Luận Văn Thạc Sĩ: Nghiên Cứu Nhân Giống Lan Thạch Hộc Dendrobium Nobile Bằng Phương Pháp Nuôi Cấy Mô

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu nhân giống lan thạch hộc Dendrobium nobile Lindt từ hạt bằng phương pháp nuôi cấy mô tại Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.

• Tác giả: Đỗ Thị Hào
• Người hướng dẫn: Nguyễn Thị Tình
• Trường học: Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu nhân giống lan Thạch hộc (Dendrobium nobile Lindl) từ hạt bằng phương pháp nuôi cấy mô tại trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp đại học
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài
• 1.1.1. Mục tiêu của đề tài
• 1.1.2. Yêu cầu của đề tài
• 1.1.3. Ý nghĩa của đề tài
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Giới thiệu chung về hoa lan
• 2.2. Nguồn gốc và phân loại
• 2.2.1. Nguồn gốc
• 2.2.2. Phân loại
• 2.3. Đặc điểm sinh học
• 2.3.1. Cơ quan dinh dưỡng
• 2.3.2. Cơ quan sinh sản
• 2.3.3. Hoa
• 2.3.4. Quả và hạt
• 2.4. Các phương pháp nhân giống
• 2.4.1. Phương pháp nhân giống hữu tính
• 2.4.1.1. Phương pháp nảy mầm cộng sinh nấm
• 2.4.1.2. Phương pháp nảy mầm không cộng sinh
• 2.4.1.3. Phương pháp gieo hạt xanh
• 2.4.1.4. Phương pháp gieo hạt chín
• 2.4.2. Phương pháp nhân giống vô tính
• 2.4.2.1. Phương pháp cơ học (chiết ngọn, xiết ngọn)
• 2.4.2.2. Phương pháp kích thích tố
• 2.4.2.3. Phương pháp tạo cây con trên phát hoa
• 2.5. Giá thể trồng lan
• 3. PHẦN 3: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Đối tượng, vật liệu và phạm vi nghiên cứu
• 3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu
• 3.3. Điều kiện nuôi cấy
• 3.4. Hóa chất và thiết bị
• 3.5. Nội dung nghiên cứu
• 3.5.1. Phương pháp nghiên cứu
• 3.5.1.1. Nghiên cứu hiệu quả khử trùng của NaOCl ở nồng độ, thời gian khác nhau đến khả năng tạo vật liệu sạch nấm và vi khuẩn đưa vào nuôi cấy (sau 1 tuần theo dõi)
• 3.5.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại môi trường (MS, 1/2MS, 2/3MS, B5, và WPM) đến tỉ lệ nảy mầm hạt lan Thạch hộc (sau 12 tuần theo dõi)
• 3.5.1.3. Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ của một số chất kích thích sinh trưởng và hợp chất hữu cơ đến nhân nhanh cụm chồi lan Thạch hộc tái sinh từ hạt (sau 4 tuần theo dõi)
• 3.5.1.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt tính đến khả năng ra rễ lan Thạch hộc (sau 4 tuần theo dõi)
• 3.5.1.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số giá thể đến khả năng sinh trưởng của cây lan Thạch hộc ở vườn ươm (sau 4 tuần theo dõi)
• 3.5.2. Chỉ tiêu theo dõi
• 3.5.3. Phương pháp xử lí số liệu
• 4. PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả nghiên cứu hiệu quả khử trùng của NaOCl ở nồng độ, thời gian khác nhau đến khả năng tạo vật liệu sạch nấm và vi khuẩn đưa vào nuôi cấy
• 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường (MS, 1/2MS, 2/3MS, B5 và WPM) đến tỉ lệ nảy mầm hạt lan Thạch hộc (sau 12 tuần theo dõi)
• 4.3. Kết quả ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng và hợp chất hữu cơ đến nhân nhanh chồi lan Thạch hộc tái sinh từ hạt (sau 4 tuần theo dõi)
• 4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ BA, Kinetine và TDZ đến khả năng nhân cụm chồi lan Thạch hộc tái sinh từ hạt
• 4.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hợp chất hữu cơ đến nhân nhanh cụm chồi lan Thạch hộc tái sinh từ hạt
• 4.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt tính đến khả năng ra rễ lan Thạch hộc (sau 4 tuần theo dõi)
• 4.7. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số giá thể đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây lan Thạch hộc con ở giai đoạn vườn ươm (sau 4 tuần theo dõi)
• 5. PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Tóm tắt

I. Giới thiệu về nghiên cứu

Nghiên cứu này tập trung vào nhân giống lan Thạch hộc (Dendrobium Nobile) bằng phương pháp nuôi cấy mô tại Đại học Nông Lâm Thái Nguyên. Mục tiêu chính là bảo tồn loài lan quý hiếm này, đồng thời phát triển nguồn dược liệu có giá trị. Lan Thạch hộc là loài có giá trị dược liệu cao, nhưng đang bị đe dọa tuyệt chủng do khai thác quá mức. Nghiên cứu sử dụng phương pháp nuôi cấy mô để tái sinh và nhân giống từ hạt, đảm bảo cung cấp số lượng lớn cây giống chất lượng cao.

1.1. Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu chính của nghiên cứu là tái sinh và nhân giống lan Thạch hộc bằng phương pháp in vitro. Nghiên cứu nhằm xác định hiệu quả của các yếu tố như môi trường nuôi cấy, chất kích thích sinh trưởng, và giá thể trong quá trình nhân giống. Kết quả sẽ góp phần xây dựng quy trình nhân giống hiệu quả, đáp ứng nhu cầu bảo tồn và phát triển loài lan quý hiếm này.

1.2. Ý nghĩa của nghiên cứu

Nghiên cứu có ý nghĩa khoa học và thực tiễn lớn. Về mặt khoa học, nghiên cứu góp phần hoàn thiện kỹ thuật nuôi cấy mô cho lan Thạch hộc. Về mặt thực tiễn, nghiên cứu đề xuất quy trình nhân giống hiệu quả, giúp cung cấp số lượng lớn cây giống chất lượng cao, phục vụ sản xuất và bảo tồn loài lan quý hiếm này.

II. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng phương pháp nuôi cấy mô để nhân giống lan Thạch hộc từ hạt. Các bước nghiên cứu bao gồm khử trùng hạt, xác định môi trường nuôi cấy thích hợp, sử dụng chất kích thích sinh trưởng, và đánh giá hiệu quả của các giá thể khác nhau. Phương pháp này đảm bảo tính chính xác và hiệu quả trong việc tạo ra cây giống chất lượng cao.

2.1. Khử trùng hạt

Quá trình khử trùng hạt được thực hiện bằng NaOCl ở các nồng độ và thời gian khác nhau. Mục tiêu là loại bỏ nấm và vi khuẩn, đảm bảo vật liệu nuôi cấy sạch. Kết quả cho thấy nồng độ và thời gian khử trùng ảnh hưởng đáng kể đến tỷ lệ sống sót của hạt.

2.2. Môi trường nuôi cấy

Nghiên cứu đánh giá hiệu quả của các môi trường nuôi cấy như MS, 1/2MS, B5, và WPM đối với tỷ lệ nảy mầm của hạt. Kết quả cho thấy môi trường MS và 1/2MS mang lại tỷ lệ nảy mầm cao nhất, phù hợp cho quá trình nhân giống.

III. Kết quả và thảo luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp nuôi cấy mô hiệu quả trong việc nhân giống lan Thạch hộc. Tỷ lệ nảy mầm của hạt đạt cao nhất khi sử dụng môi trường MS và 1/2MS. Chất kích thích sinh trưởng như BA và Kinetine có tác động tích cực đến quá trình nhân cụm chồi. Giá thể phù hợp nhất cho sự phát triển của cây con là hỗn hợp than hoạt tính và xơ dừa.

3.1. Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng

Nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng như BA, Kinetine, và TDZ đến quá trình nhân cụm chồi. Kết quả cho thấy BA ở nồng độ 2 mg/l mang lại hiệu quả cao nhất trong việc kích thích tái sinh chồi.

3.2. Ảnh hưởng của giá thể

Nghiên cứu đánh giá hiệu quả của các giá thể khác nhau như than hoạt tính, xơ dừa, và dớn đối với sự phát triển của cây con. Kết quả cho thấy hỗn hợp than hoạt tính và xơ dừa là giá thể phù hợp nhất, giúp cây con phát triển tốt trong giai đoạn vườn ươm.

IV. Kết luận và kiến nghị

Nghiên cứu đã thành công trong việc nhân giống lan Thạch hộc bằng phương pháp nuôi cấy mô. Quy trình nhân giống được đề xuất bao gồm các bước khử trùng hạt, sử dụng môi trường MS, và chất kích thích sinh trưởng BA. Nghiên cứu cũng khuyến nghị sử dụng hỗn hợp than hoạt tính và xơ dừa làm giá thể cho cây con. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa lớn trong việc bảo tồn và phát triển loài lan quý hiếm này.

4.1. Kết luận

Nghiên cứu đã xây dựng thành công quy trình nhân giống lan Thạch hộc bằng phương pháp nuôi cấy mô. Các yếu tố như môi trường nuôi cấy, chất kích thích sinh trưởng, và giá thể đã được tối ưu hóa, mang lại hiệu quả cao trong quá trình nhân giống.

4.2. Kiến nghị

Nghiên cứu khuyến nghị áp dụng quy trình nhân giống này vào thực tiễn sản xuất, đồng thời tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của lan Thạch hộc trong điều kiện nuôi trồng khác nhau.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Lan Thạch hộc (Dendrobium nobile Lindl.) là một loài phong lan quý thuộc chi Dendrobium, phân bố tự nhiên chủ yếu tại các vùng trung du và miền núi phía Bắc Việt Nam. Về mặt dược học, loài cây này chứa các hợp chất alkaloid (chủ yếu là dendrobin chiếm khoảng 0,3% và nobilin), chất nhầy cùng các hợp chất nhóm bibenzyl có hoạt tính chống oxy hóa, kháng khối u, bảo vệ gan mật, hỗ trợ điều trị đái tháo đường và tăng cường hệ miễn dịch. Về mặt kinh tế và cảnh quan, lan Thạch hộc có giá trị thẩm mỹ cao nhờ hoa to, màu hồng tím đặc trưng và hương thơm bền.

Do giá trị kinh tế và dược liệu lớn, lan Thạch hộc bị khai thác quá mức trong tự nhiên dẫn đến nguy cơ cạn kiệt, được đưa vào Sách đỏ Việt Nam (năm 2007) ở mức độ đe dọa tuyệt chủng. Trong tự nhiên, hạt lan Thạch hộc có kích thước rất nhỏ, phôi chưa phân hóa và hoàn toàn không có nội nhũ chứa chất dinh dưỡng; sự nảy mầm bắt buộc phải dựa vào sự cộng sinh với nấm chuyên biệt, khiến tỷ lệ tái sinh tự nhiên rất thấp (khoảng 1/1.000 hạt). Phương pháp nhân giống sinh dưỡng truyền thống (chiết cành, tách bụi) có hệ số nhân thấp, tốn nhiều thời gian và không đáp ứng được nhu cầu bảo tồn cũng như sản xuất quy mô lớn.

Khóa luận tốt nghiệp "Nghiên cứu nhân giống lan Thạch hộc (Dendrobium nobile Lindl) từ hạt bằng phương pháp nuôi cấy mô tại trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên" được thực hiện bởi sinh viên Đỗ Thị Hào (ngành Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm – Đại học Thái Nguyên) nhằm giải quyết các yêu cầu thực tiễn trên.

Mục tiêu nghiên cứu: Tái sinh và nhân giống lan Thạch hộc (Dendrobium nobile Lindl.) bằng phương pháp in vitro nhằm xây dựng quy trình kỹ thuật hoàn chỉnh phục vụ bảo tồn nguồn gen và sản xuất cây giống.

Yêu cầu và nhiệm vụ nghiên cứu:

1. Xác định hiệu quả khử trùng của dung dịch Natri hypoclorit (NaOCl) ở các nồng độ và mốc thời gian khác nhau đến khả năng tạo nguồn vật liệu sạch nấm và vi khuẩn đưa vào nuôi cấy.
2. Xác định ảnh hưởng của các môi trường dinh dưỡng khoáng cơ bản (MS, 1/2MS, 2/3MS, B5, WPM) đến tỷ lệ nảy mầm của hạt lan Thạch hộc.
3. Xác định ảnh hưởng của nồng độ một số chất kích thích sinh trưởng nhóm cytokinin (BA, Kinetine, TDZ) và các hợp chất hữu cơ bổ sung (khoai tây, cà rốt, nước dừa) đến khả năng nhân nhanh cụm chồi (protocorm) in vitro.
4. Xác định ảnh hưởng của nồng độ $\alpha$-Naphthaleneacetic acid (NAA) và than hoạt tính đến khả năng kích thích ra rễ của chồi lan Thạch hộc.
5. Xác định loại giá thể thích hợp cho sự sinh trưởng và tỷ lệ sống của cây lan Thạch hộc con ở giai đoạn vườn ươm.

Đối tượng, vật liệu và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Giống hoa lan Thạch hộc (Dendrobium nobile Lindl.) khỏe mạnh, sạch bệnh.
• Vật liệu nghiên cứu: Quả lan Thạch hộc 6 tháng tuổi thu thập tại Thái Nguyên.
• Địa điểm nghiên cứu: Phòng nuôi cấy mô tế bào thực vật, Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.
• Thời gian thực hiện: Từ tháng 08/2014 đến tháng 05/2015.
• Điều kiện phòng nuôi cấy: Nhiệt độ phòng duy trì từ 22 – 25°C, cường độ chiếu sáng 2000 – 2500 lux, độ ẩm không khí 60 – 65%, quang chu kỳ 16 giờ chiếu sáng / 8 giờ tối.

---

Cơ sở khoa học và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết và kiến thức nền tảng

Khóa luận vận dụng nguyên lý toàn năng của tế bào thực vật (totipotency) và kỹ thuật gieo hạt không cộng sinh (asymbiotic seed germination) do Lewis Knudson phát triển năm 1922. Kỹ thuật này cung cấp nguồn đường và khoáng nhân tạo thay thế vai trò cung cấp dinh dưỡng của nấm cộng sinh, kích thích phôi hạt phát triển thành thể giống chồi (protocorm-like bodies hay protocorm) và tái sinh cây hoàn chỉnh.

Các môi trường khoáng cơ bản và chất điều hòa sinh trưởng được khảo sát gồm:

• Môi trường khoáng Murashige & Skoog (MS, 1962), Gamborg (B5, 1968), Lloyd & McCown (Woody Plant Medium - WPM, 1980).
• Nhóm chất kích thích sinh trưởng Cytokinin: 6-Benzylaminopurine (BA/BAP), 6-Furfurylaminopurine (Kinetine), Thidiazuron (TDZ) nhằm kích thích phân chia tế bào và phát sinh chồi.
• Nhóm Auxin: $\alpha$-Naphthaleneacetic acid (NAA) kết hợp với than hoạt tính (THT) nhằm kích thích hình thành rễ bất định và hấp phụ độc chất.
• Hợp chất hữu cơ tự nhiên: Dịch chiết khoai tây, dịch chiết cà rốt, nước dừa tự nhiên nhằm bổ sung vitamin, acid amin và các yếu tố vi lượng tự nhiên.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Tất cả các thí nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên hoàn toàn (CRD) với 3 lần nhắc lại.

• Thí nghiệm vô trùng quả: Quả lan 6 tháng tuổi được rửa bằng xà phòng, lau bằng cồn 70°, sau đó ngâm khử trùng bằng NaOCl ở các nồng độ 1%, 2%, 3% trong các mốc thời gian 5, 10, 15, 20 phút (bổ sung 1–2 giọt Tween-20). Đánh giá sau 1 tuần.
• Thí nghiệm nảy mầm hạt: Hạt trong quả vô trùng được gieo trên 5 loại môi trường (MS, 1/2MS, 2/3MS, B5, WPM) bổ sung 20 g/l saccharose, 8 g/l agar. Đánh giá sau 12 tuần.
• Thí nghiệm nhân nhanh cụm chồi: Cấy chuyển cụm chồi 12 tuần tuổi (chiều cao 5 mm, 5 cụm/bình) lên môi trường MS bổ sung đơn chất BA, Kinetine, TDZ (0,5; 1,0; 1,5 mg/l) hoặc hợp chất hữu cơ (khoai tây 20, 50, 70 g/l; cà rốt 20, 50, 70 g/l; nước dừa 50, 100, 150 ml/l). Đánh giá sau 4 tuần.
• Thí nghiệm tạo rễ in vitro: Chồi đạt chuẩn được cấy lên môi trường MS bổ sung NAA (0,3; 0,5; 1,0 mg/l) hoặc than hoạt tính (0,5; 1,0 g/l). Đánh giá sau 4 tuần.
• Thí nghiệm vườn ươm: Cây con hoàn chỉnh được huấn luyện ra ngôi trên 4 loại giá thể (Dớn, Than củi, Mùn cưa, Xơ dừa) với dung lượng 30 cây/công thức/lần nhắc lại. Đánh giá sau 4 tuần.

Nguồn dữ liệu và phương pháp xử lý số liệu

Dữ liệu thu thập từ các chỉ tiêu đo đếm thực tế (tỷ lệ mẫu sạch, tỷ lệ nảy mầm, hệ số nhân chồi, số lượng rễ, chiều dài rễ, tỷ lệ sống vườn ươm). Số liệu được xử lý sơ bộ bằng phần mềm Microsoft Excel 2010 và phân tích phương sai, tính sai số trung bình nhỏ nhất có ý nghĩa ($LSD_{0.05}$) cùng hệ số biến động ($CV%$) bằng phần mềm chuyên dụng IRRISTAT 5.0.

---

Nội dung chính theo từng phần của khóa luận

Phần 1: Mở đầu

Tác giả trình bày tổng quan về tiềm năng kinh tế và giá trị y học của chi Dendrobium, sự suy giảm nghiêm trọng của loài lan Thạch hộc tại các tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam do tình trạng khai thác tự nhiên bừa bãi. Phần này xác định rõ mục tiêu tái sinh loài lan này qua nuôi cấy mô tế bào, đề xuất 5 nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể từ khâu tạo mẫu sạch, gieo hạt, nhân cụm chồi, kích thích ra rễ đến thuần hóa cây con ngoài vườn ươm.

Phần 2: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng hợp các tài liệu khoa học trong nước và quốc tế về:

• Hệ thống phân loại học của họ Orchidaceae và chi Dendrobium, đặc điểm hình thái, cơ quan sinh dưỡng (giả hành, rễ khí sinh bán gió) và cơ quan sinh sản của hoa lan.
• Cơ chế sinh sản và nảy mầm hữu tính của lan Thạch hộc; lịch sử nghiên cứu nuôi cấy mô hoa lan trên thế giới (Morel 1960, Sagawa 1966, Arditti 1974...).
• Giá trị dược liệu học của lan Thạch hộc: hàm lượng dendrobin (khoảng 0,05% – 0,3%), hợp chất bibenzyl; các nghiên cứu dược lý của Đỗ Tất Lợi và các công trình y học về khả năng chống mệt mỏi, kháng ung thư buồng trứng, ung thư phổi, giảm đường huyết, hạ lipid máu và điều trị các chứng tân dịch suy giảm.
• Tình hình nhân giống in vitro các loài Dendrobium tại Việt Nam: các công bố của Mai Thị Tâm (1999), Nguyễn Quang Thạch (2003), Nguyễn Thị Tâm (2007), Nguyễn Văn Song (2011), Nguyễn Thị Sơn (2012, 2014), Vũ Ngọc Lan (2013).

Phần 3: Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết danh mục trang thiết bị (Box cấy Airtech Hàn Quốc, Cân Olhaus Mỹ, Nồi hấp tiệt trùng ALP Nhật Bản, Tủ sấy Memmert Đức, Máy đo pH Hanna HI2210 Đức), quy trình xử lý hóa chất, cách thức bố trí thí nghiệm ngẫu nhiên, hệ thống công thức cụ thể cho từng nội dung và định nghĩa các chỉ tiêu theo dõi cùng công thức tính toán toán học.

Phần 4: Kết quả và thảo luận

Nội dung này trình bày các phát hiện thực nghiệm qua 5 nội dung nghiên cứu chính:

1. Hiệu quả khử trùng mẫu quả lan Thạch hộc

Dung dịch NaOCl thể hiện hiệu quả khử trùng cao đối với quả lan 6 tháng tuổi. Công thức đối chứng không qua khử trùng bị nhiễm 100%. Khi tăng nồng độ NaOCl và kéo dài thời gian khử trùng, tỷ lệ mẫu sống không nhiễm biến thiên rõ rệt:

Công thức	Hóa chất & Nồng độ	Thời gian (phút)	Tỷ lệ bình mẫu sống (%)	Tỷ lệ bình mẫu nhiễm (%)	Tỷ lệ bình mẫu chết (%)
CT1 (Đ/C)	$H_2O$	0	0,00	100,00	0,00
CT2	NaOCl 1%	10	56,67	43,33	0,00
CT3	NaOCl 1%	15	86,67	13,33	0,00
CT4	NaOCl 1%	20	73,33	20,00	6,67
CT5	NaOCl 2%	10	63,33	36,67	0,00
CT6	NaOCl 2%	15	76,67	20,00	3,33
CT7	NaOCl 2%	20	80,00	10,00	10,00
CT8	NaOCl 3%	10	76,67	6,67	16,66
CT9	NaOCl 3%	15	73,33	0,00	23,33
CT10	NaOCl 3%	20	70,00	0,00	30,00

Chỉ số thống kê: $LSD_{0.05} = 10,43$; $CV% = 8,30$.

Khử trùng bằng NaOCl 1% trong 15 phút (CT3) đạt hiệu quả tối ưu với tỷ lệ mẫu sạch sống đạt 86,67% và không ghi nhận mẫu chết. Ở nồng độ 3% ngâm trong 20 phút, mô hạt bị tổn thương làm tỷ lệ chết lên đến 30,00%.

2. Ảnh hưởng của môi trường khoáng đến tỷ lệ nảy mầm hạt

Sau khi gieo, hạt chuyển từ màu vàng nhạt sang màu xanh sau 5 tuần nuôi cấy. Kết quả theo dõi sau 12 tuần cho thấy môi trường MS cho kết quả vượt trội:

Công thức	Môi trường khoáng	Số bình nảy mầm/Tổng số	Tỷ lệ nảy mầm (%)	Thời gian nảy mầm (tuần)	Chất lượng chồi
CT1 (Đ/C)	MS	30/30	100,00	8,67	+++ (Tốt)
CT2	1/2MS	30/30	100,00	10,33	+++ (Tốt)
CT3	2/3MS	24/30	80,00	11,00	+++ (Tốt)
CT4	B5	21/30	70,00	10,67	+++ (Tốt)
CT5	WPM	19/30	63,33	11,33	++ (Trung bình)

Chỉ số thống kê: $LSD_{0.05} = 12,42$ (tỷ lệ nảy mầm), $LSD_{0.05} = 1,24$ (thời gian nảy mầm); $CV% = 8,30$ và $6,60$.

Môi trường MS kích thích hạt nảy mầm đồng đều 100% với thời gian ngắn nhất (8,67 tuần), chồi mập xanh khỏe. Môi trường WPM cho tỷ lệ thấp nhất (63,33%) và thời gian kéo dài nhất (11,33 tuần).

3. Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng và phụ gia hữu cơ đến nhân nhanh cụm chồi

Sau 4 tuần nuôi cấy, ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng và phụ gia hữu cơ được tổng hợp như sau:

Nhóm thí nghiệm	Công thức / Bổ sung	Nồng độ / Hàm lượng	Tổng chồi phát sinh (từ 75 mẫu)	Hệ số nhân (lần)	Chất lượng chồi
Đối chứng	MS nền	0,0	218	2,90	Trung bình
Cytokinin	MS + BA	0,5 mg/l	413	5,50	Tốt
	MS + BA (Tối ưu)	1,0 mg/l	460	6,13	Tốt
	MS + BA	1,5 mg/l	445	5,93	Tốt
	MS + Kinetine	0,5 mg/l	315	4,20	Tốt
	MS + Kinetine	1,0 mg/l	420	5,60	Tốt
	MS + Kinetine	1,5 mg/l	383	5,10	Tốt
	MS + TDZ	0,5 mg/l	245	3,27	Trung bình
	MS + TDZ	1,0 mg/l	287	3,83	Trung bình
	MS + TDZ	1,5 mg/l	392	5,23	Tốt
Hợp chất hữu cơ	MS + Khoai tây	20 g/l	240	3,20	Tốt
	MS + Khoai tây (Tối ưu)	50 g/l	410	5,47	Tốt
	MS + Khoai tây	70 g/l	315	4,20	Tốt
	MS + Cà rốt	20 g/l	260	3,47	Trung bình
	MS + Cà rốt	50 g/l	355	4,73	Tốt
	MS + Cà rốt	70 g/l	275	3,67	Tốt
	MS + Nước dừa	50 ml/l	270	3,60	Tốt
	MS + Nước dừa	100 ml/l	290	3,87	Trung bình
	MS + Nước dừa	150 ml/l	345	4,60	Tốt

• Về nhóm Cytokinin: BA cho hiệu quả cao nhất ở nồng độ 1,0 mg/l với hệ số nhân đạt 6,13 lần, chồi mập xanh đậm ($LSD_{0.05} = 0,38$). TDZ ở nồng độ thấp (0,5 – 1,0 mg/l) cho chồi nhỏ, hơi vàng nhạt và hệ số nhân thấp.
• Về nhóm Hợp chất hữu cơ: Bổ sung khoai tây 50 g/l cho hệ số nhân cao nhất đạt 5,47 lần ($LSD_{0.05} = 0,35$), vượt trội hơn cà rốt 50 g/l (4,73 lần) và nước dừa 150 ml/l (4,60 lần).

4. Kích thích ra rễ tạo cây hoàn chỉnh in vitro

Đánh giá sau 4 tuần nuôi cấy chồi trên môi trường tạo rễ:

Công thức	Hóa chất bổ sung	Nồng độ	Số rễ/cây (rễ)	Chiều dài rễ (cm)	Đánh giá chất lượng rễ
CT1 (Đ/C)	Không bổ sung	0	2,10	2,20	+++ (Tốt)
CT2	NAA	0,3 mg/l	2,47	2,43	+++ (Tốt)
CT3	NAA	0,5 mg/l	4,10	4,13	+++ (Tốt)
CT4	NAA	1,0 mg/l	3,03	1,87	+++ (Tốt)
CT5	Than hoạt tính	0,5 g/l	4,60	2,03	+++ (To, khỏe, nhiều lông hút)
CT6	Than hoạt tính	1,0 g/l	2,40	3,13	+++ (Tốt)

Chỉ số thống kê: $LSD_{0.05} = 0,31$ (số rễ), $LSD_{0.05} = 0,24$ (chiều dài rễ); $CV% = 5,7%$ và $5,1%$.

Than hoạt tính ở nồng độ 0,5 g/l (CT5) đem lại số rễ trung bình cao nhất đạt 4,60 rễ/cây, hệ thống lông hút phát triển dày đặc. Trong khi đó, NAA 0,5 mg/l kích thích kéo dài rễ tốt nhất (4,13 cm).

5. Sinh trưởng của cây con ở giai đoạn vườn ươm

Sau 4 tuần thuần hóa ngoài vườn ươm:

Công thức	Loại giá thể	Số cây sống / Tổng số	Tỷ lệ sống (%)	Tỷ lệ cây chết (%)	Đánh giá chất lượng cây con
CT1 (Đ/C)	Dớn	90/90	100,00	0,00	+++ (Cây khỏe, lá xanh đậm)
CT2	Xơ dừa	77/90	85,56	14,44	+++ (Cây khỏe, lá xanh đậm)
CT3	Mùn cưa	80/90	88,89	11,11	+++ (Cây khỏe, lá xanh đậm)
CT4	Than củi	83/90	92,22	7,78	+++ (Cây khỏe, lá xanh đậm)

Chỉ số thống kê: $LSD_{0.05} = 7,01$; $CV% = 4,10$.

Giá thể Dớn cho tỷ lệ sống tuyệt đối (100%), cây thích nghi nhanh, bộ lá xanh đậm và rễ bám chắc. Giá thể than củi đạt tỷ lệ sống 92,22%, trong khi xơ dừa đạt 85,56%.

Phần 5: Kết luận và kiến nghị

Tổng kết toàn bộ các thông số kỹ thuật tối ưu nhất thu được từ 5 nội dung thực nghiệm và kiến nghị tiếp tục theo dõi các chỉ tiêu sinh trưởng dài hạn của cây lan Thạch hộc ngoài vườn ươm.

---

Kết quả và đóng góp

Bảng tổng hợp quy trình nhân giống tối ưu

Giai đoạn kỹ thuật	Điều kiện / Môi trường tối ưu xác định từ nghiên cứu	Kết quả cụ thể đạt được
1. Khử trùng vật liệu	Quả 6 tháng tuổi; dung dịch NaOCl 1% trong thời gian 15 phút	Tỷ lệ mẫu sạch sống 86,67%; tỷ lệ chết 0,00%
2. Nảy mầm hạt	Môi trường MS cơ bản + 20 g/l saccharose + 8 g/l agar	Tỷ lệ nảy mầm 100% sau 8,67 tuần nuôi cấy
3. Nhân nhanh cụm chồi	MS + BA 1,0 mg/l (hoặc MS + Khoai tây 50 g/l)	Hệ số nhân 6,13 lần (khoai tây đạt 5,47 lần) sau 4 tuần
4. Tạo rễ hoàn chỉnh	Môi trường MS + Than hoạt tính 0,5 g/l	4,60 rễ/cây; chiều dài 2,03 cm; rễ mập, nhiều lông hút
5. Thuần hóa vườn ươm	Trồng trên giá thể Dớn ẩm	Tỷ lệ sống đạt 100% sau 4 tuần theo dõi

Đóng góp khoa học và thực tiễn của đề tài

• Đóng góp khoa học: Khóa luận đã cung cấp hệ thống dẫn liệu thực nghiệm chính xác về phản ứng sinh học của hạt và mô chồi loài Dendrobium nobile Lindl. bản địa Thái Nguyên đối với các nồng độ chất kích thích sinh trưởng (BA, Kinetine, TDZ, NAA) và nguồn phụ gia hữu cơ tự nhiên; làm sáng tỏ vai trò vượt trội của than hoạt tính (0,5 g/l) trong việc kích thích tạo rễ so với việc chỉ sử dụng auxin đơn thuần.
• Đóng góp thực tiễn: Đề xuất một quy trình nhân giống in vitro hoàn chỉnh, có tính lặp lại cao và chi phí thấp (sử dụng NaOCl nồng độ thấp 1%, tận dụng khoai tây tự nhiên 50 g/l thay thế chất điều hòa đắt tiền, sử dụng than hoạt tính và giá thể dớn). Quy trình này tạo cơ sở kỹ thuật sản xuất số lượng lớn cây giống lan Thạch hộc đồng đều, phục vụ công tác bảo tồn nguồn gen quý và cung cấp dược liệu thương mại.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế của nghiên cứu: Do giới hạn về mặt thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp (thực hiện từ tháng 08/2014 đến tháng 05/2015), tác giả chưa tiến hành theo dõi dài hạn các chỉ tiêu sinh trưởng định lượng của cây lan con ngoài vườn ươm sau 4 tuần (như tốc độ tăng chiều cao thân, số lượng lá mới hình thành, khả năng chống chịu sâu bệnh và thời gian đến khi ra hoa).
• Hướng mở rộng nghiên cứu:
  • Tiếp tục theo dõi quá trình sinh trưởng của cây lan Thạch hộc ở các giai đoạn vườn ươm từ 6 – 12 tháng tuổi trên các loại giá thể phối trộn khác nhau.
  • Khảo nghiệm định lượng hàm lượng hoạt chất alkaloid (dendrobin) tích lũy trong thân cây lan nhân giống bằng phương pháp in vitro khi trồng ngoài tự nhiên so với cây mọc hoang dại.

---

Giá trị tham khảo

• Đối tượng thụ hưởng:
  • Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh thuộc các chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Nông học, Dược liệu học, Bảo tồn thực vật.
  • Kỹ thuật viên tại các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật (tissue culture lab).
  • Các nhà vườn, cơ sở sản xuất và ươm tạo giống hoa phong lan thương phẩm.
• Các nội dung có giá trị tham khảo cao:
  • Quy trình khử trùng quả tươi bằng NaOCl 1% đạt tỷ lệ sống sạch 86,67% giúp hạn chế hiện tượng cháy phôi hạt lan.
  • Dữ liệu so sánh trực tiếp hiệu quả nhân chồi giữa 3 nhóm Cytokinin (BA, Kinetine, TDZ) và 3 loại hợp chất hữu cơ (khoai tây, cà rốt, nước dừa).
  • Phương pháp sử dụng than hoạt tính 0,5 g/l để kích thích rễ to khỏe, tạo tiền đề thuận lợi cho cây con khi ra ngôi ngoài vườn ươm.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao đề tài lại lựa chọn khử trùng bằng quả lan 6 tháng tuổi thay vì gieo hạt từ quả đã chín nứt vỏ?

Hạt phong lan có kích thước hiển vi và không có lớp nội nhũ bảo vệ. Nếu quả đã chín và nứt vỏ trong tự nhiên, bào tử nấm và vi khuẩn sẽ xâm nhập trực tiếp vào bên trong, việc khử trùng hạt rời bằng hóa chất mạnh sẽ làm cháy phôi và làm chết hạt hoàn toàn. Việc sử dụng quả lan 6 tháng tuổi (vỏ còn nguyên vẹn) cho phép dùng hóa chất NaOCl khử trùng bề mặt ngoài mà không làm tổn thương phôi hạt bên trong, sau đó tách vỏ trong tủ cấy vô trùng để gieo hạt sạch bệnh.

2. Nồng độ và thời gian xử lý NaOCl nào cho hiệu quả khử trùng quả lan Thạch hộc tối ưu nhất?

Nồng độ NaOCl 1% ngâm trong 15 phút (công thức 3) cho hiệu quả tối ưu nhất với tỷ lệ bình mẫu sống không nhiễm đạt 86,67%, tỷ lệ nhiễm là 13,33% và không có mẫu chết (0,00%). Nếu tăng nồng độ lên 3% ngâm trong 20 phút, tỷ lệ mẫu chết do ngộ độc hóa chất lên đến 30,00%.

3. Trong số các chất kích thích sinh trưởng khảo sát, loại nào giúp nhân cụm chồi đạt hệ số cao nhất?

Chất kích thích sinh trưởng BA ở nồng độ 1,0 mg/l (bổ sung trên môi trường nền MS) cho hệ số nhân cụm chồi cao nhất đạt 6,13 lần sau 4 tuần nuôi cấy, chồi mập và xanh đậm. Hiệu quả này cao hơn so với Kinetine 1,0 mg/l (hệ số nhân 5,60 lần) và TDZ 1,5 mg/l (hệ số nhân 5,23 lần).

4. Việc bổ sung than hoạt tính vào môi trường tạo rễ in vitro mang lại kết quả như thế nào so với bổ sung NAA?

Bổ sung than hoạt tính 0,5 g/l cho số lượng rễ trung bình cao nhất đạt 4,60 rễ/cây (chiều dài rễ 2,03 cm), rễ to, khỏe và phát triển nhiều lông hút. Trong khi đó, bổ sung NAA 0,5 mg/l kích thích kéo dài rễ tốt hơn (đạt 4,13 cm) nhưng số lượng rễ chỉ đạt 4,10 rễ/cây.

5. Loại giá thể nào cho tỷ lệ sống của cây lan Thạch hộc cao nhất khi đưa ra giai đoạn vườn ươm?

Giá thể Dớn cho tỷ lệ sống cao nhất đạt 100% sau 4 tuần theo dõi, toàn bộ cây sinh trưởng khỏe mạnh và lá có màu xanh đậm. Đứng thứ hai là giá thể Than củi (tỷ lệ sống 92,22%), tiếp theo là Mùn cưa (88,89%) và Xơ dừa (85,56%).

---

Kết luận

Khóa luận của tác giả Đỗ Thị Hào đã xây dựng thành công quy trình nhân giống in vitro hoàn chỉnh cho loài lan dược liệu quý Dendrobium nobile Lindl. từ nguồn vật liệu hạt quả 6 tháng tuổi tại Thái Nguyên. Nghiên cứu đã xác định được các mốc thông số kỹ thuật tối ưu bao gồm: khử trùng bằng NaOCl 1% trong 15 phút, nảy mầm hạt trên môi trường MS (đạt 100% sau 8,67 tuần), nhân nhanh chồi trên môi trường MS bổ sung BA 1,0 mg/l hoặc khoai tây 50 g/l, kích thích ra rễ với than hoạt tính 0,5 g/l và thuần hóa cây con đạt tỷ lệ sống 100% trên giá thể Dớn. Kết quả này cung cấp cơ sở dữ liệu thực nghiệm tin cậy cho công tác bảo tồn nguồn gen thực vật nguy cấp và mở ra khả năng sản xuất sinh khối giống thương mại phục vụ ngành dược liệu.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Nước ta có trữ lượng lan rừng rất lớn và nhiều loài có giá trị như: Vanda, Phaphiopedilum, Cymbidium và Dendrobium. Dendrobium là một trong những giống hoa lan phong phú, đa dạng với hơn 1500 loài. Dendrobium khá phong phú về màu sắc và hương thơm của hoa. Ngoài ra loài hoa này còn có giá trị dược liệu.

Lan Thạch hộc thuộc chi Dendrobium. Đây là đối tượng cây quý hiếm. Đặc điểm của giống là sai hoa, hoa to, đẹp, hương thơm nên rất được ưa chuộng. Theo Đặng Văn Đông (2004) [4] hiện nay giá của một cây hoa lan có thể từ 100.

Lan Thạch hộc (Dendrobium nobile Lindt) phân bố ở vùng trung du miền núi phía bắc Việt Nam. Qua kiểm nghiệm lâm sàng cho thấy loài lan này có nhiều giá trị dược học: chống ung thư, lão hóa và tăng sức đề kháng của cơ thể [44], [48]. Điều làm nên giá trị dược liệu của loài lan này chính là hợp chất alkaloid. Với giá trị dược liệu lan Thạch hộc đã bị khai thác tới mức bị tuyệt chủng trong tự nhiên [8], [49].

Hiện nay Lan Thạch hộc nằm trong danh mục Đỏ của cuốn “Sách đỏ Việt Nam” năm 2007 [21]. Số loài lan quý hiếm như Đuôi chồn, Đai Châu, Lan Hài đang bị đe dọa tuyệt chủng trong tự nhiên được bảo tồn nhờ phương thức nảy mầm từ hạt [47]. Chính vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu nhân giống lan Thạch hộc (Dendrobium nobile Lindt) từ hạt bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô tại trƣờng Đại học Nông lâm Thái Nguyên” với mục đích bảo tồn nguồn dược liệu quý đồng thời góp phần phát triển một loài thuốc nam có giá trị. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài 1.

Mục tiêu của đề tài Tái sinh và nhân giống lan Thạch hộc bằng phương pháp in vitro. Yêu cầu của đề tài - Xác định hiệu quả khử trùng của NaClO ở nồng độ và các mốc thời gian đến khả năng tạo vật liệu sạch nấm và vi khuẩn đưa vào nuôi cấy. - Xác định ảnh hưởng môi trường MS, 1/2MS, 2/3MS, B5 và WPM đến tỉ lệ nảy mầm của hạt lan. - Xác định ảnh hưởng nồng độ chất kích thích sinh trưởng và hợp chất hữu cơ đến nhân nhanh cụm chồi lan Thạch hộc.

- Xác định nồng độ NAA và than hoạt tính đến khả năng ra rễ lan Thạch hộc. - Xác định loại giá thể thích hợp đến sinh trưởng và phát triển của cây con ở giai đoạn vườn ươm. Ý nghĩa của đề tài - Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu sẽ xây dựng được một biện pháp kỹ thuật nhân giống Lan Thạch hộc bằng phương pháp in vitro. - Ý nghĩa thực tiễn Đề xuất được quy trình nhân nhanh giống Lan Thạch hộc bằng phương pháp nuôi cấy in vitro, đảm bảo cung cấp số lượng lớn cây giống có chất lượng cao, đồng đều cho sản xuất.

n 3 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Giới thiệu chung về hoa lan 2. Nguồn gốc và phân loại 2.1 Nguồn gốc Các họ lan được đánh giá là loài hoa cao cấp trong vương quốc thảo mộc, bao gồm hơn 25.000 loài khác nhau, cùng với những loài mới được khám phá và mô tả theo từng năm. Do chúng được phân bố vùng rộng lớn, trải dài từ xích đạo đến bắc cực, từ đồng bằng tới các vùng núi băng tuyết, các loài lan rất khác nhau.

Các loài lan chủ yếu sống trên cây cao, sống biểu sinh lâu năm, chúng được gọi chung là phong lan. Các loài mọc trong đất gọi là địa lan và một số loài mọc trên núi đá gọi là thạch lan [8]. Cây lan được biết đến đầu tiên ở Phương Đông khoảng từ 551- 479 trước công nguyên [20]. Ở Việt Nam, những nghiên cứu về lan ở buổi đầu không rõ rệt, người đầu tiên khảo sát hoa lan ở Việt Nam là ông Gioolas Noureiro nhà truyền giáo Bồ Đào Nha đã tả cây lan đầu tiên ở Việt Nam vào năm 1789 trong “Flora Cochinnis” gọi tên các cây lan trong cuộc hành trình tìm đến phía nam Việt Nam: Alrides, Phagius và Sarcopodium.

đã được BenTham và Hooker ghi lại trong cuốn “Genera rum” (1862-1885). Chỉ sau khi người Pháp đến Việt Nam mới có công trình được công bố đáng kể là: F.gnillaumin mô tả 101 chi gồm 70 loài lan cho cả 3 nước Đông Dương trong bộ “Thực vật Đông Chí Dương” [13].2 Phân loại Theo hệ thống thực vật học mới nhất cây hoa lan được phân loại như sau [8]: Giới: Plantae Ngành: Magnoliophyta Lớp: Liliospida Bộ: Asparagales Phân họ: Orchidaceae n 4 Đặc điểm về phân loại: Orchidacae là một họ rất lớn thuộc lớp đơn tử diệp, phân bố khắp nơi trên thế giới. Ở vùng ôn đới, ta gặp nhiều loài sống ở đất như địa lan, một số loài hoại sinh không diệp lục và sống vào chất mùn trong đất. Có loài ở châu Úc có thể sống ngầm dưới đất như nấm [8].

Ở vùng nhiệt đới ta sẽ gặp nhiều loại phụ sinh sống trên cây khác như cattleya, oncidium, laelia tập trung nhiều ở vùng Trung Mỹ, ở Đông Nam Á đặc sắc nhất là Denbrodium và còn có Cypripedium, Phalaenopsis, Cymbidium có nguồn gốc ở Inđônêsia. Cây lan có thể chia thành hai nhóm: Nhóm đơn thân và nhóm đa thân. * Nhóm đơn thân chia làm hai nhóm phụ: - Nhóm phụ lá mọc đối (Sarcanthinae): Nhóm này lá được xếp thành hai hàng mọc đối nhau. Gồm các giống như: Vanda, Aerides, Phalaenopsis.

- Nhóm phụ lá dẹp thẳng hay tròn (Campylocentrinae): Papilionanthe, Luisia. * Nhóm đa thân: Gồm những cây tăng trưởng liên tục. Căn cứ vào cách ra hoa nhóm này chia thành hai nhóm phụ: - Nhóm ra hoa phía trên như: Cymbidium, Dedrobium, Oncidium. - Nhóm ra hoa ở đỉnh: Cattleya, Laelia, Epidendrum.

* Ngoài ra còn có một số giống mang tính chất trung gian như: Centropetatum, Phachyphllum, Dichaea. Theo nhiều nhà nghiên cứu về hoa của trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, với khoảng 897 loài phong lan hiện có và khí hậu thích hợp, nguồn nguyên liệu làm giá thể dồi dào cho cây sinh trưởng, phát triển. Việt Nam có thể trở thành một nước sản xuất hoa phong lan lớn trong khu vực [8]. Đặc điểm sinh học 2.1 Cơ quan dinh dưỡng Giả hành (thân giả): Chỉ xuất hiện ở các loài đa thân.

Bộ phận giả hành cần thiết cho sinh trưởng, phát triển của lan. Giả hành tuy là thân nhưng lại chứa diệp lục, đây là bộ phận dự trữ nhiều chất dinh dưỡng, nước cần thiết cho sự phát triển của giả hành mới [20]. n 5 Thân: Lan có 2 loại thân: Đơn thân và đa thân [20]. + Củ giả rất đa dạng: Hình cầu hoặc hình thuôn dài xếp sát nhau hay rải rác đều hoặc hình trụ xếp chồng chất lên nhau thành một thân giả.

+ Cấu tạo củ giả: Gồm nhiều mô mềm chứa nhiều dịch nhầy, phía ngoài là lớp biểu bì với vách tế bào dày, nhẵn bóng bảo vệ, tránh sự mất nước do ánh sáng mặt trời. Đa số củ giả đều có màu xanh bóng, nên cùng với lá nó làm nhiệm vụ quang hợp. Lá: Đa số các loài phong lan là cây tự dưỡng, nó phát triển đầy đủ hệ thống lá. Hình dạng của lá thay đổi rất nhiều, từ loại lá mọng nước đến loại lá phiến mỏng.

Phiến lá trải rộng hay gấp lại theo các gân vòng cung hay chỉ gấp lại theo gân hình chữ V. Màu sắc lá thường xanh bóng nhưng có trường hợp 2 mặt lá khác nhau: Thường mặt dưới có màu xanh đậm hay tía, mặt trên lại khảm nhiều màu sắc sặc sỡ [20]. Rễ: Phong lan thuộc họ sống phụ sinh, treo lơ lửng trên các cây thân gỗ khác. Các loại thân gỗ nạc dài, ngắn, mập hay mảnh mai đưa cơ thể bò đi xa hay chụm lại thành các bụi dày.

Đặc biệt đối với lan công nghiệp (nuôi cấy mô) người ta thường sử dụng một số giá thể nuôi như: Dớn, than củi, … Rễ làm nhiệm vụ hấp thu chất dinh dưỡng, chúng được bao bởi lớp mô hút dày, ẩm. Bao gồm: Những lớp tế bào chết chứa đầy không khí, do đó nó ánh lên màu xám bạc. Với lớp mô xốp đó rễ có khả năng hấp thu nước mưa chảy dọc dài trên vỏ cây, lấy nước lơ lửng trên không khí [7], [20].2 Cơ quan sinh sản Hoa: Lưỡng tính, rất hiếm các loại phong lan đơn tính, tạp tính và nhị dạng. Hoa đối xứng qua một mặt phẳng, bên ngoài có 6 cánh, trong đó 3 cánh đài ở ngoài cùng, thường có màu sắc và kích thước giống nhau.

Một cánh đài nằm phía trên hay phía sau của hoa gọi là cánh đài lý, 2 cánh dài nằm 2 bên gọi là cánh đài cạnh. Nằm kề bên trong và xen kẽ với 3 cánh đài là 3 cánh hoa. Chúng giống nhau về hình dạng, kích thước, màu sắc. Cánh còn lại nằm ở phía trên hay phía dưới, có hình dạng và màu sắc khác hẳn với các cánh còn lại gọi là cánh môi.

Cánh môi quyết định giá trị thẩm mỹ của hoa lan. Ở giữa hoa có một trụ nổi lên bộ phận sinh dục của cây, giúp cây duy trì nòi giống. Trụ gồm nhị và nhụy, sau khi thụ phấn các cánh hoa héo, cuống hoa hình thành quả lan [7], [8], [20]. n 6 Quả và hạt: Quả lan thuộc loại quả nang, nở ra theo 3-6 đường nứt dọc, quả có dạng cài dài đến hình trụ ngắn phình ở giữa.

Khi chín quả nở ra và mảnh vỏ còn dính lại với nhau ở phía đỉnh và phía gốc. Ở một số loài quả chỉ mở theo 1-2 khía dọc, thậm chí không nứt ra, và hạt chỉ ra khỏi vỏ quả khi vỏ này mục nát [8]. Hạt lan rất nhiều, kích thước nhỏ. Hạt chỉ cấu tạo bởi một phôi chưa phân hoá, trên một mạng lưới nhỏ, xốp, chứa đầy không khí.

Hạt trưởng thành sau 2-18 tháng. Hạt phong lan không có nội nhũ nên nó khó có khả năng phát triển thành cây. Các loài lan rừng chủ yếu nhờ nấm cộng sinh để phát triển thành cây. Các phương pháp nhân giống 2.1 Phương pháp nhân giống hữu tính Cơ chế sinh sản hữu tính của lan Thạch hộc cũng giống như một số loài cây khác, bao gồm: Quá trình hình thành giao tử và thụ tinh khi hạt phấn chín tiếp xúc với núm nhụy nhờ côn trùng hay con người.

Núm nhụy tiết ra các hoocmon sinh trưởng nhờ vậy mà hạt phấn có thể nảy mầm được. Sau đó, hạt phấn này theo trục hợp nhụy xuống bầu noãn để tinh tử kết hợp với tế bào trứng tạo nên hợp tử. Bầu noãn lớn dần lên, cánh hoa và đài hoa héo đi, quả dần dần được lớn từ bầu noãn trương phồng [33].