Tổng quan nghiên cứu

Tình hình bệnh lý ung thư đang gia tăng nhanh chóng trên phạm vi toàn cầu cũng như tại Việt Nam. Theo thống kê của tổ chức GLOBOCAN năm 2020, tỷ suất mắc mới ung thư tại Việt Nam đạt khoảng 159 ca trên 100.000 dân và tỷ suất tử vong do ung thư là 106 ca trên 100.000 dân, xếp thứ 91 trên 185 quốc gia về tỷ lệ mắc mới và thứ 50 trên 185 về tỷ lệ tử vong. Nhu cầu tìm kiếm các hoạt chất sinh học mới có nguồn gốc từ thảo dược tự nhiên nhằm hỗ trợ điều trị ung thư với hiệu quả cao và giảm thiểu độc tính đang trở thành hướng đi trọng tâm của ngành công nghiệp dược phẩm.

Loài Bát giác liên có tên khoa học là Podophyllum difforme Hemsl.Wilson, thuộc họ Hoàng liên gai (Berberidaceae), là cây thuốc quý phân bố chủ yếu tại các vùng núi cao phía Bắc Việt Nam như Hà Giang, Lạng Sơn, Cao Bằng. Theo kinh nghiệm y học cổ truyền, thân rễ Bát giác liên được sử dụng để thanh nhiệt giải độc, tán kết tiêu thũng, điều trị mụn nhọt, rắn cắn và các khối u sưng đau. Tuy nhiên, các nghiên cứu chuyên sâu về thành phần hóa học và tác dụng sinh học theo chuẩn mực hiện đại trên loài thực vật này tại Việt Nam còn rất hạn chế.

Đề tài luận văn thạc sĩ chuyên ngành Dược liệu – Dược học cổ truyền được thực hiện tại Trường Đại học Dược Hà Nội và Viện Dược liệu trong giai đoạn 2022-2023 nhằm giải quyết các mục tiêu cụ thể:

  • Chiết xuất, sàng lọc hoạt tính ức chế tế bào ung thư in vitro của các phân đoạn chiết từ thân rễ Bát giác liên.
  • Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 05 hợp chất tinh khiết từ phân đoạn tiềm năng nhất.
  • Đánh giá hoạt tính ức chế trên 03 dòng tế bào ung thư ở người (MDA-MB-231, HL60, HepG2) và khả năng ức chế sản sinh chất trung gian gây viêm Prostaglandin E2 (PGE2) in vitro của các hợp chất phân lập được.

Nghiên cứu mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn sâu sắc khi cung cấp hệ thống dữ liệu toàn diện về hóa thực vật và dược lý, tạo cơ sở định hướng phát triển các chế phẩm thuốc kháng ung thư thế hệ mới từ nguồn dược liệu bản địa Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng mối liên hệ sinh học phân tử chặt chẽ giữa viêm mạn tính và ung thư. Các bằng chứng y học chỉ ra rằng tình trạng viêm mạn tính đóng góp vào khoảng 15% tổng số ca mắc ung thư trên toàn cầu. Phản ứng viêm kéo dài kích thích các tế bào miễn dịch sản sinh quá mức các chất trung gian tiền viêm, đặc biệt là enzym cyclooxygenase-2 (COX-2) và Prostaglandin E2 (PGE2). Nồng độ PGE2 tăng cao thúc đẩy quá trình tăng sinh tế bào ác tính, ức chế chu trình chết tự nhiên apoptosis, kích thích tân tạo mạch máu nuôi khối u và hỗ trợ tế bào ung thư lẩn tránh hệ thống miễn dịch. Do đó, định hướng tìm kiếm các hợp chất tự nhiên tích hợp đồng thời tác dụng ức chế tăng sinh tế bào ung thư và ức chế sản sinh PGE2 mở ra chiến lược trị liệu đa mục tiêu tiềm năng.

Về mặt hóa học thực vật, chi Podophyllum đặc trưng bởi hai nhóm hợp chất chuyển hóa thứ cấp chính là lignan và flavonoid:

  • Nhóm lignan aryl-tetralin: Điển hình là podophyllotoxin và các dẫn chất peltatin, có khả năng gắn kết đặc hiệu với tubulin, ức chế quá trình trùng hợp vi ống trong phân bào, từ đó chặn đứng chu kỳ tế bào ở pha G2/M.
  • Nhóm hợp chất flavonoid: Bao gồm các dẫn chất flavonol, flavonoid prenyl hóa và dimer flavonoid, thể hiện hoạt tính chống oxy hóa mạnh, ức chế chuỗi tín hiệu tiền viêm NF-kB và giảm biểu hiện gen COX-2.
  • Nồng độ ức chế 50% (IC50): Chỉ số định lượng nồng độ chất thử cần thiết để ức chế 50% sự phát triển của tế bào ung thư hoặc 50% lượng PGE2 sinh ra.
  • Tế bào đại thực bào RAW 264.7: Mô hình tế bào chuẩn để đánh giá phản ứng viêm in vitro dưới tác động kích thích của Lipopolysaccharide (LPS).

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng 4,5 kg thân rễ khô của cây Bát giác liên (Podophyllum difforme) thu hái tại xã Quyết Tiến, huyện Quản Bạ, tỉnh Hà Giang vào tháng 7 năm 2022. Mẫu thực vật có độ tuổi ước tính từ 15 đến 20 năm, được giám định và lưu trữ tiêu bản chính thức tại Trường Đại học Dược Hà Nội với mã số HNIP/18694/23. Phương pháp chọn mẫu tập trung vào các cá thể cây trưởng thành sống tự nhiên dưới tán rừng ẩm nhằm đảm bảo hàm lượng hoạt chất tích lũy tối ưu.

Quy trình nghiên cứu thực nghiệm được triển khai đồng bộ qua các giai đoạn:

  • Chiết xuất và phân đoạn: Thân rễ bột khô được chiết nóng 3 lần bằng ethanol 70% ở nhiệt độ 65°C, thu hồi dung môi dưới áp suất giảm được 855 g cao tổng toàn phần (PDT). Sau đó, 535 g cao tổng được phân tán trong nước nóng và chiết lỏng - lỏng phân đoạn lần lượt với n-hexan, ethyl acetat (EtOAc) và n-butanol, thu được các phân đoạn tương ứng: cao n-hexan (PDH, 7,4 g), cao EtOAc (PDE, 65,6 g), cao n-butanol (PDB, 115,3 g) và cắn nước (PDW, 295,3 g).
  • Phân lập và xác định cấu trúc: Sử dụng kỹ thuật sắc ký cột pha thường silica gel và sắc ký cột pha đảo RP-18 để tinh chế hợp chất. Cấu trúc hóa học được xác định bằng các phương pháp phổ hiện đại gồm phổ khối lượng phun mù điện tử (ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR) và hai chiều (HSQC, HMBC, NOESY) đo ở tần số 600 MHz đối với 1H và 150 MHz đối với 13C.
  • Đánh giá độc tính tế bào in vitro: Thử nghiệm trên 3 dòng tế bào ung thư người gồm ung thư vú di căn MDA-MB-231, ung thư biểu mô gan HepG2 (sử dụng phương pháp nhuộm Sulforhodamine B - SRB) và ung thư bạch cầu cấp HL60 (sử dụng phương pháp đo màu MTT) theo hướng dẫn chuẩn của Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (NCI) với thời gian ủ mẫu từ 48 đến 72 giờ trên đĩa 96 giếng. Doxorubicin và Ellipticin được dùng làm chất đối chứng dương.
  • Đánh giá khả năng ức chế PGE2: Định lượng nồng độ PGE2 tiết ra từ dịch nuôi cấy tế bào đại thực bào RAW 264.7 sau khi kích thích viêm bằng LPS (5 ng/mL) và xử lý với mẫu thử bằng kỹ thuật miễn dịch gắn enzym (ELISA) đo quang phổ ở bước sóng 450 nm. Dexamethason 100 nM được dùng làm đối chứng dương.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình sàng lọc hoạt tính sinh học trên các dòng tế bào ung thư người cho thấy phân đoạn cao ethyl acetat (PDE) thể hiện tác dụng ức chế vượt trội nhất trong tất cả các phân đoạn chiết:

  • Cao PDE ức chế mạnh tế bào HL60 với IC50 đạt 5,90 ± 0,93 µg/ml; ức chế tế bào MDA-MB-231 với IC50 là 6,93 ± 1,05 µg/ml; và ức chế tế bào HepG2 với IC50 là 8,68 ± 1,13 µg/ml. Hiệu lực này cao hơn từ 50% đến 65% so với cao tổng PDT (IC50 từ 14,28 đến 18,78 µg/ml) và cao n-hexan PDH (IC50 từ 14,77 đến 19,06 µg/ml).

Từ 63,6 g cao phân đoạn ethyl acetat, nghiên cứu đã phân lập thành công và xác định chính xác cấu trúc hóa học của 05 hợp chất tinh khiết:

  • Hợp chất BGL1: alpha-peltatin (khối lượng thu nhận 194,5 mg, công thức phân tử C21H20O8).
  • Hợp chất BGL2: podophyllotoxin (dạng bột vô định hình màu trắng, công thức C22H22O8).
  • Hợp chất BGL3: kaempferol (khối lượng thu nhận 324,6 mg, công thức C15H10O6).
  • Hợp chất BGL4: 8,2'-diprenylquercetin 3-methyl ether (bột màu vàng nhạt, công thức C26H28O7).
  • Hợp chất BGL5: dysoverin D (dimer flavonoid quý hiếm liên kết qua cầu nối dioxan, công thức C36H28O13).

Thử nghiệm hoạt tính ức chế tế bào ung thư của các hợp chất đơn lẻ ghi nhận hiệu lực đặc biệt mạnh của nhóm lignan:

  • Hợp chất BGL1 (alpha-peltatin) thể hiện hoạt tính gây độc tế bào cực kỳ mạnh với giá trị IC50 lần lượt là 0,0013 ± 0,0001 µg/ml trên dòng HL60; 0,0017 ± 0,0001 µg/ml trên dòng HepG2; và 0,0023 ± 0,0002 µg/ml trên dòng MDA-MB-231. Hoạt tính này mạnh gấp hơn 204 lần so với chất đối chứng dương Ellipticin trên dòng HL60 và gấp 206 lần trên dòng HepG2.
  • Hợp chất BGL2 (podophyllotoxin) cũng thể hiện độc tính tế bào rất cao với IC50 đạt 0,0035 ± 0,0002 µg/ml (HL60), 0,0059 ± 0,0004 µg/ml (HepG2) và 0,092 ± 0,009 µg/ml (MDA-MB-231).
  • Hai hợp chất flavonoid BGL4 và BGL5 thể hiện mức độ ức chế chọn lọc tốt trên dòng HL60 với IC50 lần lượt là 1,68 ± 0,06 µg/ml và 1,86 ± 0,11 µg/ml, đồng thời ức chế dòng HepG2 với IC50 là 2,14 ± 0,05 µg/ml và 6,41 ± 0,14 µg/ml.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu khẳng định mối tương quan chặt chẽ giữa cấu trúc hóa học và tác dụng sinh học của các hợp chất từ thân rễ Bát giác liên. Hoạt tính ức chế vượt bậc của alpha-peltatin (BGL1) so với podophyllotoxin (BGL2) có thể được giải thích thông qua sự hiện diện của nhóm hydroxyl tự do tại vị trí C-6 trên khung aryl-tetralin kết hợp với trạng thái demethoxy hóa tại vị trí C-4', giúp tăng cường liên kết hydro bền vững với thụ thể tubulin nội bào. Phát hiện này hoàn toàn tương thích với các công bố quốc tế về hoạt tính của nhóm dẫn chất peltatin khi thử nghiệm trên tế bào ung thư biểu mô gan HepG2 với mức IC50 dưới ngưỡng 50 nM.

Bên cạnh đó, việc phân lập thành công hợp chất prenyl flavonoid BGL4 và dimer flavonoid BGL5 mở rộng đáng kể bức tranh hóa thực vật của loài Podophyllum difforme. Cấu trúc liên kết dioxan phức tạp của dysoverin D (BGL5) giữa một phân tử kaempferol và một phân tử podoverin A tạo nên khung phân tử cồng kềnh, vừa có khả năng can thiệp vào quá trình phân chia tế bào ung thư, vừa đóng vai trò quan trọng trong việc ức chế giải phóng các chất trung gian gây viêm như PGE2 từ đại thực bào.

Dữ liệu thực nghiệm của nghiên cứu có thể được trực quan hóa tối ưu thông qua biểu đồ cột so sánh giá trị IC50 giữa các hợp chất tinh khiết và chất đối chứng chuẩn Ellipticin trên từng dòng tế bào, kết hợp với đường cong đáp ứng liều - tác dụng dạng sigmoidal nhằm làm nổi bật dải nồng độ ức chế hiệu quả từ 0,00128 µg/ml đến 100 µg/ml.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các kết quả thực nghiệm và tiềm năng dược lý của thân rễ Bát giác liên, luận văn đưa ra 4 nhóm giải pháp và khuyến nghị hành động cụ thể:

  • Mở rộng nghiên cứu cơ chế phân tử chuyên sâu:

    • Hành động: Thiết lập các thử nghiệm Western Blot và Flow Cytometry để làm sáng tỏ con đường kích hoạt apoptosis phụ thuộc caspase, sự biến đổi chu kỳ tế bào ở pha G2/M và mức độ ức chế phiên mã gen COX-2/NF-kB của hợp chất alpha-peltatin và dysoverin D ở nồng độ dưới 10 nM.
    • Thời gian thực hiện: 12 đến 18 tháng.
    • Chủ thể thực hiện: Nhóm nghiên cứu Dược lý – Sinh học phân tử, Trường Đại học Dược Hà Nội kết hợp với Viện Dược liệu.
  • Chuẩn hóa quy trình chiết xuất và phân lập hoạt chất:

    • Hành động: Tối ưu hóa các thông số dung môi, nhiệt độ và tỷ lệ chiết xuất phân đoạn ethyl acetat trên hệ thống pilot nhằm tăng hiệu suất thu hồi alpha-peltatin và dysoverin D thêm ít nhất 25%, bảo đảm độ tinh khiết hóa học đạt trên 98%.
    • Thời gian thực hiện: 6 đến 12 tháng.
    • Chủ thể thực hiện: Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Dược phẩm, Viện Dược liệu.
  • Bảo tồn nguồn gen và phát triển vùng trồng đạt chuẩn:

    • Hành động: Xây dựng 2 mô hình khoanh vùng bảo tồn nguồn gen tự nhiên tại huyện Quản Bạ (Hà Giang) và Ba Bể (Bắc Kạn), kết hợp nhân giống vô tính để cung ứng khoảng 10.000 cây giống đạt tiêu chuẩn GACP-WHO nhằm tránh nguy cơ cạn kiệt dược liệu quý.
    • Thời gian thực hiện: 24 đến 36 tháng.
    • Chủ thể thực hiện: Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn các tỉnh miền núi phía Bắc phối hợp với các viện nghiên cứu lâm nghiệp và dược liệu.
  • Phát triển dẫn chất bán tổng hợp giảm thiểu độc tính:

    • Hành động: Thực hiện biến đổi cấu trúc hóa học trên khung alpha-peltatin để tổng hợp từ 5 đến 10 dẫn chất mới nhằm tăng chỉ số chọn lọc an toàn (Selectivity Index) trên tế bào lành lên gấp 3 đến 5 lần so với hợp chất gốc trước khi tiến hành thử nghiệm tiền lâm sàng in vivo.
    • Thời gian thực hiện: 24 đến 48 tháng.
    • Chủ thể thực hiện: Phòng Hóa Dược và Hợp chất Thiên nhiên, Viện Hóa học (VAST).

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung và dữ liệu khoa học của luận văn mang giá trị ứng dụng thiết thực cho 4 nhóm đối tượng chuyên môn:

  • Các nhà nghiên cứu và chuyên gia Hóa thực vật:

    • Lợi ích: Tiếp cận quy trình phân tách sắc ký cột chi tiết và bộ dữ liệu phổ 1D/2D-NMR, MS chuẩn xác của 05 hợp chất tự nhiên, đặc biệt là các tín hiệu phân tích cấu trúc phức tạp của dimer flavonoid dysoverin D.
    • Trường hợp sử dụng: Ứng dụng làm tài liệu tham chiếu phổ để định danh nhanh các hoạt chất tương đồng từ họ Hoàng liên gai.
  • Doanh nghiệp Dược phẩm và các trung tâm nghiên cứu phát triển thuốc:

    • Lợi ích: Khai thác nguồn hoạt chất lignan có hoạt tính ức chế tế bào ung thư cực mạnh làm hợp chất dẫn đường (lead compound) để phát triển thuốc mới.
    • Trường hợp sử dụng: Xây dựng hồ sơ phát triển thuốc bán tổng hợp điều trị ung thư vú, ung thư gan hoặc ung thư máu.
  • Giảng viên, học viên sau đại học và sinh viên ngành Dược:

    • Lợi ích: Nắm vững phương pháp luận chuẩn mực trong nghiên cứu dược liệu kết hợp giữa hóa thực vật và sàng lọc dược lý in vitro (SRB, MTT, ELISA).
    • Trường hợp sử dụng: Sử dụng làm tài liệu học tập mẫu mực trong xây dựng đề cương và thực hiện khóa luận tốt nghiệp, luận văn thạc sĩ.
  • Cơ quan quản lý tài nguyên và đơn vị bảo tồn đa dạng sinh học:

    • Lợi ích: Nhận diện giá trị y dược học đỉnh cao của loài thực vật bản địa quý hiếm Podophyllum difforme.
    • Trường hợp sử dụng: Xây dựng đề án chính sách bảo vệ thực vật nguy cấp và phân bổ ngân sách cho các dự án nhân trồng dược liệu quốc gia.

Câu hỏi thường gặp

Loài Bát giác liên (Podophyllum difforme) có đặc điểm hóa học nào khác biệt so với các loài khác cùng chi?

Loài Podophyllum difforme chứa hàm lượng đáng kể nhóm hợp chất lignan aryltetralin như alpha-peltatin và podophyllotoxin, đồng thời tích lũy các dẫn chất flavonoid quý hiếm bao gồm flavonoid prenyl hóa (8,2'-diprenylquercetin 3-methyl ether) và dimer flavonoid (dysoverin D). Cấu trúc dimer flavonoid liên kết qua cầu nối dioxan là nét đặc trưng hiếm thấy, mang lại phổ hoạt tính sinh học đa dạng hơn so với các loài thông thường.

Hợp chất nào phân lập được thể hiện hoạt tính kháng ung thư mạnh nhất trong nghiên cứu?

Hợp chất alpha-peltatin (BGL1) thể hiện hoạt tính ức chế mạnh nhất trên cả 3 dòng tế bào ung thư thử nghiệm, đạt giá trị IC50 là 0,0013 µg/ml trên dòng ung thư bạch cầu cấp HL60, 0,0017 µg/ml trên dòng ung thư gan HepG2 và 0,0023 µg/ml trên dòng ung thư vú MDA-MB-231. Hoạt tính này vượt trội hơn chất đối chứng dương Ellipticin hơn 200 lần.

Tại sao podophyllotoxin tự nhiên ít được sử dụng trực tiếp trên lâm sàng đường toàn thân?

Podophyllotoxin tự nhiên có độc tính toàn thân cao, với liều gây tử vong ước tính trên người là khoảng 350 mg do gây ức chế thần kinh trung ương và tổn thương tế bào gan, thận nghiêm trọng. Do đó, trong y học hiện đại, podophyllotoxin chủ yếu được sử dụng làm nguyên liệu bán tổng hợp ra các dẫn chất có độc tính thấp hơn và hiệu quả chọn lọc cao như etoposid và teniposid.

Phương pháp thử nghiệm tế bào SRB và MTT trong luận văn có ưu điểm gì nổi bật?

Phương pháp SRB (nhuộm protein tế bào bám dính) và MTT (đo hoạt tính enzym dehydrogenase trong ti thể) được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (NCI) công nhận là quy trình chuẩn. Các phương pháp này cho độ nhạy cao, sai số thấp dưới 5%, khả năng sàng lọc đồng thời nhiều dãy nồng độ trên khay 96 giếng và phản ánh chính xác tỷ lệ sống sót của tế bào.

Mối liên hệ giữa hoạt tính ức chế sản sinh PGE2 và tiềm năng điều trị ung thư là gì?

PGE2 là chất trung gian gây viêm mạn tính chủ chốt kích thích tế bào ung thư tăng sinh, thoát khỏi chu trình chết tự nhiên và hình thành mạch máu nuôi khối u. Việc các hợp chất từ Bát giác liên vừa ức chế trực tiếp tế bào ung thư vừa ngăn chặn sản sinh PGE2 từ đại thực bào giúp triệt tiêu môi trường vi mô thuận lợi của khối u, nâng cao hiệu quả ức chế di căn.

Kết luận

  • Chiết xuất thành công 855 g cao toàn phần từ 4,5 kg thân rễ khô của loài Bát giác liên thu hái tại Hà Giang và tạo ra 4 phân đoạn dung môi có độ phân cực khác nhau.
  • Xác định phân đoạn ethyl acetat có hoạt tính ức chế tế bào ung thư mạnh nhất với giá trị IC50 đạt từ 5,90 đến 8,68 µg/ml trên cả 3 dòng tế bào MDA-MB-231, HL60 và HepG2.
  • Phân lập và giải mã cấu trúc hoàn chỉnh của 05 hợp chất tinh khiết gồm alpha-peltatin, podophyllotoxin, kaempferol, 8,2'-diprenylquercetin 3-methyl ether và dysoverin D.
  • Khám phá hoạt tính gây độc tế bào ung thư vượt trội của alpha-peltatin với chỉ số IC50 đạt 0,0013 đến 0,0023 µg/ml, cao hơn chất chuẩn Ellipticin trên 200 lần.
  • Đóng góp cơ sở khoa học hiện đại chứng minh tiềm năng trị liệu ung thư kết hợp kháng viêm thông qua cơ chế ức chế chất trung gian PGE2 của dược liệu Bát giác liên.

Đề tài đã hoàn thành xuất sắc mục tiêu cung cấp bằng chứng thực nghiệm giá trị cao về hóa học và hoạt tính sinh học của loài Podophyllum difforme. Trong lộ trình 2024-2026, các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung đánh giá hiệu lực trên mô hình động vật in vivo và bán tổng hợp các dẫn chất mới tối ưu hóa tính an toàn. Các viện nghiên cứu, trường đại học và doanh nghiệp dược phẩm hãy cùng đẩy mạnh liên kết chuyển giao công nghệ để sớm đưa các hợp chất tự nhiên quý giá này vào thử nghiệm lâm sàng phục vụ người bệnh.