Đặt vấn đề Nước ta có trữ lượng lan rừng rất lớn và nhiều loài có giá trị như: Vanda, Phaphiopedilum, Cymbidium và Dendrobium. Dendrobium là một trong những giống hoa lan phong phú, đa dạng với hơn 1500 loài. Dendrobium khá phong phú về màu sắc và hương thơm của hoa. Ngoài ra loài hoa này còn có giá trị dược liệu.
Lan Thạch hộc thuộc chi Dendrobium. Đây là đối tượng cây quý hiếm. Đặc điểm của giống là sai hoa, hoa to, đẹp, hương thơm nên rất được ưa chuộng. Theo Đặng Văn Đông (2004) [4] hiện nay giá của một cây hoa lan có thể từ 100.
Lan Thạch hộc (Dendrobium nobile Lindt) phân bố ở vùng trung du miền núi phía bắc Việt Nam. Qua kiểm nghiệm lâm sàng cho thấy loài lan này có nhiều giá trị dược học: chống ung thư, lão hóa và tăng sức đề kháng của cơ thể [44], [48]. Điều làm nên giá trị dược liệu của loài lan này chính là hợp chất alkaloid. Với giá trị dược liệu lan Thạch hộc đã bị khai thác tới mức bị tuyệt chủng trong tự nhiên [8], [49].
Hiện nay Lan Thạch hộc nằm trong danh mục Đỏ của cuốn “Sách đỏ Việt Nam” năm 2007 [21]. Số loài lan quý hiếm như Đuôi chồn, Đai Châu, Lan Hài đang bị đe dọa tuyệt chủng trong tự nhiên được bảo tồn nhờ phương thức nảy mầm từ hạt [47]. Chính vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu nhân giống lan Thạch hộc (Dendrobium nobile Lindt) từ hạt bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô tại trƣờng Đại học Nông lâm Thái Nguyên” với mục đích bảo tồn nguồn dược liệu quý đồng thời góp phần phát triển một loài thuốc nam có giá trị. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài 1.
Mục tiêu của đề tài Tái sinh và nhân giống lan Thạch hộc bằng phương pháp in vitro. Yêu cầu của đề tài - Xác định hiệu quả khử trùng của NaClO ở nồng độ và các mốc thời gian đến khả năng tạo vật liệu sạch nấm và vi khuẩn đưa vào nuôi cấy. - Xác định ảnh hưởng môi trường MS, 1/2MS, 2/3MS, B5 và WPM đến tỉ lệ nảy mầm của hạt lan. - Xác định ảnh hưởng nồng độ chất kích thích sinh trưởng và hợp chất hữu cơ đến nhân nhanh cụm chồi lan Thạch hộc.
- Xác định nồng độ NAA và than hoạt tính đến khả năng ra rễ lan Thạch hộc. - Xác định loại giá thể thích hợp đến sinh trưởng và phát triển của cây con ở giai đoạn vườn ươm. Ý nghĩa của đề tài - Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu sẽ xây dựng được một biện pháp kỹ thuật nhân giống Lan Thạch hộc bằng phương pháp in vitro. - Ý nghĩa thực tiễn Đề xuất được quy trình nhân nhanh giống Lan Thạch hộc bằng phương pháp nuôi cấy in vitro, đảm bảo cung cấp số lượng lớn cây giống có chất lượng cao, đồng đều cho sản xuất.
n 3 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Giới thiệu chung về hoa lan 2. Nguồn gốc và phân loại 2.1 Nguồn gốc Các họ lan được đánh giá là loài hoa cao cấp trong vương quốc thảo mộc, bao gồm hơn 25.000 loài khác nhau, cùng với những loài mới được khám phá và mô tả theo từng năm. Do chúng được phân bố vùng rộng lớn, trải dài từ xích đạo đến bắc cực, từ đồng bằng tới các vùng núi băng tuyết, các loài lan rất khác nhau.
Các loài lan chủ yếu sống trên cây cao, sống biểu sinh lâu năm, chúng được gọi chung là phong lan. Các loài mọc trong đất gọi là địa lan và một số loài mọc trên núi đá gọi là thạch lan [8]. Cây lan được biết đến đầu tiên ở Phương Đông khoảng từ 551- 479 trước công nguyên [20]. Ở Việt Nam, những nghiên cứu về lan ở buổi đầu không rõ rệt, người đầu tiên khảo sát hoa lan ở Việt Nam là ông Gioolas Noureiro nhà truyền giáo Bồ Đào Nha đã tả cây lan đầu tiên ở Việt Nam vào năm 1789 trong “Flora Cochinnis” gọi tên các cây lan trong cuộc hành trình tìm đến phía nam Việt Nam: Alrides, Phagius và Sarcopodium.
đã được BenTham và Hooker ghi lại trong cuốn “Genera rum” (1862-1885). Chỉ sau khi người Pháp đến Việt Nam mới có công trình được công bố đáng kể là: F.gnillaumin mô tả 101 chi gồm 70 loài lan cho cả 3 nước Đông Dương trong bộ “Thực vật Đông Chí Dương” [13].2 Phân loại Theo hệ thống thực vật học mới nhất cây hoa lan được phân loại như sau [8]: Giới: Plantae Ngành: Magnoliophyta Lớp: Liliospida Bộ: Asparagales Phân họ: Orchidaceae n 4 Đặc điểm về phân loại: Orchidacae là một họ rất lớn thuộc lớp đơn tử diệp, phân bố khắp nơi trên thế giới. Ở vùng ôn đới, ta gặp nhiều loài sống ở đất như địa lan, một số loài hoại sinh không diệp lục và sống vào chất mùn trong đất. Có loài ở châu Úc có thể sống ngầm dưới đất như nấm [8].
Ở vùng nhiệt đới ta sẽ gặp nhiều loại phụ sinh sống trên cây khác như cattleya, oncidium, laelia tập trung nhiều ở vùng Trung Mỹ, ở Đông Nam Á đặc sắc nhất là Denbrodium và còn có Cypripedium, Phalaenopsis, Cymbidium có nguồn gốc ở Inđônêsia. Cây lan có thể chia thành hai nhóm: Nhóm đơn thân và nhóm đa thân. * Nhóm đơn thân chia làm hai nhóm phụ: - Nhóm phụ lá mọc đối (Sarcanthinae): Nhóm này lá được xếp thành hai hàng mọc đối nhau. Gồm các giống như: Vanda, Aerides, Phalaenopsis.
- Nhóm phụ lá dẹp thẳng hay tròn (Campylocentrinae): Papilionanthe, Luisia. * Nhóm đa thân: Gồm những cây tăng trưởng liên tục. Căn cứ vào cách ra hoa nhóm này chia thành hai nhóm phụ: - Nhóm ra hoa phía trên như: Cymbidium, Dedrobium, Oncidium. - Nhóm ra hoa ở đỉnh: Cattleya, Laelia, Epidendrum.
* Ngoài ra còn có một số giống mang tính chất trung gian như: Centropetatum, Phachyphllum, Dichaea. Theo nhiều nhà nghiên cứu về hoa của trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, với khoảng 897 loài phong lan hiện có và khí hậu thích hợp, nguồn nguyên liệu làm giá thể dồi dào cho cây sinh trưởng, phát triển. Việt Nam có thể trở thành một nước sản xuất hoa phong lan lớn trong khu vực [8]. Đặc điểm sinh học 2.1 Cơ quan dinh dưỡng Giả hành (thân giả): Chỉ xuất hiện ở các loài đa thân.
Bộ phận giả hành cần thiết cho sinh trưởng, phát triển của lan. Giả hành tuy là thân nhưng lại chứa diệp lục, đây là bộ phận dự trữ nhiều chất dinh dưỡng, nước cần thiết cho sự phát triển của giả hành mới [20]. n 5 Thân: Lan có 2 loại thân: Đơn thân và đa thân [20]. + Củ giả rất đa dạng: Hình cầu hoặc hình thuôn dài xếp sát nhau hay rải rác đều hoặc hình trụ xếp chồng chất lên nhau thành một thân giả.
+ Cấu tạo củ giả: Gồm nhiều mô mềm chứa nhiều dịch nhầy, phía ngoài là lớp biểu bì với vách tế bào dày, nhẵn bóng bảo vệ, tránh sự mất nước do ánh sáng mặt trời. Đa số củ giả đều có màu xanh bóng, nên cùng với lá nó làm nhiệm vụ quang hợp. Lá: Đa số các loài phong lan là cây tự dưỡng, nó phát triển đầy đủ hệ thống lá. Hình dạng của lá thay đổi rất nhiều, từ loại lá mọng nước đến loại lá phiến mỏng.
Phiến lá trải rộng hay gấp lại theo các gân vòng cung hay chỉ gấp lại theo gân hình chữ V. Màu sắc lá thường xanh bóng nhưng có trường hợp 2 mặt lá khác nhau: Thường mặt dưới có màu xanh đậm hay tía, mặt trên lại khảm nhiều màu sắc sặc sỡ [20]. Rễ: Phong lan thuộc họ sống phụ sinh, treo lơ lửng trên các cây thân gỗ khác. Các loại thân gỗ nạc dài, ngắn, mập hay mảnh mai đưa cơ thể bò đi xa hay chụm lại thành các bụi dày.
Đặc biệt đối với lan công nghiệp (nuôi cấy mô) người ta thường sử dụng một số giá thể nuôi như: Dớn, than củi, … Rễ làm nhiệm vụ hấp thu chất dinh dưỡng, chúng được bao bởi lớp mô hút dày, ẩm. Bao gồm: Những lớp tế bào chết chứa đầy không khí, do đó nó ánh lên màu xám bạc. Với lớp mô xốp đó rễ có khả năng hấp thu nước mưa chảy dọc dài trên vỏ cây, lấy nước lơ lửng trên không khí [7], [20].2 Cơ quan sinh sản Hoa: Lưỡng tính, rất hiếm các loại phong lan đơn tính, tạp tính và nhị dạng. Hoa đối xứng qua một mặt phẳng, bên ngoài có 6 cánh, trong đó 3 cánh đài ở ngoài cùng, thường có màu sắc và kích thước giống nhau.
Một cánh đài nằm phía trên hay phía sau của hoa gọi là cánh đài lý, 2 cánh dài nằm 2 bên gọi là cánh đài cạnh. Nằm kề bên trong và xen kẽ với 3 cánh đài là 3 cánh hoa. Chúng giống nhau về hình dạng, kích thước, màu sắc. Cánh còn lại nằm ở phía trên hay phía dưới, có hình dạng và màu sắc khác hẳn với các cánh còn lại gọi là cánh môi.
Cánh môi quyết định giá trị thẩm mỹ của hoa lan. Ở giữa hoa có một trụ nổi lên bộ phận sinh dục của cây, giúp cây duy trì nòi giống. Trụ gồm nhị và nhụy, sau khi thụ phấn các cánh hoa héo, cuống hoa hình thành quả lan [7], [8], [20]. n 6 Quả và hạt: Quả lan thuộc loại quả nang, nở ra theo 3-6 đường nứt dọc, quả có dạng cài dài đến hình trụ ngắn phình ở giữa.
Khi chín quả nở ra và mảnh vỏ còn dính lại với nhau ở phía đỉnh và phía gốc. Ở một số loài quả chỉ mở theo 1-2 khía dọc, thậm chí không nứt ra, và hạt chỉ ra khỏi vỏ quả khi vỏ này mục nát [8]. Hạt lan rất nhiều, kích thước nhỏ. Hạt chỉ cấu tạo bởi một phôi chưa phân hoá, trên một mạng lưới nhỏ, xốp, chứa đầy không khí.
Hạt trưởng thành sau 2-18 tháng. Hạt phong lan không có nội nhũ nên nó khó có khả năng phát triển thành cây. Các loài lan rừng chủ yếu nhờ nấm cộng sinh để phát triển thành cây. Các phương pháp nhân giống 2.1 Phương pháp nhân giống hữu tính Cơ chế sinh sản hữu tính của lan Thạch hộc cũng giống như một số loài cây khác, bao gồm: Quá trình hình thành giao tử và thụ tinh khi hạt phấn chín tiếp xúc với núm nhụy nhờ côn trùng hay con người.
Núm nhụy tiết ra các hoocmon sinh trưởng nhờ vậy mà hạt phấn có thể nảy mầm được. Sau đó, hạt phấn này theo trục hợp nhụy xuống bầu noãn để tinh tử kết hợp với tế bào trứng tạo nên hợp tử. Bầu noãn lớn dần lên, cánh hoa và đài hoa héo đi, quả dần dần được lớn từ bầu noãn trương phồng [33].