Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Chất thải nhựa, đặc biệt là polystyrene (PS), đang là một trong những thách thức môi trường nghiêm trọng trên quy mô toàn cầu. Polystyrene là một polymer hydrocacbon thơm tổng hợp từ monomer styrene, chiếm sản lượng khoảng 33 triệu tấn mỗi năm (tương đương 7% tổng sản lượng nhựa thế giới). Do đặc tính trơ về mặt hóa học, có cấu trúc phân tử mạch thẳng bền vững và không phản ứng với dung dịch axit hoặc bazơ thông thường, các sản phẩm từ nhựa PS rất khó phân hủy trong điều kiện tự nhiên, ước tính cần từ 500 đến 1000 năm để phân rã hoàn toàn. Thống kê năm 2015 cho thấy thế giới sản xuất 381 triệu tấn nhựa và tích lũy 7,82 tỷ tấn chất thải; tuy nhiên, chỉ có 9% lượng rác thải nhựa được tái chế, 12% được xử lý bằng phương pháp đốt và 79% còn lại tồn lưu ngoài môi trường tự nhiên, bao gồm các bãi chôn lấp và đại dương.

Các phương pháp xử lý rác thải truyền thống như chôn lấp, đốt hay tái chế cơ học/hóa học đều bộc lộ nhiều hạn chế lớn: chôn lấp tốn quỹ đất và phân hủy chậm trong môi trường yếm khí; đốt sinh ra khí nhà kính ($CO_2$) cùng các hợp chất độc hại như hydrocacbon thơm đa vòng (PAHs), biphenyl polychlorin hóa (PCBs) và kim loại nặng; tái chế cơ học hay hóa học phức tạp và chi phí cao. Trước thực trạng đó, phương pháp phân hủy sinh học sử dụng ấu trùng côn trùng và hệ vi sinh vật đường ruột nổi lên như một giải pháp xử lý chất thải an toàn, chi phí thấp và thân thiện với môi trường. Nhiều công bố khoa học gần đây xác nhận ấu trùng sâu sáp lớn (Galleria mellonella) có khả năng cắn xé, ăn và tiêu hóa màng nhựa polyetylen (PE) cũng như polystyrene (PS) nhờ sự tương đồng cấu trúc giữa polymer và sáp ong. Quá trình tiêu hóa và khử polymer này có sự tham gia mật thiết của hệ vi sinh vật cộng sinh cư trú trong đường ruột ấu trùng.

Xuất phát từ cơ sở thực tiễn trên, khóa luận tốt nghiệp ngành Công nghệ Sinh học của tác giả K'Jap tại Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh được thực hiện nhằm phân lập, khảo sát đặc điểm sinh hóa và định danh chính xác các chủng vi khuẩn trong hệ tiêu hóa của sâu sáp sau khi thích nghi với chế độ ăn nhựa PS.

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài:

  1. Phân lập được các dòng vi khuẩn hiện diện trong hệ tiêu hóa của ấu trùng sâu sáp Galleria mellonella sau khi được nuôi bằng khẩu phần bổ sung nhựa polystyrene (PS).
  2. Định danh sơ bộ các dòng vi khuẩn phân lập được thông qua quan sát hình thái, nhuộm Gram và thực hiện các thử nghiệm sinh hóa đặc trưng.
  3. Định danh chính xác tên loài của các chủng vi khuẩn bằng kỹ thuật sinh học phân tử thông qua giải trình tự đoạn gene 16S rDNA và đối chiếu dữ liệu trên GenBank (NCBI).

Nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể:

  1. Nuôi ấu trùng sâu sáp từ giai đoạn trứng đến đầu tuổi 3 bằng thức ăn tổng hợp nhân tạo; cho ấu trùng nhịn đói 2 ngày rồi chuyển sang khẩu phần thức ăn là 2000 mg nhựa xốp PS từ đầu tuổi 3 đến tuổi 5 (trong 7 ngày); thu nhận mẫu ruột, phân lập và làm thuần các khuẩn lạc trên môi trường Potato Dextrose Agar (PDA).
  2. Khảo sát đặc điểm hình thái đại thể (hình dạng, màu sắc, kích thước khuẩn lạc), hình thái vi thể (nhuộm Gram tế bào) và thực hiện 7 chỉ tiêu sinh hóa: Catalase, Oxidase, Indol, khả năng di động, Urease, Voges-Proskauer (VP), Methyl Red (MR).
  3. Ly trích DNA tổng số của các chủng vi khuẩn bằng phương pháp Benzyl chloride, thực hiện phản ứng PCR khuếch đại vùng gene 16S rDNA với cặp mồi 27F/1492R, điện di kiểm tra sản phẩm trên gel agarose 1,5%, gửi giải trình tự và phân tích độ tương đồng bằng công cụ BLASTN trên cơ sở dữ liệu NCBI.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Mẫu ruột của ấu trùng sâu sáp Galleria mellonella (sau khi nhịn ăn 2 ngày và tiêu thụ nhựa PS trong 7 ngày) cùng các dòng vi khuẩn thuần được phân lập từ nguồn mẫu này.
  • Phạm vi không gian: Phòng thí nghiệm Sinh thái Côn trùng, Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh (Khu phố 6, phường Linh Trung, Thành phố Thủ Đức, TP.HCM).
  • Phạm vi thời gian: Đề tài được triển khai thực nghiệm từ tháng 08/2022 đến tháng 12/2022.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp thực nghiệm

Cơ sở lý thuyết và khung phân loại

Nghiên cứu dựa trên các tài liệu phân loại học côn trùng và vi sinh vật học chuẩn mực:

  • Phân loại học sâu sáp: Galleria mellonella được phân loại bởi Carl Linnaeus (1758), thuộc Giới Animalia, Ngành Arthropoda, Lớp Insecta, Bộ Lepidoptera, Họ Pyralidae, Phân họ Galleriinae, Chi Galleria. Ấu trùng có màu trắng kem, đầu có ba răng chóp phát triển giúp cắn xé thức ăn. Nhiệt độ tối ưu cho vòng đời của sâu sáp là $29 - 33^\circ\text{C}$ và độ ẩm $29 - 33%$.
  • Đặc tính nhựa Polystyrene (PS): Công thức hóa học $(C_8H_8)_n$, nhiệt độ nóng chảy $210 - 249^\circ\text{C}$, sức căng 53 MPa, độ bền uốn 83 MPa, trọng lượng riêng 1,04. Hộp nhựa xốp PS sử dụng trong nghiên cứu có thành phần gồm 95% Polystyrene và 5% không khí.
  • Cơ sở vi sinh vật phân giải polymer: Tổng quan các nghiên cứu quốc tế về hệ enzyme vi sinh vật phân giải chất dẻo (laccase, cutinase, hydrolase, esterase, protease, urease) từ các chi vi khuẩn phổ biến như Bacillus, Pseudomonas, Enterobacter, Staphylococcus, Streptococcus. Đối chiếu các nghiên cứu tiêu biểu của Lou, Yang và cộng sự (2020), Jiang, Wang và cộng sự (2021), Ren, Wang và cộng sự (2019), Cassone và cộng sự (2020) về sự biến đổi hệ vi sinh vật đường ruột của sâu sáp khi tiêu thụ PE và PS.
  • Khung định danh sinh hóa: Sử dụng khóa phân loại vi khuẩn trong Sổ tay Bergey (Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 1994) để biện luận và định danh sơ bộ giống vi khuẩn dựa trên kết quả nhuộm Gram và thử nghiệm sinh hóa.

Phương pháp nghiên cứu thực tế

Nghiên cứu áp dụng quy trình thực nghiệm vi sinh vật học và sinh học phân tử gồm các bước:

[Nuôi ấu trùng sâu sáp] 
[Thử nghiệm tiêu thụ nhựa]
[Thu mẫu và phân lập]
[Khảo sát đặc tính sinh học]
[Định danh phân tử 16S rDNA]
  • Quy trình chuẩn bị thức ăn và nuôi sâu: Thức ăn nhân tạo gồm 650g cám gạo (hấp khử trùng ở $121^\circ\text{C}$, 1 atm trong 1 giờ 30 phút và sấy ở $75^\circ\text{C}$ trong 3 - 5 giờ để diệt trứng mọt), 150ml glycerin, 100ml mật ong và 100g cao nấm men. Trộn đều các thành phần và bảo quản ở $6 - 10^\circ\text{C}$. Ấu trùng nuôi từ khi nở đến đầu tuổi 3 (12 - 13 ngày sau nở, chiều dài đạt 12 - 15 mm) được tách khỏi thức ăn, cho nhịn đói 2 ngày, sau đó bổ sung 2000 mg hộp nhựa xốp PS trong 7 ngày.
  • Kỹ thuật tách mẫu và phân lập vi khuẩn: Khử trùng bề mặt 10 - 12 cá thể sâu bằng cồn 70% trong 1 phút, rửa lại bằng nước cất vô trùng 3 lần. Tách ruột sâu trong đĩa petri vô trùng đặt trong tủ an toàn sinh học cấp 2. Mẫu ruột được nghiền trong 1 ml nước cất vô trùng, pha loãng thành các nồng độ $10^{-5}, 10^{-6}, 10^{-7}$. Hút 0,1 ml dịch pha loãng cấy trải lên đĩa môi trường thạch Potato Dextrose Agar (PDA), ủ ở $37^\circ\text{C}$ trong 24 - 48 giờ. Tiến hành cấy ria 3 - 4 lần để thu nhận các chủng thuần khiết, giữ giống trên thạch nghiêng PDA ở $4^\circ\text{C}$ (cấy chuyền định kỳ 2 tuần/lần).
  • Phương pháp nhuộm Gram và thử nghiệm sinh hóa:
    • Nhuộm Gram sử dụng Crystal violet (1 phút), dung dịch Lugol (1 phút), tẩy màu bằng cồn 95% (< 5 giây), nhuộm bổ sung Safranin (30 giây), quan sát tế bào dưới vật kính dầu 100X.
    • Phản ứng Catalase nhỏ dung dịch $H_2O_2$ 3% lên sinh khối vi khuẩn; phản ứng Oxidase dùng que tăm vô trùng miết khuẩn lên giấy tẩm tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride (TMPD); phản ứng Indol nuôi cấy trong canh tryptone lỏng và nhỏ thuốc thử Kovacs; thử nghiệm di động cấy đâm sâu vào môi trường thạch mềm; thử nghiệm Urease trên môi trường thạch nghiêng chứa phenol red; thử nghiệm Voges-Proskauer (VP) và Methyl Red (MR) nuôi cấy trong môi trường MR-VP Broth, sau đó bổ sung thuốc thử $\alpha$-naphthol 5% + KOH 40% (cho VP) hoặc dung dịch Methyl Red (cho MR).
  • Quy trình sinh học phân tử:
    • Tách chiết DNA tổng số bằng phương pháp Benzyl chloride (Zhu et al., 1993): Phá vỡ tế bào bằng đệm ly giải (Tris 200 mM pH 8.0, EDTA 25 mM, NaCl 250 mM, SDS 0,5%), chiết tách protein/lipid bằng dung môi PCI (Phenol : Chloroform : Isoamyl alcohol tỉ lệ 25:24:1) và CI (Chloroform : Isoamyl alcohol tỉ lệ 24:1), kết tủa DNA bằng Isopropanol ở $-20^\circ\text{C}$ trong 30 phút, rửa tủa 2 lần bằng ethanol 70%, hòa tan tủa trong 50 µL đệm TE 1X. Kiểm tra độ tinh sạch DNA bằng máy đo quang phổ đạt tỉ số $OD_{260/280}$ trong khoảng 1,8 - 2,0.
    • Phản ứng PCR khuếch đại đoạn gene 16S rDNA thực hiện trên máy 2720 Thermal Cycler (Thermo Fisher) với tổng thể tích 50 µL (gồm 25 µL MyTaqMix 2X, 1 µL Primer 27F 10 µM, 1 µL Primer 1492R 10 µM, 4 µL DNA khuôn và 19 µL nước cất vô trùng). Trình tự mồi:
      • Primer xuôi 27F: 5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'
      • Primer ngược 1492R: 5'-CGG TTA CCT TGT TAC GAC TT-3'
    • Chu trình nhiệt PCR: Tiền biến tính ở $95^\circ\text{C}$ (5 phút); 35 chu kỳ gồm [biến tính $95^\circ\text{C}$ (1 phút) - bắt cặp mồi $55^\circ\text{C}$ (1 phút) - kéo dài $72^\circ\text{C}$ (1 phút)]; giai đoạn kéo dài cuối ở $72^\circ\text{C}$ (7 phút).
    • Điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5% trong đệm TAE 0,5X, nhuộm GelRed, chạy ở hiệu điện thế 100V trong 30 phút, đối chiếu thang chuẩn DNA Ladder 1000 bp dưới ánh sáng đèn UV. Gửi mẫu giải trình tự tại Công ty TNHH DV & TM Nam Khoa và phân tích dữ liệu bằng công cụ BLASTN trên GenBank (NCBI).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Đặt vấn đề

Chương mở đầu phân tích tính bức thiết của việc tìm kiếm giải pháp sinh học xử lý rác thải nhựa, đặc biệt là polystyrene (loại nhựa chiếm 7% sản lượng toàn cầu nhưng cực kỳ khó phân giải tự nhiên). Tác giả dẫn chứng khả năng ăn và phân hủy cấu trúc nhựa của ấu trùng Galleria mellonella cùng các công bố khoa học chứng minh vai trò cộng sinh của hệ vi sinh vật đường ruột sâu sáp trong việc tiết enzyme bẻ gãy mạch polymer. Từ đó, xác định rõ mục tiêu phân lập, khảo sát hình thái, sinh hóa và định danh chính xác bằng sinh học phân tử các chủng vi khuẩn đường ruột có mặt sau khi sâu tiêu thụ nhựa PS.

Chương 2. Tổng quan tài liệu

Chương 2 tổng hợp toàn diện các cơ sở lý luận và nghiên cứu thực nghiệm liên quan đến đề tài:

  • Đặc điểm sinh học sâu sáp: Trình bày chi tiết phân loại học, vòng đời biến thái hoàn toàn, đặc điểm hình thái từng giai đoạn (trứng, ấu trùng, nhộng, trưởng thành) và các yếu tố sinh thái ảnh hưởng (nhiệt độ tối ưu $29 - 33^\circ\text{C}$, độ ẩm $29 - 33%$).
  • Tổng quan về nhựa và Polystyrene: Cấu trúc phân tử, tính chất nhiệt, độ bền cơ học và tính chất hóa học của nhựa PS; tổng hợp số liệu về sản lượng, tỷ lệ thải bỏ và nguy cơ ô nhiễm vi nhựa trong chuỗi thức ăn sinh thái toàn cầu.
  • Phân tích 4 phương pháp xử lý chất thải nhựa: Đánh giá ưu - nhược điểm của phương pháp chôn lấp, thiêu đốt, tái chế hóa học/cơ học và phương pháp phân hủy sinh học bằng vi sinh vật/côn trùng.
  • Tổng quan vi sinh vật phân hủy polymer: Thống kê các chủng vi khuẩn (Pseudomonas, Bacillus, Staphylococcus, Streptococcus, Enterobacter) và các hệ enzyme ngoại bào có khả năng phân hủy chất dẻo. Điểm lại các công trình nghiên cứu nổi bật về vi khuẩn đường ruột của Plodia interpunctella, Galleria mellonella, Tenebrio molitor trong việc làm suy thoái màng nhựa PE và PS (nghiên cứu của Jun et al., 2014; Ren et al., 2019; Lou et al., 2020; Jiang et al., 2021; Cassone et al., 2020; Wang et al., 2022).

Chương 3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 3 mô tả cụ thể toàn bộ vật liệu, hóa chất, thiết bị và các bước tiến hành thực nghiệm:

  • Liệt kê chi tiết danh mục hóa chất (PDA, thuốc nhuộm Gram, thuốc thử sinh hóa, hóa chất ly trích DNA, sinh phẩm PCR MyTaq, agarose, thang chuẩn DNA 1000 bp).
  • Trình bày công thức và quy trình chế biến thức ăn nhân tạo nuôi sâu; quy trình cho sâu nhịn ăn 2 ngày và bổ sung 2000 mg nhựa PS trong 7 ngày.
  • Mô tả thao tác vô trùng khi mổ ruột, pha loãng nồng độ thập phân ($10^{-5} - 10^{-7}$), cấy trải và cấy ria làm thuần trên môi trường PDA.
  • Hướng dẫn quy trình nhuộm Gram và nguyên lý, cách tiến hành, tiêu chí đánh giá của 7 thử nghiệm sinh hóa định danh sơ bộ.
  • Thiết lập quy trình 9 bước tách chiết DNA bằng Benzyl chloride/PCI, các thành phần hóa chất trong phản ứng PCR 50 µL khuếch đại gene 16S rDNA với cặp mồi 27F/1492R, chu trình luân nhiệt trên máy 2720 Thermal Cycler, kỹ thuật đổ gel và điện di agarose 1,5%, cùng quy trình gửi mẫu giải trình tự và tra cứu BLASTN.

Chương 4. Kết quả và thảo luận

Chương 4 trình bày các số liệu và hình ảnh thực nghiệm thu được:

  • Khả năng tiêu thụ nhựa PS của sâu sáp: Sau 7 ngày cho ăn, ấu trùng tiêu thụ hết 105,33 mg nhựa PS (từ 2000 mg ban đầu). Trên bề mặt mẫu nhựa xuất hiện các lỗ đục, rìa bị cắn nham nhở, biến dạng và thải ra các hạt phân màu nâu sậm. Chiều dài sâu giảm nhẹ từ 14 - 15 mm xuống còn 12 - 14 mm do nhựa không cung cấp đầy đủ dinh dưỡng toàn diện cho sự phát triển.
  • Kết quả phân lập: Thu nhận được 3 chủng vi khuẩn thuần khiết, ký hiệu là A1, A2 và A3. Trong đó, chủng A1 có mật độ xuất hiện nhiều nhất, chủng A2 có thời gian hình thành khuẩn lạc nhanh nhất, chủng A3 có mật độ và tốc độ xuất hiện trung gian.
  • Đặc điểm hình thái và nhuộm Gram: Cả 3 chủng đều có dạng hình que (trực khuẩn). Chủng A1 và A2 là vi khuẩn Gram dương ($Gram^+$), bắt màu tím; chủng A3 là vi khuẩn Gram âm ($Gram^-$), bắt màu đỏ hồng.
  • Định danh sinh hóa sơ bộ: Cả 3 chủng đều có hoạt tính Catalase dương tính ($+$), Voges-Proskauer dương tính ($+$); âm tính ($-$) với Oxidase, Indol, Urease và Methyl Red. Về khả năng di động, chủng A2 và A3 di động dương tính ($+$), chủng A1 âm tính ($-$). Dựa trên Sổ tay Bergey (1994), định danh sơ bộ chủng A1 và A2 thuộc chi Bacillus, chủng A3 thuộc chi Enterobacter.
  • Định danh sinh học phân tử 16S rDNA: Điện di sản phẩm PCR cho vạch sáng rõ nét kích thước khoảng 1500 bp. Kết quả giải trình tự và BLASTN trên NCBI xác định chính xác: chủng A1 là Bacillus inaquosorum (độ tương đồng 97,52%), chủng A2 là Bacillus subtilis (độ tương đồng 93,66%) và chủng A3 là Enterobacter cloacae (độ tương đồng 98,80%).

Kết quả và đóng góp

Kết quả định lượng và dữ liệu thực nghiệm chính

Khóa luận đã ghi nhận đầy đủ các thông số thực nghiệm về khả năng tiêu thụ nhựa, đặc điểm hình thái tế bào, hoạt tính sinh hóa và kết quả phân tích trình tự gene của 3 chủng vi khuẩn phân lập từ ruột sâu sáp:

Thông số / Chỉ tiêu Chủng A1 Chủng A2 Chủng A3
Mật độ & Tốc độ xuất hiện Xuất hiện nhiều nhất Xuất hiện nhanh nhất Mật độ & tốc độ trung bình
Hình dạng khuẩn lạc Tròn, bề mặt khô, dẹt Bề mặt khô, sần sùi, dẹt, rìa răng cưa, ăn lan Tròn, mịn, khuẩn lạc lồi, bề mặt ướt
Màu sắc khuẩn lạc Trắng sữa Trắng sữa Trắng sữa
Kích thước khuẩn lạc (mm) 1,2 – 3,0 1,3 – 4,2 1,5 – 3,0
Nhuộm Gram Gram dương ($Gram^+$) Gram dương ($Gram^+$) Gram âm ($Gram^-$)
Hình dạng & Kích thước tế bào Hình que (2 – 4 µm) Hình que (2 – 5 µm) Hình que (1 – 2 µm)
Thử nghiệm Catalase Dương tính ($+$) (sủi bọt mạnh) Dương tính ($+$) (sủi bọt vừa) Dương tính ($+$) (sủi bọt yếu)
Thử nghiệm Oxidase Âm tính ($-$) Âm tính ($-$) Âm tính ($-$)
Thử nghiệm Indol Âm tính ($-$) Âm tính ($-$) Âm tính ($-$)
Khả năng di động Âm tính ($-$) Dương tính ($+$) Dương tính ($+$)
Thử nghiệm Urease Âm tính ($-$) Âm tính ($-$) Âm tính ($-$)
Thử nghiệm Voges-Proskauer Dương tính ($+$) Dương tính ($+$) Dương tính ($+$)
Thử nghiệm Methyl Red Âm tính ($-$) Âm tính ($-$) Âm tính ($-$)
Định danh sơ bộ (Bergey 1994) Chi Bacillus Chi Bacillus Chi Enterobacter
Kích thước sản phẩm PCR 16S ~1500 bp ~1500 bp ~1500 bp
Loài định danh (BLASTN) Bacillus inaquosorum Bacillus subtilis Enterobacter cloacae
Mã số truy xuất GenBank KF879309.1 EF530208.2 MT507092.1
Độ tương đồng di truyền (%) 97,52% (97,1%) 93,66% 98,80%

Giải pháp và kiến nghị của tác giả

  • Tiếp tục thực hiện các thử nghiệm nuôi cấy in vitro riêng lẻ từng chủng vi khuẩn (Bacillus inaquosorum, Bacillus subtilis, Enterobacter cloacae) hoặc phối hợp tổ hợp vi sinh trong môi trường khoáng tối thiểu có bổ sung màng nhựa PS làm nguồn carbon duy nhất nhằm định lượng chính xác tốc độ và khả năng phân giải nhựa độc lập của từng chủng.
  • Phân tích sự biến đổi cấu trúc bề mặt và khối lượng phân tử của màng nhựa sau khi xử lý bằng vi khuẩn thông qua các kỹ thuật hóa lý chuyên sâu như kính hiển vi điện tử quét (SEM), quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR), sắc ký thẩm thấu gel (GPC) và sắc ký khối phổ (GC-MS).
  • Khảo sát và tinh sạch các hệ enzyme ngoại bào (laccase, cutinase, esterase, protease) do các chủng vi khuẩn này tiết ra để phục vụ định hướng sản xuất chế phẩm sinh học xử lý rác thải polystyrene.

Đóng góp so với các nghiên cứu trước

  • Khóa luận đóng góp dẫn liệu thực nghiệm ban đầu tại Việt Nam về hệ vi sinh vật đường ruột của ấu trùng Galleria mellonella khi thích nghi với chế độ ăn hoàn toàn bằng nhựa polystyrene.
  • Xác nhận sự hiện diện chiếm ưu thế của hai chi vi khuẩn Bacillus và Enterobacter trong đường tiêu hóa của sâu sáp ăn nhựa. Kết quả này củng cố và có sự tương đồng cao với các công bố khoa học quốc tế của Lou, Yang và cộng sự (2020) cũng như Jiang, Wang và cộng sự (2021) về vai trò của các vi khuẩn họ Bacillaceae và Enterobacteriaceae trong quá trình hỗ trợ côn trùng chuyển hóa, phân giải các hợp chất polymer bền vững.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

  • Nghiên cứu mới dừng lại ở việc phân lập, làm thuần và định danh phân loại học (hình thái, sinh hóa, trình tự 16S rDNA) của 3 chủng vi khuẩn có mặt trong ruột sâu sáp sau khi ăn nhựa PS; chưa tiến hành thử nghiệm nuôi cấy vi khuẩn thuần chủng trực tiếp với nhựa để đo đạc tỷ lệ hao hụt khối lượng nhựa in vitro.
  • Chưa khảo sát cơ chế sinh hóa chi tiết và chưa phân tích các sản phẩm trung gian của quá trình phân giải polymer (chưa thực hiện các phép đo SEM, FTIR, GC-MS trên mẫu nhựa sau khi vi khuẩn tác động).
  • Môi trường phân lập sử dụng là Potato Dextrose Agar (PDA) cơ bản, có thể chưa bao quát hết các nhóm vi khuẩn kỵ khí nghiêm ngặt hoặc vi khuẩn khó nuôi cấy cư trú trong ruột sâu.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

  • Thiết lập thí nghiệm nuôi cấy 3 chủng vi khuẩn (Bacillus inaquosorum, Bacillus subtilis, Enterobacter cloacae) trong môi trường dịch thể chứa bột hoặc màng phim polystyrene làm nguồn carbon và năng lượng duy nhất trong thời gian 30 - 60 ngày.
  • Định lượng hoạt tính các enzyme phân hủy polymer trong dịch nuôi cấy và giải trình tự toàn bộ hệ gene (whole-genome sequencing) của các chủng vi khuẩn để tìm kiếm các cụm gene mã hóa enzyme chuyển hóa hợp chất thơm và polymer.

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận có giá trị tham khảo hữu ích cho các nhóm đối tượng và mục đích học thuật sau:

  • Sinh viên và học viên ngành Công nghệ Sinh học, Vi sinh vật học, Khoa học Môi trường, Bảo vệ Thực vật: Tham khảo tổng quan tài liệu về xử lý rác thải polymer bằng phương pháp sinh học và vai trò của côn trùng ăn nhựa.
  • Người thực hiện các đề tài nghiên cứu về hệ vi sinh vật đường ruột côn trùng: Có thể tham khảo trực tiếp quy trình chế tạo thức ăn nhân tạo và kỹ thuật nuôi dưỡng ấu trùng sâu sáp Galleria mellonella từ giai đoạn trứng đến tuổi 5.
  • Nghiên cứu viên phòng thí nghiệm vi sinh và sinh học phân tử: Tham khảo quy trình tách mẫu ruột côn trùng vô trùng, phương pháp tách chiết DNA bằng Benzyl chloride/PCI và các thông số tối ưu cho phản ứng PCR khuếch đại vùng gene 16S rDNA với cặp mồi chuẩn 27F/1492R.

Câu hỏi thường gặp

1. Khối lượng nhựa Polystyrene mà ấu trùng sâu sáp tiêu thụ trong nghiên cứu là bao nhiêu và hình thái sâu thay đổi như thế nào sau 7 ngày?
Trong thử nghiệm cho ăn 7 ngày (từ đầu tuổi 3 đến tuổi 5), sâu sáp đã tiêu thụ 105,33 mg nhựa PS từ lượng 2000 mg ban đầu. Trên màng nhựa xuất hiện các lỗ đục, vết cắn nham nhở và sâu thải ra các hạt phân màu nâu sậm. Chiều dài sâu giảm từ 14 - 15 mm xuống còn 12 - 14 mm do nhựa không cung cấp đầy đủ dinh dưỡng cân đối.

2. Ba chủng vi khuẩn phân lập được định danh chính xác là những loài nào và đạt độ tương đồng di truyền bao nhiêu trên GenBank?
Ba chủng vi khuẩn được định danh gồm:

  • Chủng A1: Bacillus inaquosorum (Mã truy xuất: KF879309.1), độ tương đồng 97,52% (trong bảng tổng hợp ghi 97,1%).
  • Chủng A2: Bacillus subtilis (Mã truy xuất: EF530208.2), độ tương đồng 93,66%.
  • Chủng A3: Enterobacter cloacae (Mã truy xuất: MT507092.1), độ tương đồng 98,80%.

3. Cặp mồi và điều kiện chu trình nhiệt nào đã được sử dụng trong phản ứng PCR 16S rDNA?
Phản ứng PCR sử dụng cặp mồi: Primer xuôi 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') và Primer ngược 1492R (5'-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3'). Chu trình nhiệt trên máy 2720 Thermal Cycler gồm: Tiền biến tính ở $95^\circ\text{C}$ (5 phút); 35 chu kỳ [$95^\circ\text{C}$ (1 phút) - $55^\circ\text{C}$ (1 phút) - $72^\circ\text{C}$ (1 phút)]; Kéo dài cuối ở $72^\circ\text{C}$ (7 phút). Sản phẩm PCR có kích thước khoảng 1500 bp.

4. Thức ăn tổng hợp dùng để nuôi ấu trùng sâu sáp trước khi cho ăn nhựa gồm những thành phần nào?
Thức ăn nhân tạo gồm: 650g cám gạo (đã hấp ở $121^\circ\text{C}$, 1 atm trong 1,5 giờ và sấy ở $75^\circ\text{C}$ trong 3 - 5 giờ), 150ml glycerin, 100ml mật ong và 100g cao nấm men; hỗn hợp được bảo quản ở $6 - 10^\circ\text{C}$.

5. Kết quả thử nghiệm sinh hóa của 3 chủng vi khuẩn phân lập có những điểm chung và khác biệt nào?

  • Điểm chung: Cả 3 chủng đều dương tính ($+$) với thử nghiệm Catalase và Voges-Proskauer (VP); âm tính ($-$) với Oxidase, Indol, Urease và Methyl Red (MR).
  • Điểm khác biệt: Chủng A1 và A2 là trực khuẩn Gram dương ($Gram^+$), trong khi chủng A3 là trực khuẩn Gram âm ($Gram^-$). Về khả năng di động trong môi trường thạch mềm, chủng A2 và A3 di động dương tính ($+$), còn chủng A1 không di động (âm tính $-$).

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả K'Jap đã thực hiện thành công việc phân lập và làm thuần 3 chủng vi khuẩn (A1, A2, A3) từ hệ tiêu hóa của ấu trùng sâu sáp Galleria mellonella sau giai đoạn tiêu thụ 105,33 mg nhựa polystyrene trong 7 ngày. Thông qua các thử nghiệm hình thái, sinh hóa và kỹ thuật sinh học phân tử giải trình tự vùng gene 16S rDNA, 3 chủng vi khuẩn đã được định danh chính xác là Bacillus inaquosorum (KF879309.1), Bacillus subtilis (EF530208.2) và Enterobacter cloacae (MT507092.1). Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học và nguồn giống vi sinh vật ban đầu, tạo tiền đề cho các nghiên cứu chuyên sâu tiếp theo về cơ chế enzyme phân hủy sinh học chất thải nhựa polystyrene nhằm phục vụ công tác bảo vệ môi trường.