MỞ ĐẦU Ở Việt Nam và nhiều nƣớc trong khu vực Đông Nam Á nhƣ Thái lan, Indonesia, Lào …, nghề mây tre đan luôn giữ vai trò đặc biệt quan trọng trong phát triển kinh tế xã hội. Nghề mây tre đan giải quyết công ăn việc làm cho nhiều ngƣời dân lúc nông nhàn, tạo ra sản phẩm hàng hóa đáp ứng nhu cầu tiêu dùng và xuất khẩu, góp phần xoá đói giảm nghèo, tăng thu nhập và hỗ trợ các ngành khác cùng phát triển. Vì vậy, đẩy mạnh phát triển loại nghề thủ công này, hiện nay đƣợc xem là bƣớc đi đúng đắn để giải quyết triệt để bài toán về kinh tế, xã hội, môi trƣờng ở một số vùng trong cả nƣớc. Do đặc tính bền, đẹp, đa tác dụng các sản phẩm từ Mây đã đƣợc ngƣời dân sử dụng làm ra các vật dụng phục vụ cuộc sống hàng ngày, đồ thủ công mỹ nghệ xuất khẩu.
Tuy nhiên hầu hết các làng nghề Mây tre đan ở nƣớc ta đang gặp phải những khó khăn về sự thiếu hụt nguyên liệu và nguồn nguyên liệu không đảm bảo chất lƣợng dẫn đến tính ổn định không cao. Những năm gần đây Bộ Nông nghiệp & PTNT đã có chƣơng trình đầu tƣ mở rộng diện tích trồng Mây nguyên liệu gắn với phát triển bền vững của các làng nghề. Để nâng cao đƣợc năng xuất, chất lƣợng nguyên liệu Mây ngoài việc cải thiện những yếu tố về thâm canh việc cải thiện chất lƣợng cây giống phải đƣợc đặc biệt quan tâm. Giống Mây lá đơn (Calamus simplicifolius Wei) là giống có nguồn gốc từ đảo Hải Nam, Trung Quốc có chất lƣợng tốt, năng xuất cao đang đƣợc gây trồng phổ biến ở các tỉnh phía Nam Trung Quốc.
Trong chƣơng trình hợp tác, Viện nghiên cứu Lâm nghiệp nhiệt đới - Viện hàn lâm khoa học Lâm nghiệp Trung Quốc đã chuyển giao công nghệ nhân giống in vitro và một lƣợng mẫu sạch giống Mây lá đơn cho trƣờng Đại học Lâm Nghiệp Việt Nam. Mặc dù qui trình nhân giống Mây lá đơn bằng phƣơng pháp nuôi cấy in vitro đã đƣợc phía Trung Quốc chuyển giao. Tuy nhiên hiệu suất của qui trình nhân giống in vitro phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ: Điều kiện phòng thí nghiệm loại hoá chất sử dụng (chất đa lượng, vi lượng, vitamin, chất điều hoà sinh trưởng,…), điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, độ 1 ẩm, ánh sáng, giá thể…), kĩ thuật nuôi cấy và điều kiện khí hậu, đất đai…. Do đó để áp dụng qui trình vào sản xuất có hiệu quả cao cần phải hoàn thiện từng công đoạn cho phù hợp với điều kiện của Việt Nam.
Xuất phát từ cơ sở trên chúng tôi lựa chọn đề tài “Nghiên cứu hoàn thiện quy trình kĩ thuật nhân giống in vitro cho giống Mây lá đơn (Calamus simplicifolius Wei)” làm khoá luận tốt nghiệp. Hy vọng góp phần đƣa giống Mây mới, có năng xuất cao, chất lƣợng tốt vào gây trồng ở Việt Nam phục vụ cho phát triển trồng rừng sản xuất, cung cấp nguyên liệu bền vững cho các làng nghề. Nội dung nghiên cứu thuộc một phần đề tài cấp cơ sở, Đại học Lâm nghiệp “Nghiên cứu phát triển giống mây lá đơn (Calamus simplicifolius Wei), đã đƣợc tuyển chọn ở Trung Quốc cho một số tỉnh miền Bắc – Việt Nam” 2 Chƣơng 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1. Cơ sở của kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.
Tính toàn năng của tế bào Haberlandt (1902) lần đầu tiên đã quan niệm rằng mỗi tế bào bất kì của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Theo quan niệm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đều mang toàn bộ lƣợng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Đó là tính toàn năng của tế bào [19].
Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận của phƣơng pháp nuôi cây mô và tế bào thực vật. Cho đến nay con ngƣời đã hoàn toàn chứng minh đƣợc khả năng tái sinh tạo thành một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ. Sự phản phân hóa và phân hóa của tế bào Cơ thể thực vật trƣởng thành là một thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, đƣợc hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau. Tuy nhiên tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồi từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp tử).
Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia hình thành nhiều tế bào phôi sinh chƣa mang chức năng riêng biệt (chuyên hóa). Sau đó các tế bào phôi sinh này tiếp tục đƣợc biến đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc hiệu cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau. Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau. Ví dụ, mô dậu làm nhiệm vụ quang hợp, mô bì làm nhiệm vụ bảo vệ.
Quá trình phân hóa tế bào có thể biểu thị Tế bào phôi sinh → tế bào giãn→ tế bào phân hóa có chức năng riêng biệt Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình, trong điều kiện cần 3 thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ. Quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào, ngƣợc lại với sự phân hóa tế bào. Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa, ức chế các gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen đƣợc hoạt hóa để cho tính trạng mới, còn một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động.
Điều này xảy ra theo một chƣơng trình đã đƣợc mã hóa trong cấu trúc của phân tử DNA của mỗi tế bào khiến cho quá trình sinh trƣởng và phát triển của cơ thể thực vật luôn đƣợc hài hòa. Mặt khác khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thƣờng bị ức chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thƣớc của khối mô sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự hoạt hóa các gen của tế bào. Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thực chất là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào.
Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực chất là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật, một cách định hƣớng dựa vào sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực vật. Để điều khiển sự phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, ngƣời ta thƣờng bổ sung vào môi trƣờng hai nhóm chất điều hòa sinh trƣởng chính là auxin và cytokinin. Tỉ lệ hàm lƣợng hai nhóm chất điều hòa sinh trƣởng khác nhau trong môi trƣờng sẽ tạo ra sự phát sinh hình thái khác nhau. Trong môi trƣờng nuôi cấy nếu nồng độ auxin/cytokinin lớn hơn 1 thì sự phát sinh hình thái của mô theo hƣớng tạo rễ, khi tỉ lệ nuôi cấy này nhỏ hơn 1 thì mô nuôi cấy sẽ phát sinh theo hƣớng tạo chồi, còn tỉ lệ này cân đối thì sẽ phát sinh theo hƣớng tạo mô sẹo (callus) [1].
Các nhân tố ảnh hƣởng tới quá trình nhân giống in vitro 1. Thành phần môi trƣờng dinh dƣỡng Ở thời kì Haberlandt cũng đã tiến hành các thí nghiệm nuôi cấy tế bào thực vật. Nhƣng vào thời kì đó những hiểu biết về nhu cầu dinh dƣỡng khoáng của mô và tế bào thực vật còn rất hạn chế, đặc biệt là vai trò của các 4 chất điều hòa sinh trƣởng hầu nhƣ chƣa đƣợc khám phá. Chính vì vậy mà Haberlandt đã không thành công.
Đến nay có hàng trăm loại môi trƣờng dinh dƣỡng nhân tạo đã đƣợc xây dựng và thử nghiệm có kết quả. Hầu hết các loại môi trƣờng đều gồm những nhóm chất chính sau: Các loại muối khoáng, nguồn các bon, vitamin, các chất điều hòa sinh trƣởng, các nhóm chất bổ sung, chất độn. Các loại muối khoáng Các nguyên tố khoáng dùng trong môi trƣờng dinh dƣỡng nuôi mô và tế bào thực vật đƣợc chia thành hai nhóm: nhóm đa lƣợng và nhóm vi lƣợng + Các nguyên tố khoáng đa lƣợng Bao gồm các nguyên tố khoáng đƣợc sử dụng ở nồng độ trên 30ppm (30mg/l). Những nguyên tố đó là N, S, P, K, Mg, Ca.
Riêng Na và Cl cũng đƣợc sử dụng trong một vài môi trƣờng nhƣng vẫn chƣa rõ tác dụng của chúng. - Nitơ (N): Đƣợc sử dụng ở hai dạng NO3- và NH4+ riêng rẽ hoặc phối hợp với nhau. Hầu hết các thực vật đều có khả năng khử nitrat thành amonium thông qua hệ thống nitrat reductase. Amonium đƣợc tế bào thực vật đồng hóa trực tiếp để sinh tổng hợp các chất hữu cơ nhƣ axit amin.
Điều đáng lƣu ý là nếu chỉ dùng amonium thì sinh trƣởng của tế bào giảm, thậm chí ngừng hoàn toàn. Nguyên nhân chính là do quá trình trao đổi ion của tế bào xảy ra lệch dẫn đến tình trạng thay đổi pH của môi trƣờng. Cụ thể: khi chỉ dùng nitrat độ pH của môi trƣờng giảm dần do tế bào hấp thu NO3- hoặc NH4+ và thải ra ngoài môi trƣờng loại ion có giá trị tƣơng đƣơng. Khi pH tăng thì quá trình trao đổi Fe của tế bào kém đi, kết quả là tế bào sinh trƣởng chậm lại.
Vì vậy hầu hết các loại môi trƣờng đều dùng nitrat và amonium dạng phối hợp nhƣng tùy theo đặc tính hấp thu nitơ của loài cây đó mà phối hợp theo tỉ lệ thích hợp. - Lƣu huỳnh (S) : Chủ yếu và tốt nhất là muối SO42-. Các dạng ion khác nhƣ SO32- hoặc SO2 thƣờng kém tác dụng thậm chí còn gây độc. - Photpho (P) : Mô và tế bào thực vật nuôi cấy có nhu cầu về photpho rất cao.
P là một trong những thành phần cấu trúc của phân tử axit nucleic. 5 Ngoài không khí photpho ở dạng H2PO4 và HPO4 còn có tác dụng nhƣ một hệ thống đệm làm ổn định pH của môi trƣờng trong quá trình nuôi cấy. + Các nguyên tố vi lƣợng Là các nguyên tố đƣợc sử dụng ở nồng độ thấp hơn 30ppm. Đó là Fe, B, Mn, Mo, Cu, Zn, Ni, Co.
- Sắt (Fe): Thiếu sắt tế bào mất khả năng phân chia. Thiếu Fe làm giảm hàm lƣợng RNA và giảm sinh tổng hợp protein, nhƣng làm tăng hàm lƣợng DNA axit amin tự do, kết quả là giảm phân bào.