Nghiên cứu khả năng ức chế hình thành β-amyloid gây bệnh Alzheimer bởi hoa hòe Sophora japonica

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu hus nghiên cứu khả năng ức chế hình thành β amyloid gây bệnh alzheimer bởi một số hoạt chất từ hoa, đánh giá hiện trạng, phân tích vấn đề, đề xuất biện

• Tác giả: Đỗ Thị Hải Anh
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Quang Huy
• Trường học: Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên cứu khả năng ức chế hình thành β-amyloid gây bệnh Alzheimer bởi một số hoạt chất từ hoa hòe (Sophora japonica L.)
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tổng quan về bệnh Alzheimer
• 1.2. Bệnh Alzheimer trên thế giới và Việt Nam
• 1.3. Đặc điểm lâm sàng của bệnh Alzheimer
• 1.4. Chẩn đoán và phòng ngừa bệnh Alzheimer
• 1.5. Mối liên hệ giữa stress oxi hóa và bệnh Alzheimer
• 1.6. Vai trò của β-amyloid trong bệnh Alzheimer
• 1.7. Tổng quan về flavonoids và các nghiên cứu flavonoids từ thực vật
• 1.8. Tổng quan về flavonoids
• 1.9. Giá trị sinh học của flavonoids
• 1.10. Tổng quan về Hoa hòe (Sophora japonica L.)
• 1.10.1. Giới thiệu chung
• 1.10.2. Thành phần hóa học của cây hoa hòe
• 1.10.3. Công dụng của hoa hòe
• 2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Mẫu thực vật
• 2.2. Thiết bị thí nghiệm
• 2.3. Thiết bị tách chiết và xác định hợp chất
• 2.4. Thiết bị đánh giá khả năng bắt gốc tự do và giảm sự tích tụ peptide β-amyloid
• 2.5. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5.1. Phương pháp tách chiết
• 2.5.2. Phương pháp sắc ký bản mỏng
• 2.5.3. Phương pháp sắc ký cột
• 2.5.4. Phương pháp chiết lỏng – lỏng
• 2.5.5. Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân
• 2.5.6. Phương pháp khối phổ
• 2.5.7. Phương pháp chuẩn bị mẫu β-amyloid và các dung dịch chất chuẩn, chất tinh sạch
• 2.5.8. Phương pháp bắt gốc tự do DPPH
• 2.5.9. Phương pháp thực nghiệm huỳnh quang Thioflavin T
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Phân lập và tinh sạch các hợp chất chính có trong dịch chiết
• 3.2. Phân lập các chất bằng phương pháp sắc ký bản mỏng
• 3.3. Tinh sạch các chất bằng phương pháp sắc ký cột
• 3.4. Tinh sạch chất bằng phương pháp sắc ký lỏng-lỏng
• 3.5. Xác định các hợp chất có trong phân đoạn chính
• 3.6. Xác định cấu trúc chất C2
• 3.7. Xác định cấu trúc chất C6
• 3.8. Đánh giá khả năng làm giảm sự tích lũy β-amyloid
• 3.9. Hoạt tính chống oxi hóa
• 3.10. Hoạt tính làm giảm sự tích tụ peptide β-amyloid
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về khả năng ức chế β amyloid từ hoa hòe Sophora japonica

Bệnh Alzheimer là một trong những bệnh thoái hóa thần kinh phổ biến nhất, với sự tích tụ của peptide β-amyloid trong não. Nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng hoa hòe (Sophora japonica) có thể chứa các hoạt chất có khả năng ức chế sự hình thành β-amyloid. Việc tìm hiểu về khả năng này không chỉ giúp nâng cao hiểu biết về cơ chế bệnh lý mà còn mở ra hướng đi mới trong điều trị bệnh Alzheimer.

1.1. Giới thiệu về hoa hòe và thành phần hóa học

Hoa hòe (Sophora japonica) là một loại cây có giá trị y học cao, chứa nhiều flavonoids và các hợp chất sinh học khác. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng các thành phần này có khả năng chống oxi hóa và kháng viêm, góp phần vào việc bảo vệ tế bào thần kinh khỏi tổn thương do β-amyloid.

1.2. Tác động của β amyloid trong bệnh Alzheimer

β-amyloid là một trong những yếu tố chính gây ra bệnh Alzheimer. Sự tích tụ của nó dẫn đến hình thành các mảng amyloid trong não, gây ra tổn thương tế bào thần kinh và suy giảm chức năng nhận thức. Hiểu rõ về cơ chế này là rất quan trọng để phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu khả năng ức chế β amyloid

Mặc dù có nhiều nghiên cứu về khả năng ức chế β-amyloid từ hoa hòe, nhưng vẫn còn nhiều thách thức trong việc xác định hiệu quả và cơ chế hoạt động của các hợp chất này. Các yếu tố như độ tinh khiết của chiết xuất, phương pháp nghiên cứu và điều kiện thí nghiệm có thể ảnh hưởng đến kết quả.

2.1. Những khó khăn trong việc chiết xuất hoạt chất từ hoa hòe

Quá trình chiết xuất và tinh sạch các hợp chất từ hoa hòe thường gặp khó khăn do sự đa dạng về thành phần hóa học. Việc lựa chọn phương pháp chiết xuất phù hợp là rất quan trọng để đảm bảo thu được các hoạt chất có hoạt tính sinh học cao.

2.2. Thách thức trong việc đánh giá hiệu quả ức chế β amyloid

Đánh giá khả năng ức chế β-amyloid cần phải sử dụng các phương pháp thí nghiệm chính xác và đáng tin cậy. Các nghiên cứu in vitro và in vivo cần được thực hiện để xác định hiệu quả thực sự của các hợp chất từ hoa hòe trong việc ngăn chặn sự tích tụ β-amyloid.

III. Phương pháp nghiên cứu khả năng ức chế β amyloid từ hoa hòe

Nghiên cứu khả năng ức chế β-amyloid từ hoa hòe được thực hiện thông qua nhiều phương pháp khác nhau, bao gồm chiết xuất, phân lập và đánh giá hoạt tính sinh học. Các phương pháp này giúp xác định các hợp chất có khả năng ức chế β-amyloid và cơ chế hoạt động của chúng.

3.1. Phương pháp chiết xuất và phân lập hợp chất

Các phương pháp chiết xuất như sắc ký cột và sắc ký bản mỏng được sử dụng để tách chiết các hợp chất từ hoa hòe. Việc phân lập thành công các hợp chất này là bước quan trọng để đánh giá khả năng ức chế β-amyloid.

3.2. Đánh giá hoạt tính ức chế β amyloid

Hoạt tính ức chế β-amyloid được đánh giá thông qua các thí nghiệm in vitro, sử dụng các phương pháp như huỳnh quang Thioflavin T và DPPH. Những kết quả này sẽ cung cấp thông tin quan trọng về khả năng bảo vệ tế bào thần kinh của các hợp chất từ hoa hòe.

IV. Kết quả nghiên cứu khả năng ức chế β amyloid từ hoa hòe

Kết quả nghiên cứu cho thấy một số hợp chất từ hoa hòe có khả năng ức chế sự hình thành β-amyloid một cách hiệu quả. Các hoạt chất này không chỉ giúp giảm sự tích tụ β-amyloid mà còn có tác dụng chống oxi hóa, bảo vệ tế bào thần kinh khỏi tổn thương.

4.1. Kết quả phân lập và xác định cấu trúc hợp chất

Các hợp chất chính được phân lập từ hoa hòe đã được xác định cấu trúc bằng các phương pháp như NMR và khối phổ. Những hợp chất này cho thấy tiềm năng trong việc ức chế β-amyloid và cần được nghiên cứu sâu hơn.

4.2. Tác dụng chống oxi hóa của các hợp chất từ hoa hòe

Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng các hợp chất từ hoa hòe có khả năng chống oxi hóa mạnh mẽ, giúp bảo vệ tế bào thần kinh khỏi tổn thương do stress oxi hóa. Điều này càng làm tăng giá trị của hoa hòe trong điều trị bệnh Alzheimer.

V. Kết luận và triển vọng nghiên cứu trong tương lai

Nghiên cứu khả năng ức chế β-amyloid từ hoa hòe mở ra nhiều triển vọng trong việc phát triển các phương pháp điều trị mới cho bệnh Alzheimer. Việc tiếp tục nghiên cứu và phát triển các hợp chất từ hoa hòe có thể giúp cải thiện chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân mắc bệnh Alzheimer.

5.1. Tương lai của nghiên cứu về hoa hòe trong điều trị Alzheimer

Nghiên cứu về hoa hòe cần được mở rộng để khám phá thêm nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học. Việc phát triển các sản phẩm từ hoa hòe có thể mang lại lợi ích lớn cho việc điều trị bệnh Alzheimer.

5.2. Khuyến nghị cho các nghiên cứu tiếp theo

Các nghiên cứu tiếp theo nên tập trung vào việc xác định cơ chế hoạt động của các hợp chất từ hoa hòe và đánh giá hiệu quả của chúng trong các mô hình động vật. Điều này sẽ giúp cung cấp thông tin quan trọng cho việc phát triển các liệu pháp điều trị hiệu quả hơn.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Bệnh Alzheimer hiện là nguyên nhân hàng đầu gây ra hội chứng sa sút trí tuệ, chiếm tỷ lệ từ 50% đến 70% tổng số ca bệnh trên toàn cầu. Theo báo cáo từ các tổ chức y tế quốc tế, năm 2016 toàn thế giới có khoảng 50 triệu người mắc hội chứng này, dự kiến tăng lên 65,7 triệu người vào năm 2030 và vượt mốc 115,4 triệu đến 150 triệu người vào năm 2050. Tại Việt Nam, các khảo sát dịch tễ ghi nhận tỷ lệ sa sút trí tuệ ở người cao tuổi dao động từ 4,63% tại Ba Vì (Hà Nội) đến 7,8% tại Thành phố Hồ Chí Minh, với tần suất mắc tăng khoảng 1,78 lần sau mỗi khoảng cách 5 tuổi.

Vấn đề cốt lõi trong cơ chế bệnh sinh của Alzheimer là sự tích tụ bất thường của peptide beta-amyloid (đặc biệt là Aβ1-42) tạo thành các mảng lắng đọng ngoại bào gây độc thần kinh, kết hợp với tình trạng stress oxy hóa nghiêm trọng phá hủy màng tế bào não – cơ quan tiêu thụ tới 20% tổng lượng oxy của cơ thể. Các loại thuốc điều trị tổng hợp hiện nay thường đi kèm chi phí tốn kém và nhiều tác dụng phụ, thúc đẩy nhu cầu cấp thiết trong việc tìm kiếm các hợp chất tự nhiên có hoạt tính ức chế Aβ1-42.

Luận văn thạc sĩ chuyên ngành Sinh học thực nghiệm do học viên Đỗ Thị Hải Anh thực hiện tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội phối hợp với Đại học Hiroshima (Nhật Bản) trong năm 2018 tập trung vào hai mục tiêu chính: tách chiết, tinh sạch các hợp chất flavonoid từ nụ hoa hòe khô (Sophora japonica L.) và đánh giá khả năng ức chế sự tích tụ peptide Aβ1-42 in vitro. Kết quả nghiên cứu đạt hiệu suất thu hồi cao khô 12,45%, cung cấp bằng chứng thực nghiệm giá trị về tiềm năng phát triển dược liệu tự nhiên trong phòng ngừa và hỗ trợ điều trị bệnh Alzheimer.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên giả thuyết chuỗi thác amyloid (Amyloid Cascade Hypothesis) và lý thuyết stress oxy hóa trong thoái hóa thần kinh. Quá trình phân giải bất thường protein tiền thân amyloid (APP) bởi hai enzyme beta-secretase và gamma-secretase tạo ra các monomer Aβ40 và Aβ42. Trong đó, peptide Aβ1-42 chứa 42 axit amin có xu hướng tự cuộn gập, kết tụ nhanh chóng thành các sợi xoắn dạng phiến beta (cross-beta fibrils) gây tổn thương synapse và chết tế bào thần kinh.

Hệ thống lý thuyết về hợp chất tự nhiên tập trung vào nhóm flavonoid có cấu trúc khung cơ bản 1,3-diphenylpropan (C6-C3-C6). Các phân tử này sở hữu các nhóm hydroxyl phenolic liên kết trực tiếp trên vòng thơm và hệ thống nối đôi liên hợp, mang lại khả năng nhường hydro để trung hòa các gốc tự do (ROS), đồng thời tạo phức chelate với các ion kim loại chuyển tiếp như sắt, nhôm nhằm ngăn chặn quá trình peroxy hóa lipid màng. Cơ chế ức chế tạo sợi amyloid của flavonoid hoạt động thông qua việc xen phủ vào các vùng kỵ nước của chuỗi peptide, ngăn cản quá trình tạo liên kết hydro giữa các monomer Aβ.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn nguyên liệu sử dụng gồm 20.000 mg nụ hoa hòe khô chuẩn hóa do công ty Tochimoko (Osaka, Nhật Bản) cung cấp và peptide tổng hợp Aβ1-42 từ Sigma-Aldrich. Cỡ mẫu nghiên cứu được thực hiện lặp lại 3 lần độc lập (n = 3) trên từng mẻ chiết xuất để đảm bảo độ tin cậy thống kê. Phương pháp chọn mẫu nguyên liệu là ngẫu nhiên phân tầng từ các lô dược liệu đạt tiêu chuẩn chất lượng.

Quy trình phân tích và tinh sạch được lựa chọn dựa trên cơ sở khoa học chặt chẽ:

• Chiết xuất phân đoạn: Sử dụng dung môi methanol với tỷ lệ mẫu/dung môi 1:10 (khối lượng/thể tích) ngâm chiết trong 24 giờ, tiếp nối bằng cô quay chân không ở nhiệt độ 70 độ C và tốc độ 400 vòng/phút. Methanol được chọn do có độ phân cực tối ưu giúp hòa tan tối đa nhóm polyphenol mà không kéo theo nhiều tạp chất cao phân tử.
• Phân lập sắc ký: Kết hợp sắc ký bản mỏng (TLC) trên silica gel với hệ pha động ethyl acetate/ethanol/axit acetic 25 mM (tỷ lệ 4:1:1) và sắc ký cột cổ điển (kích thước cột 60 cm x 3 cm chứa 30 g silica gel) với 6 hệ dung môi rửa giải phân cực tăng dần. Phương pháp chiết lỏng - lỏng với n-hexane và ethyl acetate được áp dụng để kết tinh phân đoạn tinh khiết.
• Xác định cấu trúc: Đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR (tần số 499 MHz) và 13C-NMR (tần số 125,7 MHz) trên hệ thống JEOL Lambda 500, kết hợp khối phổ phân giải cao ESI-MS/MS trên thiết bị LTQ-Orbitrap XL với dải quét m/z từ 150 đến 2000, điện áp mao dẫn 4,5 kV.
• Đánh giá hoạt tính sinh học: Thử nghiệm quét gốc tự do DPPH đo quang phổ kế tại bước sóng 517 nm (sử dụng đường chuẩn Vitamin C dải nồng độ 100 đến 700 µg/ml) và thử nghiệm huỳnh quang Thioflavin T (ThT) với bước sóng kích thích 390 nm, bước sóng phát xạ 535 nm trên dải nồng độ 10 µM đến 1 mM trong thời gian thực nghiệm năm 2018.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Nghiên cứu đã ghi nhận 4 phát hiện quan trọng thông qua chuỗi thực nghiệm:

• Hiệu suất chiết tách cao: Từ 20.000 mg nụ hoa hòe khô ban đầu, khối lượng cao khô thu được đạt trung bình 2489 mg, tương ứng tỷ lệ thu hồi đạt 12,45% khối lượng mẫu.
• Phân lập thành công hai hợp chất flavonoid chủ đạo: Bằng sắc ký cột và chiết lỏng - lỏng, tác giả đã tinh sạch được hợp chất C2 với khối lượng 40 mg (chiếm 0,20% khối lượng dược liệu) và hợp chất C6 với khối lượng 260 mg (chiếm 1,30% khối lượng dược liệu). Khối lượng chất C6 thu được cao gấp 6,5 lần so với chất C2.
• Nhận dạng chính xác cấu trúc hóa học: Dựa trên dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR và phổ khối lượng ESI-MS, hợp chất C2 (Rf = 0,89) được xác định chính xác là Quercetin, và hợp chất C6 (Rf = 0,50) là Rutin (quercetin-3-O-rutinoside). Các tín hiệu proton nhân thơm ở mức 6,6 - 6,8 ppm hoàn toàn trùng khớp với chất chuẩn quốc tế.
• Khả năng ức chế tạo sợi Aβ1-42 và chống oxy hóa vượt trội: Thử nghiệm huỳnh quang Thioflavin T chứng minh cả hai hoạt chất C2 và C6 ở nồng độ từ 10 µM đến 100 µM đều làm suy giảm mạnh cường độ phát xạ huỳnh quang so với mẫu đối chứng âm, thể hiện tỷ lệ ức chế hình thành mảng sợi Aβ1-42 đạt trên 60%. Cùng với đó, hoạt tính quét gốc tự do DPPH của hai chất này tương đương với đường chuẩn acid ascorbic ở cùng dải nồng độ.

Thảo luận kết quả

Khả năng làm giảm sự kết tụ peptide Aβ1-42 của Quercetin và Rutin được giải thích bởi sự hiện diện của nhóm catechol (3',4'-dihydroxy) trên vòng B và nhóm 3-hydroxy trên vòng C của khung flavone. Các nhóm chức này tạo liên kết cộng hóa trị hoặc liên kết hydro chặt chẽ với các gốc amino acid sơ nước (như phenylalanine và leucine) trong cấu trúc lõi của Aβ1-42, từ đó phá vỡ cấu trúc phiến gấp beta và ngăn cản quá trình chuyển đổi từ dạng monomer sang dạng oligomer gây độc.

Kết quả này hoàn toàn tương thích với các công bố quốc tế về hoạt tính bảo vệ thần kinh của polyphenol, trong đó chỉ ra rằng Rutin nhờ có thêm gốc disaccharide rutinose giúp tăng độ tan sinh học, còn Quercetin aglycone lại có khả năng tương tác kỵ nước mạnh hơn.

Trong thực tiễn trình bày dữ liệu, các kết quả trên được trực quan hóa thông qua:

• Bảng so sánh dịch chuyển hóa học (chemical shift ppm) giữa mẫu phân lập và chất chuẩn trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân.
• Biểu đồ cột biểu diễn phần trăm ức chế tích tụ peptide Aβ theo nồng độ (10 µM, 100 µM, 1000 µM), phản ánh mối tương quan tuyến tính giữa liều lượng và hiệu lực sinh học.
• Đồ thị đường chuẩn hồi quy tuyến tính của chất đối chứng Vitamin C với hệ số tương quan R2 đạt xấp xỉ 0,99, làm thước đo chuẩn xác định hoạt lực chống oxy hóa.

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm chuyển giao và nâng cao giá trị ứng dụng của các hoạt chất từ hoa hòe, luận văn đề xuất 4 giải pháp cụ thể:

• Chuẩn hóa quy trình chiết tách xanh quy mô bán công nghiệp: Thay thế methanol độc hại bằng dung môi ethanol thực phẩm kết hợp công nghệ chiết siêu âm hoặc vi sóng, hướng tới mục tiêu nâng hiệu suất thu hồi Rutin lên trên 1,5% và Quercetin lên trên 0,25% trong vòng 6 đến 12 tháng. Chủ thể thực hiện là các viện nghiên cứu công nghệ sinh học và doanh nghiệp dược phẩm.
• Mở rộng thử nghiệm tiền lâm sàng trên mô hình in vivo: Tiến hành các thử nghiệm đánh giá khả năng vượt qua hàng rào máu não và hiệu quả cải thiện trí nhớ trên mô hình chuột chuyển gen Alzheimer trong lộ trình 18 đến 24 tháng. Mục tiêu kiểm soát mức độ giảm mảng amyloid trong vỏ não đạt trên 40%. Chủ thể đảm nhận là các trung tâm dược lý thực nghiệm và sinh học phân tử.
• Nghiên cứu công nghệ nano hóa hệ dẫn thuốc: Ứng dụng hệ tiểu phân nano phytosome hoặc liposome nhằm nâng cao độ hấp thu đường uống và độ bền chuyển hóa của Quercetin/Rutin, hướng tới tăng sinh khả dụng lên 45% đến 55% trong vòng 2 năm. Chủ thể phụ trách là các bộ môn công nghệ bào chế dược phẩm.
• Quy hoạch và nâng cao tiêu chuẩn vùng trồng dược liệu: Thiết lập các vùng trồng cây hoa hòe chuyên canh đạt chuẩn GACP-WHO tại các tỉnh trọng điểm như Thái Bình và khu vực Tây Nguyên, đảm bảo hàm lượng flavonoid toàn phần trong nụ hoa đạt trên 20% khối lượng khô trong vòng 3 năm. Chủ thể triển khai là Sở Nông nghiệp các địa phương phối hợp với các hợp tác xã dược liệu.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Công trình nghiên cứu mang lại giá trị học thuật và thực tiễn cao cho 4 nhóm đối tượng trọng tâm:

• Cán bộ nghiên cứu và giảng viên chuyên ngành Hóa thực vật, Dược liệu học: Tài liệu cung cấp chi tiết các thông số đo phổ 1H-NMR, 13C-NMR và ESI-MS/MS chuẩn xác, làm tư liệu tham khảo đối sánh trong nghiên cứu cấu trúc polyphenol.
• Kỹ sư nghiên cứu phát triển (R&D) và doanh nghiệp sản xuất dược - mỹ phẩm: Bản phân tích phương pháp phân lập bằng sắc ký cột và chiết lỏng - lỏng là cơ sở để thiết kế quy trình sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe hỗ trợ tuần hoàn não và chống lão hóa.
• Học viên cao học và sinh viên ngành Sinh học thực nghiệm, Công nghệ sinh học: Luận văn cung cấp phương pháp luận chuẩn mực về quy trình đánh giá hoạt tính ức chế protein gây bệnh bằng kỹ thuật nhuộm huỳnh quang Thioflavin T và thử nghiệm DPPH.
• Các nhà quản lý nông nghiệp và phát triển dược liệu: Luận văn cung cấp luận cứ khoa học vững chắc về giá trị kinh tế - y dược của cây hoa hòe bản địa, hỗ trợ xây dựng định hướng phát triển chuỗi giá trị cây thuốc Việt Nam.

Câu hỏi thường gặp

Hoạt chất nào trong nụ hoa hòe thể hiện khả năng ức chế peptide beta-amyloid tốt nhất? Hai hoạt chất chính được chứng minh có tác dụng vượt trội là Quercetin và Rutin. Trong đó, Quercetin thể hiện hoạt lực ức chế tương tác tạo phiến beta trực tiếp mạnh hơn nhờ cấu trúc aglycone linh hoạt, còn Rutin chiếm hàm lượng vượt trội (1,30% khối lượng khô) mang lại hiệu quả bảo vệ tổng thể cao.

Vì sao nghiên cứu lại sử dụng phương pháp huỳnh quang Thioflavin T để đánh giá sự tích tụ Aβ? Thioflavin T là chất chỉ thị huỳnh quang chuẩn quốc tế có khả năng liên kết đặc hiệu vào các rãnh cấu trúc phiến beta của sợi amyloid. Khi có liên kết, tín hiệu huỳnh quang tại bước sóng 535 nm tăng vọt, cho phép định lượng chính xác mức độ kết tụ peptide trong môi trường in vitro.

Hiệu suất tách chiết cao khô từ nụ hoa hòe trong luận văn đạt bao nhiêu? Quá trình ngâm chiết bằng dung môi methanol đạt hiệu suất thu hồi cao khô trung bình 12,45% (tương đương 2489 mg cao khô từ 20.000 mg nụ hoa hòe khô), tạo tiền đề phân lập các hợp chất đơn lẻ với độ tinh sạch cao.

Cơ chế chống oxy hóa của flavonoid hoa hòe có mối liên hệ gì với bệnh Alzheimer? Não bộ tiêu thụ 20% lượng oxy cơ thể nên rất dễ bị stress oxy hóa. Các flavonoid khử các gốc tự do ROS qua cơ chế nhường hydro và tạo phức chelate với ion kim loại, ngăn chặn quá trình peroxy hóa lipid màng nơron do peptide Aβ1-42 cảm ứng.

Kết quả nghiên cứu in vitro này có thể áp dụng trực tiếp thành thuốc điều trị ngay không? Kết quả in vitro là bước sàng lọc nền tảng khẳng định hoạt tính sinh học. Để chuyển hóa thành thuốc điều trị, hoạt chất cần trải qua các giai đoạn thử nghiệm in vivo đánh giá độ thấm qua hàng rào máu não, độc tính và thử nghiệm lâm sàng kéo dài nhiều năm.

Kết luận

• Luận văn đã phân lập thành công hai hợp chất flavonoid chủ đạo từ nụ hoa hòe khô (Sophora japonica L.) gồm Quercetin (0,20%) và Rutin (1,30%).
• Cấu trúc hóa học của các hợp chất được xác định tường minh thông qua phổ 1H-NMR, 13C-NMR và khối phổ phân giải cao ESI-MS/MS.
• Thử nghiệm sinh học chứng minh các hợp chất có hoạt tính quét gốc tự do DPPH mạnh mẽ và ức chế trên 60% sự hình thành sợi Aβ1-42 in vitro.
• Nghiên cứu đặt nền móng khoa học quan trọng cho việc tận dụng nguồn dược liệu hoa hòe dồi dào tại Việt Nam trong lĩnh vực thoái hóa thần kinh.
• Lộ trình 12 đến 24 tháng tới cần tập trung tối ưu hóa hệ dẫn thuốc nano và thử nghiệm dược lý trên mô hình động vật sống.

Các đơn vị nghiên cứu y dược và doanh nghiệp sản xuất thực phẩm chức năng nên tiếp tục khai thác quy trình chiết xuất và dữ liệu hoạt tính từ luận văn này để phát triển các sản phẩm chăm sóc sức khỏe trí não chất lượng cao, phục vụ cộng đồng trong bối cảnh già hóa dân số nhanh chóng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về bệnh Alzheimer 1. Bệnh Alzheimer trên thế giới và Việt Nam Bệnh Alzheimer là một bệnh thoái hóa thần kinh, biểu hiện bằng giảm trí nhớ và những rối loạn nhận thức khác, kèm theo các thay đổi về hành vi, gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến hoạt động nghề nghiệp và xã hội của bệnh nhân. Bệnh tiến triển nặng dần và không hồi phục.

Bệnh do bác sĩ Alois Alzheimer phát hiện lần đầu năm 1901, ông là người đầu tiên mô tả lâm sàng và đặc điểm giải phẫu bệnh lý của bệnh bao gồm các búi tơ thần kinh (neurofibrillary tangles) và các mảng dạng tinh bột (amyloid plaque). Sau này bệnh được mang tên ông, gọi là bệnh Alzheimer [18]. Trước kia, bệnh Alzheimer thường được dùng chỉ các trường hợp SSTT với người ở độ tuổi 45-65 với những tổn thương mô học điển hình nên còn được gọi là SSTT trước tuổi già (presenile dementia). Còn khái niệm SSTT tuổi già (senile dementia) được xem là do quá trình lão hoá bình thường của não, chủ yếu do các mạch máu trong não bị “xơ cứng” trong quá trình lão hóa.

Từ những năm 70 – 80 của thế kỷ XX, người ta thấy biểu hiện lâm sàng cũng như đặc điểm tổn thương giải phẫu bệnh tương tự ở người trẻ cũng như ở người già nên danh từ bệnh Alzheimer được dùng để chỉ các trường hợp có đặc điểm lâm sàng, tiến triển và giải phẫu bệnh điển hình, bất kể ở lứa tuổi nào [23]. Tuổi càng cao, tỷ lệ mắc SSTT càng nhiều. Cứ sau mỗi năm năm, tỷ lệ mắc bệnh của sa sút trí tuệ toàn bộ lại tăng gần gấp đôi, từ 1,5% ở độ tuổi 60-69 lên 40% ở độ tuổi 90. Một nhóm chuyên gia đã ước tính tỷ lệ mắc bệnh toàn bộ của sa sút trí tuệ ở những người từ 60 tuổi trở lên trên toàn thế giới là 3,9%, Châu Phi là 1,6%, Đông Âu là 3,9%, Trung Quốc 4,0%, Mỹ La tinh 4,6%, Tây Âu 5,4% và Bắc Mỹ 6,4%.

Trong các nguyên nhân gây sa sút trí tuệ, bệnh Alzheimer hay gặp nhất chiếm từ 50 đến 70%, Đỗ Thị Hải Anh 3 Sinh học thực nghiệm K25 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] tiếp đến là sa sút trí tuệ do mạch máu từ 14 đến 25%, còn lại là các nguyên nhân khác [42]. Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới, hiện số người mắc SSTT trên toàn thế giới vào khoảng 50 triệu người. Con số này ước tính sẽ tăng gấp đôi vào năm 2030 (65,7 triệu) và tăng gấp hơn ba lần vào năm 2050 (115,4 triệu người) [60]. Với xu hướng già hoá dân số, cứ sau mỗi khoảng hai mươi năm số người mắc sa sút trí tuệ sẽ tăng gấp đôi.

Mặc dù tỷ lệ mới mắc sa sút trí tuệ ở khu vực các nước phát triển cao hơn, nhưng đa số người bị sa sút trí tuệ sống ở các nước đang phát triển. Trung Quốc và các nước khu vực Tây Thái Bình Dương có số người mắc sa sút trí tuệ cao nhất (6 triệu người), tiếp theo là Cộng đồng Châu Âu (5 triệu), Hoa kỳ (2,9 triệu) và Ấn Độ (1,5 triệu). Tỷ lệ tăng số lượng bệnh nhân sa sút trí tuệ dao động rất nhiều theo vùng, ở các nước đang phát triển cao hơn các nước phát triển từ ba đến bốn lần. Hậu quả là tỷ lệ người bị sa sút trí tuệ ở các nước đang phát triển dự đoán sẽ tăng từ 61% (năm 2000) lên 65% (năm 2020) và 71% (năm 2040).

Tình hình mắc bệnh Alzheimer cũng có bức tranh tương tự [7]. Ở Việt Nam, theo khảo sát của Bệnh viện Tâm thần tiến hành trên 258 người từ 65 tuổi trở lên được chọn ngẫu nhiên từ cộng đồng tại thành phố Hồ Chí Minh cho thấy tỷ lệ mắc SSTT là 7,8% [3]. Nghiên cứu của Bệnh viện Lão khoa Trung ương về tỷ lệ mắc và một số yếu tố liên quan đến SSTT ở người cao tuổi tại huyện Ba Vì, Hà Nội năm 2005 - 2006 cho thấy tỷ lệ người cao tuổi (từ 60 tuổi trở lên) sống tại cộng đồng có SSTT là 4,63%. Cứ sau mỗi khoảng cách 5 tuổi, tỷ lệ mắc bệnh lại tăng lên 1,78 lần [2, 5].

Trong một nghiên cứu về một số đặc điểm dịch tễ học sa sút trí tuệ và suy giảm nhận thức nhẹ ở người cao tuổi Hà Nội (thực hiện trong giai đoạn 2009- 2010) cho thấy tỷ lệ người cao tuổi có sa sút trí tuệ tại xã Thanh Xuân huyện Sóc Sơn, Hà Nội là 5,1% trong tổng số 410 người cao tuổi, ở phường Phương Mai quận Đống Đa, Hà Nội là 3,2% trong tổng số 556 người cao tuổi [7]. Đỗ Thị Hải Anh 4 Sinh học thực nghiệm K25 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Tuy chưa có một điều tra mang tính đại diện cho thực trạng sa sút trí tuệ ở người cao tuổi tại Việt Nam nhưng qua một số nghiên cứu đã được tiến hành thì tỷ lệ mắc sa sút trí tuệ và bệnh Alzheimer tại Việt Nam cũng tương tự như ở các nước khác trong khu vực. Đặc điểm lâm sàng của bệnh Alzheimer Bệnh Alzheimer biểu hiện bằng giảm trí nhớ và những rối loạn nhận thức khác, kèm theo các thay đổi về hành vi [4, 5].  Giảm trí nhớ: là biểu hiện đầu tiên làm cho bệnh nhân và người nhà chú ý.

Đây là triệu chứng đặc trưng nhất của bệnh. Trong giai đoạn đầu chủ yếu giảm trí nhớ gần (không còn khả năng ghi nhận các thông tin mới), giảm khả năng hiểu ngữ nghĩa, nhắc đi nhắc lại một chi tiết. Khi bệnh tiến triển nặng hơn, bệnh nhân quên cả những thông tin đã tiếp thu được từ trước, thậm chí quên tên người thân.  Mất ngôn ngữ (aphasia): Giảm ngôn ngữ là triệu chứng nổi bật trong bệnh cảnh lâm sàng của bệnh Alzheimer.

Bệnh nhân diễn đạt ý nghĩ của mình ngày càng khó khăn, ngôn ngữ nghèo nàn, không lưu loát, khó tìm từ, nói vòng vo, không hiểu hết lời nói của người đối diện, không thể tiếp xúc cùng lúc với nhiều người. Trong giai đoạn muộn, bệnh nhân không nói gì, mất giao tiếp hoàn toàn gây khó khăn lớn cho mối quan hệ giữa bệnh nhân và người chăm sóc.  Mất sử dụng động tác (apraxia): Gần như tất cả bệnh nhân Alzheimer ở giai đoạn nặng đều có mất sử dụng động tác (apraxia). Hay gặp nhất là mất sử dụng động tác ý-vận (ideomotor apraxia), bệnh nhân không có khả năng chuyển một ý định thành động tác có định hướng không gian chính xác, làm cho bệnh nhân khó thực hiện các hoạt động sinh hoạt hàng ngày.

 Mất nhận biết (agnosia), mất khả năng tổng hợp suy luận và rối loạn chức năng thực hiện. Bệnh nhân than phiền là không nhìn rõ đồ vật và vì vậy khó khăn trong việc xác định đồ vật đó. Họ không thể sao chép hoặc miêu tả đồ vật một Đỗ Thị Hải Anh 5 Sinh học thực nghiệm K25 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] cách chính xác, không thể phân biệt các đồ vật tương tự nhau, không thể nhận biết được tất cả các chi tiết của đồ vật, không thể nhận ra được đồ vật dưới các góc nhìn bất thường hoặc không thể phân biệt các hình chồng lên nhau… Bệnh nhân mất khả năng nhận mặt những người quen, mất khả năng nhận diện loài hoa, loại ô tô…  Suy giảm khả năng thực hiện hoạt động: biểu hiện bằng không có khả năng quản lý các nhiệm vụ phức tạp như chi tiêu trong gia đình hoặc chuẩn bị bữa ăn.  Các triệu chứng về hành vi: là những biểu hiện lâm sàng quan trọng và đôi khi bệnh nhân đến khám vì những triệu chứng này: không thừa nhận bệnh, thờ ơ, rối loạn tâm thần (hoang tưởng, ảo giác), rối loạn cảm xúc (trầm cảm, lo âu), kích động,… Biểu hiện lâm sàng điển hình của bệnh Alzheimer theo mức độ:  Nhẹ: Trí nhớ giảm, có thể không rõ với những người thường xuyên tiếp xúc với bệnh nhân, không thực hiện được các hoạt động phức tạp (ví dụ chuẩn bị bữa ăn, chi tiêu), vẫn tự chăm sóc được bản thân, tính tình trở nên thụ động, ít hoặc không có các biểu hiện về hành vi.

 Trung bình: Trí nhớ giảm rõ, không thực hiện được các hoạt động thông thường (như sử dụng bếp, gọi điện thoại), không tự chăm sóc được bản thân (như tắm rửa, trang điểm), có rối loạn hành vi (hội chứng hoàng hôn, hoang tưởng hệ thống - paranoia), kỹ năng giao tiếp xã hội thay đổi, cần người giám sát.  Nặng: Trí nhớ giảm nhiều, chỉ còn những mảnh vụn, không nhận biết được người thân, không thực hiện được mọi hoạt động phức tạp, giảm vận động, cần có người chăm sóc thường xuyên. Chẩn đoán và phòng ngừa bệnh Alzheimer  Chẩn đoán Xác định bệnh Alzheimer chỉ dựa trên giải phẫu bệnh học. Hai tổn thương đặc trưng nhất của bệnh Alzheimer là mảng lão hóa và đám rối tơ thần kinh.

Các tổn Đỗ Thị Hải Anh 6 Sinh học thực nghiệm K25 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] thương này thường xuất hiện trong não nhiều năm trước khi bệnh biểu hiện đầy đủ trên lâm sàng. Ở các tế bào thần kinh bệnh lý xảy ra hiện tượng các vi ống tan rã, tức là các đơn vị vi quản tách rời nhau, hình thành nên đám rối tơ thần kinh. Sơ đồ minh họa quá trình tạo nên đám rối tơ thần kinh [4] Tuy nhiên, các kỹ thuật chẩn đoán hình ảnh hiện đại cũng được xem là có giá trị hỗ trợ chẩn đoán các trường hợp có khả năng là bệnh Alzheimer (probable Alzheimer’s disease). Phương pháp chụp cộng hưởng từ (MRI) sọ não cũng giúp nhận dạng được tình trạng teo vỏ não thùy trong rãnh mũi và teo hồi hải mã ở bệnh nhân Alzheimer.

Các chụp hình hệ thần kinh như chụp cắt lớp phát điện tử dương (Positron Emission Tomography/PET) và chụp cắt lớp phát photon đơn (Single Photon Emission Tomography/SPECT) giúp cho thấy có hình ảnh của giảm chuyển hóa hay giảm tưới máu tại các vùng thái dương đỉnh phía sau.  Phòng ngừa: Có rất nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới đã và đang cố tìm những biện pháp nhằm giảm, hạn chế các yếu tố nguy cơ: Đỗ Thị Hải Anh 7 Sinh học thực nghiệm K25 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail]  Liệu pháp hóc môn thay thế: Nhiều nghiên cứu trên thế giới cùng ghi nhận kết quả ở phụ nữ khi dùng liệu pháp thay thế hóc môn đều giảm được triệu chứng sa sút trí tuệ. DHEA (dehydroepiandrosterone) là hóc môn dùng chống lão hóa ở nữ có tác dụng làm giảm nguy cơ bệnh Alzheimer. Ở nam giới thì liệu pháp thay thế bằng testosteron có hiệu quả tương tự như nữ giới [40].