella mellis (Fabian & Quinet) V. Rao & de Hoog (1975) Moniliella nigrescens (Hocking & Pitt) Rosa & Lachance (2008) Moniliella oedocephalis (Haskins & Spencer) Rosa & Lachance (2008) Moniliella pollinis (Hennebert & Verachtert) de Hoog & Guého (1984) Moniliella spathulata (de Hoog) Rosa & Lachance (2008) Moniliella suaveolens (Lindner) von Arx (1972) Phần lớn các loài thuộc chi Moniliella phân lập đƣợc thƣờng phân bố ở những nơi có nhiều dầu mỡ hoặc nơi có nồng độ đƣờng cao nhƣ phấn hoa, mật ong…Ví dụ, M. acetoabutens cho tới nay chỉ gặp trên các mẫu thực phẩm lên men có độ chua cao nhƣ xốt hoa quả, dƣa muối, M.

mellis từ mật ong, M. nigrescens từ jam, marmalade hỏng, M. spathulata từ sữa trâu, M. suaveolens từ sữa, bơ, phomat … M.

fonsecae phân lập từ hoa Angelonia pilosella, M. megachiliensis phân lập từ côn trùng, M. oedocephalis từ mật ong, M. pollinis từ phấn hoa.

Về mặt hình thái học, những loài thuộc chi Moniliella có khuẩn lạc màu hơi xám đến đen oliu, sinh sản vô tính bằng cách nảy chồi và hình thành sợi nấm và bào tử đốt. fonsecae, những loài thuộc chi Moniliella mang những đặc tính đặc biệt trong số những nấm đảm (Basidiomycetous) với khả năng chịu áp suất thẩm thấu và lên men. Moniliella có những đặc trƣng về cấu trúc nhƣ thành tế bào gồm nhiều lớp và thiếu xylose, fucose. Vách tế bào có các cấu trúc lỗ, vách ngăn (dolispores) với các kênh hẹp [20].

Moniliella phản ứng dƣơng tính với Diazonium blue. Tất cả các loài có khả năng đồng hóa nitrat và sản sinh urease. Ubiquinone isoprenologue chính đƣợc xác định trong Moniliella là Co-Q9. Sự phân nhánh các loài của chi Moniliella đƣợc nghiên cứu bởi phân tích trình tự vùng D1/D2 của gen LSU rRNA, mức độ sai khác về mặt di truyền giữa các loài là cao.

Trong đoạn D1/D2 của gen LSU rRNA, các loài có thể sai khác nhau đến K20 – Vi sinh vật học 5 Đinh Đức Hiền LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ 15% thậm chí là hơn [22]. Di truyền không đồng nhất trong chi cũng đƣợc thể hiện qua hơn 16% sai khác về tỷ lệ G+C trong DNA [4]. Mặc dù các loài thuộc chi Moniliella biểu hiện một số hóa phân loại và siêu cấu trúc giống những loài thuộc ngành Ustilaginomycotina, thế nhƣng việc sắp xếp vào bậc phân loại cao hơn là không đảm bảo bởi phân tích D1/D2 LSU rRNA hoặc các đoạn gen rRNA khác [22]. Một sự hiểu biết rõ ràng hơn về sự tiến hóa của chi sẽ đƣợc xác định dựa trên việc phát hiện ra nhiều loài mới để lấp vào các khoảng trống giữa các đơn vị phân loại đã đƣợc thiết lập.

Thêm nữa, nghiên cứu về chi Moniliella ngày càng đƣợc thúc đẩy do những đặc tính trong sinh trƣởng của chúng nhƣ ƣa lipit, chịu áp suất thẩm thấu, điều này hứa hẹn triển vọng cho các quá trình công nghệ sinh học. Thực tế, những loài thuộc chi Moniliella đang đƣợc dùng trong sản xuất erythritol thƣơng mại [23]. Hình ảnh tế bào Moniliella suaveolens CBS 120.63 (trái) và Moniliella acetoabuten CBS 169.org) K20 – Vi sinh vật học 6 Đinh Đức Hiền LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ Hình 5. Cây phả hệ mô tả mối quan hệ giữa các loài thuộc chi Moniliella.

Phylloporia pectinata đƣợc sử dụng nhƣ nhóm ngoài. Mã số GenBank của trình tự rDNA đƣợc đƣa ra sau tên loài. Thanh chèn tƣơng ứng 5% khác biệt trình tự. So sánh đặc điểm hình thái của chi Moniliella với một số chi thƣờng gặp có thể bị nhầm lẫn với Moniliella.