Khóa luận tốt nghiệp nghiên cứu khả năng nhân nhanh loài hài hương lan paphiopedilum emersonii bằng phương pháp in vitro

Khóa luận nghiên cứu khả năng nhân nhanh loài hài hương lan paphiopedilum emersonii bằng phương pháp in vitro, góp phần bảo tồn và phát triển loài.

• Tác giả: Nguyễn Quốc Ân
• Người hướng dẫn: ThS. Nguyễn Thị Tình
• Trường học: Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu khả năng nhân nhanh loài Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) bằng phương pháp in vitro
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Thái Nguyên

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu nhân nhanh loài hài hương lan Paphiopedilum emersonii

Nghiên cứu về khả năng nhân nhanh loài hài hương lan Paphiopedilum emersonii bằng phương pháp in vitro đang trở thành một chủ đề nóng trong lĩnh vực sinh học thực vật. Loài lan này không chỉ có giá trị thẩm mỹ cao mà còn đang đứng trước nguy cơ tuyệt chủng do khai thác quá mức. Việc áp dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật giúp bảo tồn và phát triển giống loài này một cách bền vững.

1.1. Đặc điểm sinh học của loài hài hương lan Paphiopedilum emersonii

Loài Paphiopedilum emersonii có đặc điểm hình thái độc đáo với hoa có màu sắc đẹp và cấu trúc môi đặc biệt. Chúng thường mọc trên các vách núi và có số lượng cá thể rất ít, khiến cho việc bảo tồn trở nên cấp thiết.

1.2. Tình trạng hiện tại của loài hài hương lan tại Việt Nam

Tại Việt Nam, Paphiopedilum emersonii đang bị đe dọa nghiêm trọng do tình trạng khai thác và mất môi trường sống. Việc nghiên cứu và phát triển các phương pháp nhân giống là cần thiết để bảo tồn loài này.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu nhân giống in vitro

Mặc dù phương pháp in vitro mang lại nhiều lợi ích, nhưng vẫn tồn tại nhiều thách thức trong việc nhân giống loài Paphiopedilum emersonii. Các yếu tố như điều kiện môi trường, nồng độ hormone và thời gian nuôi cấy đều ảnh hưởng đến khả năng tái sinh và phát triển của cây con.

2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô

Nồng độ hormone như BA và NAA có vai trò quan trọng trong việc kích thích sự phát triển của chồi và rễ. Việc xác định nồng độ tối ưu là một thách thức lớn trong nghiên cứu này.

2.2. Khó khăn trong việc tạo môi trường nuôi cấy phù hợp

Môi trường dinh dưỡng cần được điều chỉnh để phù hợp với nhu cầu sinh trưởng của Paphiopedilum emersonii. Việc tìm ra công thức môi trường tối ưu là một trong những thách thức lớn nhất trong nghiên cứu.

III. Phương pháp nghiên cứu nhân nhanh loài hài hương lan

Phương pháp in vitro được áp dụng để nhân nhanh loài Paphiopedilum emersonii bao gồm các bước chuẩn bị mẫu, khử trùng và nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng. Quy trình này giúp tạo ra số lượng lớn cây con trong thời gian ngắn.

3.1. Quy trình khử trùng mẫu cây

Khử trùng mẫu cây bằng dung dịch H2O2 là bước quan trọng để đảm bảo môi trường nuôi cấy không bị nhiễm khuẩn. Nghiên cứu đã xác định nồng độ và thời gian khử trùng hiệu quả.

3.2. Thiết lập môi trường nuôi cấy in vitro

Môi trường nuôi cấy được thiết lập dựa trên công thức Murashige & Skoog, với sự điều chỉnh nồng độ các hormone sinh trưởng để tối ưu hóa khả năng tái sinh chồi và ra rễ.

IV. Kết quả nghiên cứu về khả năng nhân nhanh loài hài hương lan

Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng việc áp dụng phương pháp in vitro có thể tạo ra số lượng lớn cây con Paphiopedilum emersonii trong thời gian ngắn. Các thí nghiệm đã chỉ ra rằng nồng độ hormone BA và NAA có ảnh hưởng tích cực đến sự phát triển của cây con.

4.1. Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh

Nghiên cứu cho thấy nồng độ BA 2,0 mg/l mang lại hiệu quả cao nhất trong việc kích thích sự phát triển của chồi. Kết quả này mở ra hướng đi mới cho việc nhân giống loài lan quý hiếm này.

4.2. Kết quả ra rễ của cây con trong môi trường nuôi cấy

Việc sử dụng NAA kết hợp với than hoạt tính đã cho thấy khả năng ra rễ tốt, giúp cây con phát triển khỏe mạnh và có khả năng sống sót cao khi đưa ra môi trường tự nhiên.

V. Ứng dụng thực tiễn của nghiên cứu nhân nhanh loài hài hương lan

Nghiên cứu về nhân nhanh loài Paphiopedilum emersonii không chỉ có ý nghĩa trong việc bảo tồn mà còn mở ra cơ hội cho việc phát triển thương mại. Việc sản xuất giống cây sạch bệnh và đồng đều sẽ đáp ứng nhu cầu thị trường và bảo vệ loài này khỏi nguy cơ tuyệt chủng.

5.1. Ứng dụng trong bảo tồn loài lan quý hiếm

Phương pháp nhân giống in vitro giúp bảo tồn giống Paphiopedilum emersonii trước nguy cơ tuyệt chủng, đồng thời tạo ra nguồn giống cho các chương trình bảo tồn khác.

5.2. Tiềm năng phát triển thương mại từ giống lan

Việc nhân nhanh giống lan có thể tạo ra nguồn thu nhập cho người dân địa phương thông qua việc cung cấp giống cây cho thị trường trong và ngoài nước.

VI. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu khả năng nhân nhanh loài Paphiopedilum emersonii bằng phương pháp in vitro đã mở ra nhiều triển vọng cho việc bảo tồn và phát triển giống lan quý hiếm này. Các kết quả đạt được sẽ là cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm tối ưu hóa quy trình nhân giống.

6.1. Kết luận về hiệu quả của phương pháp in vitro

Phương pháp in vitro đã chứng minh hiệu quả trong việc nhân nhanh loài Paphiopedilum emersonii, góp phần bảo tồn và phát triển giống lan quý hiếm này.

6.2. Triển vọng nghiên cứu trong tương lai

Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình nuôi cấy và mở rộng ứng dụng của công nghệ in vitro trong bảo tồn các loài thực vật quý hiếm khác.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Họ Lan, hay họ Phong lan, (danh pháp khoa học: Orchidaceae) là một họ thực vật có hoa, thuộc bộ Măng tây (Asparagales), lớp thực vật một lá mầm Họ Orchideceae là một trong những họ lớn nhất của thực vật và có các thành viên mọc trên toàn thế giới, ngoại trừ châu Nam Cực; có cây hoa lan sống dưới mặt đất và chỉ nở hoa trên mặt đất cũng như có cây hoa lan sống tại vùng cao nguyên của dãy núi Himalaya; hoa lan có thể tìm thấy tại các vùng có khí hậu nhiệt đới như trong rừng già của Brasil đến các vùng có tuyết phủ trong mùa đông như tại bình nguyên của Manitoba, Canada. Các loài lan chủ yếu mọc trên cây cao, sống biểu sinh lâu năm. Chúng được gọi chung là phong lan. Bên cạnh đó cũng có các loài mọc trong đất, tức là địa lan và có một số loài mọc trên đá tức thạch lan.

Họ Orchidaceae phân bổ rộng khắp thế giới, gần như có thể có mặt trong mọi môi trường sống, ngoại trừ các sa mạc và sông băng. Phần lớn các loài được tìm thấy trong khu vực nhiệt đới, chủ yếu là châu Á, Nam Mỹ và Trung Mỹ. Chúng cũng được tìm thấy tại các vĩ độ cao hơn vòng Bắc cực, ở miền nam Patagonia và thậm chí trên đảo Macquarie, gần với châu Nam Cực. Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) có khu phân bố hẹp tại một số nơi như Thái Nguyên và Vĩnh Phúc với số lượng cá thể rất ít, trên các vách núi dựng đứng và loài cây làm cảnh rất quý vì hoa có màu sắc đẹp dịu dàng với cấu tạo môi có hạt độc đáo, cánh hoa hình bầu dục rộng - gần tròn, ở gốc có lông dài và chấm tía, mép bên đôi khi uốn vào trong; môi màu vàng hay da cam nhạt, gân hình cầu với các chấm to và trắng đục như hạt ngọc lại rất hiếm có giá trị thẩm mỹ cao nên rất được thế giới ưa chuộng dẫn đến tình trạng thu thập và xuất khẩu hài hương lan khiến chúng đang đứng trên bờ vực của sự tuyệt chủng ngoài thiên nhiên do việc thu mẫu ồ ạt nhằm mục đích thương mại.

Hiện nay, trong quá trình phát triển kinh tế xã hội, nhiều loài lan quý hiếm đang bị đe doạ tuyệt chủng. Trong đó phải kể đến hài Hương Lan là một trong các 2 loài lan Hài quý của Việt Nam đang bị đe doạ nghiêm trọng. Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật việc ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật (in vitro) trong nhân giống đã trở nên phổ biến. Nuôi cấy in vitro tạo ra những giống cây trồng sạch bệnh, chất lượng tốt, đồng đều cao và hệ số nhân lớn trong thời gian ngắn.

Bởi vậy, phương pháp nhân giống hài vô tính in vitro Hài Hương Lan.đã và đang mở ra triển vọng tốt cho việc bảo tồn các loài thực vật quý hiếm và phát triển các giống lan quy hiếm này. Xuất phát từ thực tiễn đó chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu khả năng nhân nhanh loài Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) bằng phương pháp in vitro” 1.2 Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu thành công quy trình nhân nhanh giống Hài Hương Lan từ đoạn thân non mang chồi ngủ bằng phương pháp in vitro.3 Yêu cầu của đề tài - Xác định nồng độ và thời gian khử trùng mẫu trong dung dịch H2O2 đến hiệu quả tạo vật liệu vô trùng. - Xác định được ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng tái sinh chồi Hài Hương Lan. - Xác định được ảnh hưởng của nồng độ một số Cytokiinine đến khả năng nhân nhanh Hài Hương Lan.

- Xác định được ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt tính đến khả năng ra rễ cây Hài Hương Lan.4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 1.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài - Giúp sinh viên củng cố và hệ thống lại các kiến thức đã học và bổ sung vào kiến thức lý thuyết được học thông qua hoạt động thực tiễn. - Giúp bản thân sinh viên học hỏi kiến thức, tích lũy được kinh nghiệm thực tế cũng như tác phong làm việc, nghiên cứu khoa học phục vụ cho cho công tác sau này. 3 - Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp các dữ liệu khoa học mới về nhân giống cây Hài Hương lan bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật, góp phần làm phong phú cơ sở dữ liệu về kỹ thuật nuôi cấy mô. Ý nghĩa thực tiễn Đề xuất được quy trình nhân nhanh loài Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) bằng phương phán nuôi cấy in vitro, tạo ra số lượng giống hài Hương Lan góp phần bảo tồn giống hoa quý hiếm trước nguy cơ tuyệt chủng đồng thời tạo nguồn vật liệu cho nghiên cứu khoa học.

4 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Tổng quan về lan Hài 2. Phân loại và nguồn gốc 2. Phân loại Lan Hài (Paphiopedium) là một nhánh của họ Lan (Orchidaceae) thuộc bộ Lan (Orchidales), phân lớp hành (Liliidae), lớp một lá chồi (Monocotyledoneae), nghành hạt kín (Angiospermatophyta).

Lan Hài là một nhóm rất đặc trưng trong họ lan. Chúng dễ dàng nhận ra bởi cấu trúc hoa đặc biệt khác thường với một cánh hoa giữa hình túi sâu trông giống như một chiếc Hài, nằm ở vị trí thấp nhất của hoa, tạo nên một vẻ ngoài đặc sắc có thể dễ dàng phân biệt với các loại lan khác. Về mặt thực vật học, các loài lan Hài thuộc vào 5 chi là: - Chi Cypripedium có khoảng 50 loài, thường được gọi là Hài Vệ nữ, phân bố ở các vùng ôn đới và núi của bán cầu bắc. - Chi Mexipedium, chi Phragmipedium và chi Selenipedium gồm khoảng 25 loài phân bố ở vùng nhiệt đới châu Mĩ.

- Chi Paphiopedilum có khoảng 75 loài phân bố ở vùng nhiệt đới châu Á từ Nam Ấn Độ và Đông Hymalaya đến Philippine, New Guinea và Quần đảo Solomon. Ở Việt Nam các loài lan Hài đều thuộc chi Paphipedilum, thuộc tông, Cypripedioideae, họ phụ Epidendroideae, họ Lan (Orchidaceae), bộ lan (Orchidales), phân lớp Hành (Liliidae), lớp một lá mầm (Monocotyledoneae), ngành hạt kín (Angiospermatophyta), giới thực vật (Plantae) [1],[13]. Nguồn gốc Chi Paphiopedilum có nguồn gốc từ vùng lục địa Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam. Các loài nguyên thuỷ nhất của chi này được tìm thấy chủ yếu ở Trung Quốc và miền Bắc Việt Nam, mỗi loại trong chi này đều có khu phân bố rất hạn chế.

Hầu như tất cả các loài lan đều bắt nguồn từ các tổ tiên kiểu hypoxis có sáu mảnh bao hoa (ba mảnh bao vòng ngoài gọi là ba lá đài và ba mảnh bao vòng trong 5 gọi là ba cánh hoa) và sáu nhị đực (ba nhị đực ở vòng ngoài và ba nhị đực ở vòng trong). Xu hướng tiến hoá của họ Lan là giảm số lượng nhị đực và sự dính liền giữa nhị đực hữu thụ với nhị cái là sự biến đổi hoa cơ bản nhất dẫn đến sự tiến hoá của họ Lan. Sự giảm liên tục số lượng nhị đực dẫn đến sự hình thành các nhóm lan có ba, hai hay một nhị đực tồn tại trong hoa. Trong họ Lan, chi lan Hài (thuộc tông Cypripedioideae) là dòng tiến hoá có hai nhị đực còn tồn tại trong hoa [1],[13].

Đặc điểm hình thái Các loài lan Hài (Paphiopedilum) ở Việt Nam có thể có hình dạng bên ngoài rất đa dạng tuy nhiên chúng đều mang những đặc điểm hình thái: - Dạng cây: Là các loài thân cỏ có kích thước trung bình với thân mang nhiều lá mọc thành hai hàng xếp thành hình quạt, đôi khi có dạng thân bò. Tất cả các loài đều có thân rễ nhưng đa số rất ngắn [1] - Lá: thường có dạng lá dài gấp đôi, hình trứng ngược hay bầu dục thuôn và mở rộng. Mỗi lá có đốt ở gốc, dưới đó là bẹ lá hình chữ V xếp lợp xít lên nhau trên thân. Độ dài của lá có thể từ 3- 50 cm.

Mặt trên của lá có thể có màu xanh lá cây hoặc khảm bởi các mảng đậm nhạt không đều với các gân màu xanh lá nổi rõ. Mặt dưới lá có các đốm tím dày đặc hoặc vết tím xỉn chỉ thấy rõ ở gần gốc lá. Lá của các loài điển hình cho điều kiện sống khô đều dày, mọng nước và cứng [1]. - Cụm hoa: thường thẳng đứng hay cong.

Một số loài có cuống hoa nằm ngang, một số loài lại có cuống hoa chúc xuống, nhưng hầu hầu các loài đều có cuống hoa dựng đứng. Phần lớn các loài chỉ có một hoa riêng lẻ. Tuy nhiên cũng có loài có cụm hoa mang hai hoa, xong rất hiếm. Trục cụm hoa có lông tơ dầy và ngắn hay có lông nhung hoặc nhẵn.

Lá hoa của cụm hoa gấp đôi và có hình dạng rất khác nhau tùy từng loài, từ hình múi giáo hay hình trứng và có chóp nhọn đến hình bầu dục tròn. Lá hoa thường có ít lông tơ hơn các phần khác của cụm hoa nhưng nói chung thường có lông ở mép và lông cứng gần giữa ở mặt ngoài lá, ở một số loài có lá hoa nhẵn. - Hoa: Gồm hai lá đài ở vòng ngoài, một lá đài lưng, một lá đài hợp và ba cánh hoa ở vòng trong. Lá đài lưng thường lớn, hướng thẳng lên trên và thường nổi bật với các vạch hay chấm ở mặt trong.

Lá đài lưng nằm đối diện với lá đài hợp ở vị trí thấp 6 hơn và hướng xuống phía dưới. Lá đài hợp nằm phía sau của môi thường có một màu tối xỉn và kém nổi bật hơn so với lá đài lưng. Cả hai lá đều thường có lông tơ dày ở mặt ngoài [1]. Hai cánh hoa bên đều dễ dàng nhận thấy ở hai bên lá đài và thường hơi xoè xuống dưới theo chiều ngang.

Chúng có thể có hình thìa, bầu dục, trứng rộng hay tròn. Cánh hoa hình mũi giáo hẹp, xoắn ốc hẹp dần từ gốc lên đến đỉnh. Cánh hoa giữa thứ ba biến dạng rõ rệt thành một môi giống như cái bao hoặc hình chiếc hài. Môi dạng túi sâu và phồng lên, hình giầy, có lông ở mặt trong và nhẵn ở mặt ngoài.

Nhị bất thụ của vòng ngoài và nhuỵ cái hợp thành cột nhị- nhuỵ. Hai nhị đực hữu thụ của vòng trong có chỉ nhị ngắn dính liền ở phía sau núm nhuỵ và hai bên cuốn cột. Bầu dưới, một ô, đỉnh noãn bên là điểm đặc trưng của chi này. Hầu hết các loài lan Hài, bầu có lông tơ, hình trụ, màu xanh lá cây hay đỏ tía xỉn [1].

- Quả: Dạng quả nang, khô, dài, có một ô với ba van rộng và ba van hẹp. Quả mở ở gần đỉnh bằng 6 rãnh nứt. Quả thường chín trong điều kiên tự nhiên sau khi thụ phấn từ sáu đến mười tháng [1].