Khảo sát hoạt chất Lovastatin và tối ưu hóa phản ứng PCR trong nấm bào ngư (Pleurotus spp.)

Khóa luận khảo sát hoạt chất lovastatin và tối ưu hóa phản ứng PCR để phát hiện gene trong hệ gene sinh tổng hợp lovastatin của Pleurotus spp.

• Tác giả: Phan Thị Mai Thị
• Người hướng dẫn: ThS. Lâm Vỹ Nguyên
• Trường học: Trường Đại Học Nông Lâm
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Hoạt Chất Lovastatin Trong Nấm Bào Ngư (Pleurotus spp.) Và Tối Ưu Hóa Phản Ứng PCR
• Loại tài liệu: Khóa Luận Tốt Nghiệp
• Năm xuất bản: 2024
• Địa điểm: Thủ Đức

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN
• TÓM TẮT
• ABSTRACT
• 1. CHƯƠNG 1: LỜI NÓI ĐẦU
• 2. CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN VỀ NẤM BÀO NGƯ (Pleurotus spp.)
• 2.1. Giới thiệu về nấm bào ngư (Pleurotus spp.)
• 2.2. Chu trình sống và quá trình phát triển của nấm Pleurotus spp.
• 2.3. Giá trị dinh dưỡng và được tính của nấm bào ngư (Pleurotus spp.)
• 2.4. Giới thiệu về lovastatin
• 2.5. Sinh tổng hợp lovastatin
• 2.6. Các phương pháp phát hiện lovastatin
• 2.6.1. Phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ siêu hiệu năng (UPLC-MS/MS)
• 2.6.2. Phương pháp Polymerase Chain Reaction (PCR)
• 3. CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 3.1. Vật liệu nghiên cứu
• 3.2. Đối tượng nghiên cứu, dụng cụ
• 3.3. Phương pháp nghiên cứu
• 3.3.1. Phát hiện hoạt chất lovastatin bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ siêu hiệu năng (UPLC-MS/MS)
• 3.3.2. Tối ưu hóa phản ứng PCR để phát hiện các gene trong hệ gene sinh tổng hợp lovastatin của một số chủng nấm bào ngư Pleurotus spp.
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả phát hiện lovastatin bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ siêu hiệu năng (UPLC-MS/MS)
• 4.2. Kết quả tối ưu hóa phản ứng PCR để phát hiện các gene trong hệ gene sinh tổng hợp lovastatin của một số chủng nấm bào ngư Pleurotus spp.
• 5. CHƯƠNG 5: ĐỀ NGHỊ
• DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH SÁCH CÁC BẢNG
• DANH SÁCH CÁC HÌNH

Tóm tắt

I. Tổng quan về hoạt chất Lovastatin trong nấm bào ngư

Nấm bào ngư (Pleurotus spp.) là một trong những loại nấm phổ biến và được ưa chuộng trong ẩm thực. Nghiên cứu cho thấy nấm này chứa hoạt chất Lovastatin, một hợp chất có tác dụng hạ cholesterol trong máu. Lovastatin được phát hiện lần đầu tiên trong vi nấm Aspergillus terreus vào năm 1979. Hoạt chất này không chỉ có giá trị dinh dưỡng mà còn có tiềm năng dược lý cao, giúp hỗ trợ điều trị các bệnh tim mạch và ung thư. Việc nghiên cứu Lovastatin trong nấm bào ngư mở ra hướng đi mới cho việc phát triển các sản phẩm chức năng từ nấm.

1.1. Giới thiệu về nấm bào ngư Pleurotus spp.

Nấm bào ngư thuộc chi Pleurotus, có nhiều loài khác nhau như Pleurotus ostreatus và Pleurotus pulmonarius. Chúng được trồng rộng rãi trên toàn thế giới nhờ vào giá trị dinh dưỡng và khả năng sinh trưởng nhanh. Nấm bào ngư không chỉ là thực phẩm mà còn chứa nhiều hoạt chất có lợi cho sức khỏe.

1.2. Tác dụng của Lovastatin trong y học

Lovastatin là một chất ức chế enzyme HMG-CoA, giúp giảm cholesterol trong máu. Nghiên cứu cho thấy Lovastatin có khả năng ngăn ngừa xơ vữa động mạch và hỗ trợ điều trị các bệnh lý tim mạch. Việc phát hiện Lovastatin trong nấm bào ngư mở ra cơ hội mới cho việc phát triển các sản phẩm hỗ trợ sức khỏe.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu Lovastatin

Mặc dù Lovastatin có nhiều lợi ích, việc phát hiện và tối ưu hóa quy trình sản xuất trong nấm bào ngư vẫn gặp nhiều thách thức. Các yếu tố như điều kiện môi trường, phương pháp nuôi trồng và quy trình chiết xuất đều ảnh hưởng đến hàm lượng Lovastatin trong nấm. Ngoài ra, việc tối ưu hóa phản ứng PCR để phát hiện các gene sinh tổng hợp Lovastatin cũng là một thách thức lớn.

2.1. Thách thức trong việc phát hiện Lovastatin

Việc phát hiện Lovastatin trong nấm bào ngư đòi hỏi các phương pháp phân tích chính xác như UPLC-MS/MS. Tuy nhiên, sự biến đổi trong điều kiện nuôi trồng có thể làm thay đổi hàm lượng Lovastatin, gây khó khăn trong việc đánh giá.

2.2. Khó khăn trong tối ưu hóa phản ứng PCR

Tối ưu hóa phản ứng PCR để phát hiện các gene sinh tổng hợp Lovastatin yêu cầu điều chỉnh nồng độ primer và nhiệt độ bắt cặp. Việc này cần phải thực hiện nhiều lần để đạt được kết quả chính xác và đáng tin cậy.

III. Phương pháp phát hiện Lovastatin bằng UPLC MS MS

Phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ siêu hiệu năng (UPLC-MS/MS) được sử dụng để phát hiện Lovastatin trong nấm bào ngư. Phương pháp này cho phép phân tích chính xác và nhanh chóng hàm lượng Lovastatin trong mẫu nấm. Kết quả cho thấy nấm bào ngư có chứa Lovastatin và các tiền chất của nó, mở ra hướng nghiên cứu mới trong lĩnh vực dược liệu.

3.1. Nguyên lý hoạt động của UPLC MS MS

UPLC-MS/MS kết hợp giữa sắc ký lỏng và khối phổ, cho phép tách biệt và xác định các hợp chất trong mẫu. Nguyên lý này giúp phát hiện Lovastatin với độ nhạy cao, từ đó cung cấp thông tin chính xác về hàm lượng trong nấm.

3.2. Kết quả phát hiện Lovastatin trong nấm

Kết quả nghiên cứu cho thấy nấm bào ngư chứa hàm lượng Lovastatin đáng kể. Điều này chứng tỏ tiềm năng của nấm bào ngư như một nguồn nguyên liệu quý giá cho việc sản xuất các sản phẩm chức năng.

IV. Tối ưu hóa phản ứng PCR để phát hiện gene sinh tổng hợp Lovastatin

Tối ưu hóa phản ứng PCR là bước quan trọng trong việc phát hiện các gene sinh tổng hợp Lovastatin trong nấm bào ngư. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng nồng độ primer tối ưu là 0,25 uM với nhiệt độ bắt cặp 60 °C. Kết quả cho thấy độ đặc hiệu cao của các cặp primer trong việc phát hiện gene liên quan đến quá trình sinh tổng hợp Lovastatin.

4.1. Thiết kế primer cho phản ứng PCR

Thiết kế primer dựa trên trình tự gene sinh tổng hợp Lovastatin. Việc lựa chọn các đoạn gene phù hợp là rất quan trọng để đảm bảo độ chính xác trong phản ứng PCR.

4.2. Kết quả tối ưu hóa phản ứng PCR

Kết quả cho thấy kích thước sản phẩm khuếch đại PCR tương đương với kích thước mong muốn. Điều này chứng tỏ rằng phản ứng PCR đã được tối ưu hóa thành công để phát hiện các gene sinh tổng hợp Lovastatin.

V. Ứng dụng thực tiễn của Lovastatin trong nấm bào ngư

Nghiên cứu về Lovastatin trong nấm bào ngư không chỉ có giá trị về mặt khoa học mà còn có ứng dụng thực tiễn cao. Các sản phẩm từ nấm bào ngư có thể được phát triển thành thực phẩm chức năng, hỗ trợ điều trị các bệnh lý liên quan đến tim mạch. Việc khai thác Lovastatin từ nấm bào ngư có thể giúp nâng cao giá trị kinh tế cho ngành nông nghiệp và dược phẩm.

5.1. Phát triển sản phẩm chức năng từ nấm bào ngư

Các sản phẩm chức năng từ nấm bào ngư chứa Lovastatin có thể giúp cải thiện sức khỏe tim mạch. Việc phát triển các sản phẩm này sẽ đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của thị trường về thực phẩm bổ sung dinh dưỡng.

5.2. Tăng giá trị kinh tế cho nông nghiệp

Khai thác Lovastatin từ nấm bào ngư không chỉ giúp nâng cao giá trị dinh dưỡng mà còn tạo ra cơ hội kinh doanh mới cho nông dân. Việc sản xuất nấm bào ngư có thể trở thành một ngành kinh tế tiềm năng trong tương lai.

VI. Kết luận và tương lai của nghiên cứu Lovastatin

Nghiên cứu về Lovastatin trong nấm bào ngư đã mở ra nhiều cơ hội mới trong lĩnh vực dược liệu và thực phẩm chức năng. Việc tối ưu hóa các phương pháp phát hiện và sản xuất Lovastatin sẽ giúp nâng cao giá trị của nấm bào ngư. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe cộng đồng và phát triển kinh tế bền vững.

6.1. Hướng nghiên cứu tiếp theo

Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc phát triển các sản phẩm từ nấm bào ngư chứa Lovastatin. Việc này sẽ giúp khai thác tối đa tiềm năng của nấm trong y học và dinh dưỡng.

6.2. Tầm quan trọng của nghiên cứu trong tương lai

Nghiên cứu về Lovastatin không chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn có giá trị thực tiễn cao. Việc phát triển các sản phẩm từ nấm bào ngư sẽ góp phần nâng cao sức khỏe cộng đồng và phát triển kinh tế địa phương.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Hiện nay, các loài nam nói chung và nam bào ngư (Pleurotus spp.) nói riêng từ lâu đang dần trở thành một trong những thực phẩm ưa thích không thẻ thiếu trong mỗi bữa ăn của con người. Với sự đa dạng về hình dáng, màu sắc khác nhau, thành phần dinh dưỡng (vitamin, chất khoáng, protein.) nam bào ngư đang dần chứng minh giá trị về sức tiêu thụ cả thị trường trong và ngoài nước. Không chỉ đa dạng về màu sắc, hình dạng, chi nam Pleurotus còn thu hút con người bởi sự đa dạng về chủng loài khác nhau như: nam bao ngư xám (Pleurotus ostreatus), nam bao ngu rua (Pleurotus cystidiosus), nam bào ngư đuôi phượng (Pleurotus pulmonarius). Ở Việt Nam, có tiềm năng lớn để sản xuất nấm ăn và nam dược liệu do có nguồn nguyên liệu trồng nắm phong phú, nguồn lao động đồi dào, điều kiện thời tiết thuận lợi cho phát triển nhiều chủng loại nam và có thé trồng nam quanh năm.

Các loài nấm này không chỉ có giá trị dinh dưỡng cao mà còn chứa nhiều thành phần có tác dụng dược liệu cao. Đặc biệt phải kế đến nấm bào ngư Pleurotus spp. hay còn gọi là nam sò là một trong những giống nam được nuôi trồng quan trọng nhất trên thế giới. Một số nghiên cứu cho thấy trong nấm Pleurotus có chứa hàm lượng lovastatin được đưa vào sử dụng như một loại thuốc dé điều trị các bệnh liên quan đến tim mạch, ung thư.

Lovastatin là chất ức chế enzyme HMG — CoA (Hydroxymethylglutaryl coenzyme A reductase), làm hạ lượng cholesterol trong máu giúp ngăn chặn bệnh lý xơ vữa động mạch. Lovastatin được tim thấy đầu tiên vào năm 1979 trên vi nấm thuộc chủng Aspergillus terreus và đã được đưa vào nghiên cứu dé sản xuất lovastatin. Ở Việt Nam, nam lớn đa số được dùng làm thực phẩm nên các nghiên cứu chỉ chú trọng đến điều kiện, kỹ thuật nuôi trồng mà chưa có nhiều báo cáo đánh giá về tác dụng của các hoạt chất sinh học có trong nắm ăn đặc biệt là nắm bào ngư. Ngoài giá trị dinh dưỡng, nam bào ngư còn có nhiều đặc tính dược lý có kha năng hỗ trợ điều trị một số bệnh.

Với mục đích khảo sát để phát hiện hoạt chất lovastatin có giá trị được liệu trên nấm bào ngư nên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Khảo sát hoạt chất lovastatin và tối ưu hóa phản ứng PCR dé phát hiện các gene trong hệ gene sinh tổng hợp lovastatin trong một số chủng nam bào ngư (Pleurotus spp.)” dé hướng tới nghiên cứu các sản phẩm hỗ trợ phòng chống một số bệnh có nguồn gốc từ nắm bào ngư và có thé lai tạo thêm được nhiều chủng nam bào ngư mới mang lại giá trị được liệu cao. Mục tiêu đề tài Phát hiện hoạt chất lovastatin, tối ưu hóa phản ứng PCR khảo sát tìm ra nguồn vật liệu có chứa hệ gene sinh tổng hợp lovastatin trong một số chủng nấm bào ngư (Pleurotus spp. Nội dung thực hiện Nội dung 1: Phát hiện hoạt chất lovastatin bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ siêu hiệu năng (UPLC-MS/MS) trong một số chủng nam bào ngư (Pleurotus spp. Nội dung 2: Tối ưu hóa thiết kế primer, nồng độ primer và nhiệt độ bắt cặp trong phản ứng PCR dé khảo sát hệ gene sinh tổng hợp lovastatin của một số chủng nam bao ngư (Pleurotus spp.

TONG QUAN TÀI LIEU 2. Tống quan về nam bao ngu (Pleurotus spp. Giới thiệu về nắm bao ngư (Pleurotus spp.) Nấm bảo ngư gồm nhiều loài thuộc Chi Pleurotus,c6 tên khoa học là Pleurotus spp. Theo chữ Hy Lạp Pleurotus có nghĩa mang một bên (Pleuron — bên cạnh) và mũ nam có hình dang như vỏ sò (ostes— lỗ tai).

Do có hình dạng giống vỏ sò nên nam bao ngư còn được gọi là nam sò. Chi Pleurotus có tới 39 loài khác nhau về màu sắc, hình dạng như nấm bào ngư xám (P. sajor— cajM) hay (Pleurotus ostreatus), bào ngư trắng (P. Pleurotus salmoneo - tramineus (Nam bào ngư hông) Pleurotus citrinopileatus Pleurotus pulmonarius (Nam bao ngu hoang kim) (Nam bao ngu xam) Hình 2.

Một số loài nam thuộc chi Pleurotus spp. (Nguon: Viện công nghệ sinh hoc ung dung) Phan lớn chúng là nam ăn và được nuôi trồng thương mai. Chi Pleurotus có số lượng nam trồng lớn nhất, chiếm 25 % tổng sản lượng nam trồng trên thế giới và nhiều dạng do quá trình lai tạo. Theo Phạm Thành Hỗ (2022), trong hệ thống phân loại Pleurotus thuộc nhóm sau: Giới (Regnum) : Nấm (Fungi) Ngành (Phylum) : Nấm đảm (Basidiomycota) Lớp (Class) : Nam tản (Agaricomycetes) Bộ (Ordo) : Nấm tản (Agaricales) Họ (Familia) : Nấm sò (Pleurotaceae) Chi (Genus) : Nam sò (Pleurotus) Nam bao ngư (Pleurotus) được trồng nhiều ở các nước Châu Âu, Châu Á và các nước nhiệt đới, trong đó có Việt Nam.

Trước đây, nắm bào ngư chủ yếu mọc hoang dại và được gọi với nhiều tên tùy theo vùng miễn: miền Bắc gọi là nấm chân dai (nam hương trang), nam sò, còn nấm dai thường được gọi phd biếnở miền Nam (Nguyễn Lân Hùng, 2005). Theo Phạm Thành Hỗ (2022), nam bào ngư được khuyến khích trồng nhiều ở các nước đang phát triển nhằm tạo nguồn thực phẩm bổ sung, đồng thời xử lý các phế liệu nông lâm nghiệp dé tránh ô nhiễm, lại làm giàu chất hữu cơ cho đất. Do có nhiều ưu thé nên nấm bào ngư được nghiên cứu nhiều hon nam rơm. Ở miền Nam khoảng thời gian từ tháng 11 đến tháng 2 khí hậu lạnh hơn nam bào ngư mọc tốt cho năng suất cao.

Nam bào ngư được khuyến khích trồng ở các nước đang có nền kinh tế phát triển nhằm cung cấp nguồn thức ăn chứa protein thực vật. Việc nuôi trồng nắm bào ngư giúp ích cho việc tận dụng các chất thải nông nghiệp làm nguyên liệu nuôi trồng, giải quyết tình trạng gây 6 nhiễm và góp phần cung cấp cho đất nguồn ni tơ hữu cơ tốt cho sự phát triển của hệ vi sinh vật (Nguyễn Hữu Hỷ và ctv, 2015). Chu trình sống và quá trình phát triển của nam Pleurotus spp. Nam bào ngư Pleurotus thuộc ngành Basidiomycota, vậy nên vòng đời của các loài thuộc chi Pleurotus cơ bản có các giai đoạn chính tương tự như vòng đời chung của ngành Basidiomycota.

Chu trình sống của nam đảm Basidiomycota gồm có hai pha chính: pha đơn bội (monokaryon) và pha song nhân (dikaryon). Trong suốt vòng đời của ngành Basidiomycota trải qua chín giai đoạn (Hình 2.3) bao gồm: (1) Bào tử nảy mầm (Germination) (2) Hình thành các sợi nấm đồng nhân (Homokaryotic mycelia) (3) Hai sợi đồng nhân dung hợp nguyên sinh chất (Plasmogamy) (4) Hình thành sợi nam song di nhân (Heterokaryotic dikaryon) (5) Hình thành quả thé (Fruit body) (6) Hình thành đảm ở tai nắm trưởng thành (Basidia) (7) Dung hợp nhân (Karyogamy) (8) Quá trình giảm phân (Meiosis) (9) Hình thành 4 bào tử dam (Basidiospores) 6 Sonate AL= [he eK£*7ƒ 5 kh ay F.xX “xu Ya,sien 2. Homokaryotic — Mycelio — Pha don bội đồng nhân (Homokaryotic haploid phase) =—— Pha song di nhân (Heterokarvotic dikaryotic phase) —mmmms Pha lưỡng bội (Diploid phase) ----- Chu ky v6 tinh (Asexual cycle) == Chu ky v6 tinh (Asexual cycle) Hình 2. Vong đời co bản của các loài thuộc chi Basidiomycota.

(Cao Ngọc Kim Thoa, 2021) Vòng đời của loài thuộc Basidiomycota bắt đầu từ pha đơn bội có các bào tử đảm nảy mầm tạo thành các sợi nắm đồng nhân (các sợi này giống nhau về mặt đi truyền), trong mỗi khoang của sợi nấm sẽ chỉ chứa một nhân. Các sợi nam này có thể nhân lên độc lập nhờ chu trình sinh sản vô tính (Asexual cycle) hoặc có thé dung hợp vách tế bào và nguyên sinh chất (còn gọi là plasmogamy). Khi hai sợi đồng nhân có kiểu đi truyền tương hợp nhau tiếp xúc nhau thì dan đến sự dung hợp vách tế bao và nguyên sinh chất. Sau khi dung hợp, các nhân sẽ di chuyển và bắt cặp với nhau tạo thành sợi nam song di nhân với mỗi khoang của sợi nấm chứa hai nhân khác nhau từ đây bước vào pha song nhân.

Ở hệ sợi song dị nhân, các sợi nắm cũng có thể nhân lên độc lập nhờ chu trình sinh sản vô tính hoặc tiếp tục phát triển hình thành quả thể. Khi tai nam trưởng thành, chỉ tại một số tế bào đặc biệt nằm ở lớp ngoài cùng, gọi là đảm, sự dung hợp hai nhân mới xảy ra và kết quả làm các tế bào đảm từ dạng song nhân chuyển sang dạng lưỡng bội (diploid). Đảm lưỡng bội trải qua quá trình giảm phân tạo ra bốn bào tử đơn nhân mới. Các đơn nhân này sẽ di chuyển vào trong các bào tử đảm nằm trên cuống đảm.

Kết thúc vòng đời, các bào tử hoàn chỉnh được phát tán vào môi trường (Cao Ngọc Kim Thoa, 2021). Ở các giai đoạn hệ sợi đồng nhân và hệ sợi song dị nhân, các sợi nam đồng nhân và song di nhân có thé trải qua hoặc không trải qua chu kỳ sinh san vô tinh bằng cách tạo ra các bào tử vô tính — oidia (bào tử vách mỏng) hoặc chlamydospores (bao tử vách dày). Nếu bao tử vô tinh là đơn nhân thì sẽ tái tao lại sợi nam đồng nhân bố mẹ. Nếu bào tử vô tính là song nhân thì sẽ hình thành lại sợi nấm song dị nhân.

Giá trị dinh dưỡng và được tính của nấm bào ngư (Pleurotus spp.) Nam bào ngư cung cấp đạm thực vật tốt cho cơ thé, kha năng tiêu hóa của nam đạt 90 % có thé so sánh với thịt do hàm lượng protein có trong nam khô chiếm từ 10 - 40 % tùy loài (Patel, 2012; Maftoun và ctv, 2013). Theo Nguyễn Lân Dũng (2003), nắm bảo ngư là thực phẩm ăn ngon và có nhiều giá trị đỉnh dưỡng cao do trong nam có nhiều acid amin thiết yếu va các vitamin nhóm B như BI, B2, B5 (Niacin), B6 va vitamin nhóm C. Nam chứa 20 — 25 % protein (trọng lượng khô), béo thấp va 8 loại acid amin thiết yếu như Glutamic, Valin, Isoleucine, Leucin, Methionine, Phenylalanine, Threonine, Tyrosine (Nguyễn Lan Dũng, 2003). Ngày nay, các nghiên cứu về các chất có hoạt tính sinh học trong nam bao ngư càng được quan tâm nhiêu hơn, cụ thê là đã có nhiêu công trình nghiên cứu chỉ ra các dược tính của nấm bào ngư ví dụ như khả năng kháng ung thư, kháng khối u, kháng viêm khớp.

Về mặt y học, nam ăn cũng có những đặc tính khác như phòng ngừa và chữa bệnh nhờ vào các hoạt chất chống nấm, kháng độc tố, chất chống oxy hóa. Nắm còn giúp hạ huyết áp, tăng sự miễn dịch của cơ thé, chéng béo phì, giảm mỡ máu, ức chế khối u và cũng tốt cho bệnh nhân tiêu đường. Các thành phần hoạt tính sinh học trong nam gồm các hợp chất có trọng lượng phan tử cao (polysaccharide, peptide và protein) và trọng lượng phân tử thấp (terpenoid, este axit béo và polyphenol).