Nghiên cứu xác định hòa hợp HLA giữa bệnh nhân và người hiến tế bào gốc

Nghiên cứu xác định hòa hợp HLA giữa bệnh nhân và người hiến bằng kỹ thuật PCR SSO, định hướng ghép tế bào gốc điều trị bệnh thalassemia.

• Tác giả: Lê Xuân Thịnh
• Người hướng dẫn: BS Trần Ngọc Quế
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Nghiên cứu xác định hòa hợp HLA giữa bệnh nhân và người hiến bằng kỹ thuật PCR-SSO để định hướng ghép tế bào gốc trong điều trị bệnh thalassemia
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Kháng nguyên hệ bạch cầu người
• 1.2. Khái niệm human leukocyte antigen
• 1.3. Hệ thống HLA
• 1.4. Chức năng của HLA
• 1.5. Phân bố gen HLA trong cơ thể
• 1.6. Kỹ thuật định danh HLA
• 1.7. Tế bào gốc
• 1.8. Khái niệm tế bào gốc
• 1.9. Tế bào gốc huy động ra máu ngoại vi
• 1.10. Tế bào gốc từ máu dây rốn
• 1.11. Ghép tế bào gốc trong điều trị bệnh thalassemia
• 1.12. Ghép tế bào gốc
• 1.13. Nghiên cứu hòa hợp HLA ở Việt Nam và trên Thế giới
• 2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị
• 2.2. Đối tượng nghiên cứu
• 2.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5. Thiết kế nghiên cứu
• 2.6. Các bước tiến hành nghiên cứu
• 2.7. Chỉ số nghiên cứu
• 2.8. Xử lý số liệu
• 2.9. Đạo đức nghiên cứu
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu hòa hợp HLA trong ghép tế bào gốc

Nghiên cứu hòa hợp HLA (Human Leukocyte Antigen) đóng vai trò quan trọng trong việc ghép tế bào gốc, đặc biệt là trong điều trị bệnh thalassemia. HLA là một hệ thống kháng nguyên bạch cầu người, có chức năng chính trong việc nhận diện và phản ứng miễn dịch. Việc xác định sự hòa hợp HLA giữa bệnh nhân và người hiến là cần thiết để đảm bảo thành công của quá trình ghép tế bào gốc. Nghiên cứu này không chỉ giúp cải thiện tỷ lệ thành công trong ghép mà còn giảm thiểu nguy cơ thải ghép, từ đó nâng cao chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân.

1.1. Khái niệm và vai trò của HLA trong ghép tế bào gốc

HLA là một phần quan trọng trong hệ thống miễn dịch của cơ thể, giúp nhận diện các tế bào lạ. Trong ghép tế bào gốc, sự hòa hợp HLA giữa người cho và người nhận là yếu tố quyết định thành công của ca ghép. Hệ thống HLA bao gồm nhiều alen khác nhau, và việc xác định chính xác các alen này là rất quan trọng.

1.2. Tình hình nghiên cứu hòa hợp HLA tại Việt Nam

Tại Việt Nam, nghiên cứu hòa hợp HLA đang được chú trọng, đặc biệt trong điều trị bệnh thalassemia. Các trung tâm y tế lớn đã triển khai nhiều nghiên cứu nhằm xác định sự hòa hợp HLA giữa bệnh nhân và người hiến, từ đó nâng cao hiệu quả của các ca ghép tế bào gốc.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu hòa hợp HLA

Mặc dù nghiên cứu hòa hợp HLA đã đạt được nhiều thành tựu, nhưng vẫn còn nhiều thách thức cần phải vượt qua. Một trong những vấn đề lớn nhất là sự đa dạng của các alen HLA, điều này làm cho việc tìm kiếm người hiến phù hợp trở nên khó khăn hơn. Ngoài ra, việc thiếu thông tin về các alen HLA trong cộng đồng cũng là một rào cản lớn.

2.1. Đa dạng alen HLA và ảnh hưởng đến ghép tế bào gốc

Sự đa dạng của các alen HLA có thể dẫn đến khó khăn trong việc tìm kiếm người hiến phù hợp. Mỗi cá nhân có thể mang nhiều alen khác nhau, và việc xác định chính xác các alen này là rất quan trọng để đảm bảo sự hòa hợp trong ghép tế bào gốc.

2.2. Thiếu thông tin về HLA trong cộng đồng

Nhiều người dân chưa hiểu rõ về tầm quan trọng của việc hiến tế bào gốc và sự hòa hợp HLA. Điều này dẫn đến việc thiếu nguồn cung cấp tế bào gốc từ người hiến, ảnh hưởng đến khả năng điều trị cho bệnh nhân.

III. Phương pháp nghiên cứu hòa hợp HLA hiệu quả

Để xác định sự hòa hợp HLA, nhiều phương pháp đã được áp dụng, trong đó kỹ thuật PCR-SSO (Polymerase Chain Reaction - Sequence Specific Oligonucleotide) là một trong những phương pháp phổ biến nhất. Phương pháp này cho phép xác định nhanh chóng và chính xác các alen HLA, từ đó giúp định hướng ghép tế bào gốc.

3.1. Kỹ thuật PCR SSO trong xác định HLA

Kỹ thuật PCR-SSO là một phương pháp hiện đại, cho phép xác định các alen HLA một cách nhanh chóng và chính xác. Phương pháp này sử dụng các oligonucleotide đặc hiệu để phát hiện sự hiện diện của các alen HLA trong mẫu DNA.

3.2. Lợi ích của việc sử dụng PCR SSO

Việc sử dụng kỹ thuật PCR-SSO giúp giảm thiểu thời gian và chi phí trong quá trình xác định HLA. Ngoài ra, phương pháp này còn giúp nâng cao độ chính xác trong việc tìm kiếm người hiến phù hợp cho bệnh nhân.

IV. Ứng dụng thực tiễn của nghiên cứu hòa hợp HLA

Nghiên cứu hòa hợp HLA không chỉ có ý nghĩa trong lý thuyết mà còn có nhiều ứng dụng thực tiễn trong điều trị bệnh thalassemia. Việc xác định chính xác sự hòa hợp HLA giúp nâng cao tỷ lệ thành công trong ghép tế bào gốc, từ đó cải thiện chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân.

4.1. Tăng cường tỷ lệ thành công trong ghép tế bào gốc

Nghiên cứu hòa hợp HLA giúp xác định người hiến phù hợp, từ đó tăng cường tỷ lệ thành công trong các ca ghép tế bào gốc. Điều này đặc biệt quan trọng đối với bệnh nhân thalassemia, những người cần ghép tế bào gốc để điều trị.

4.2. Cải thiện chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân

Việc ghép tế bào gốc thành công không chỉ giúp điều trị bệnh mà còn cải thiện chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân. Nghiên cứu hòa hợp HLA đóng vai trò quan trọng trong việc đạt được mục tiêu này.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu hòa hợp HLA

Nghiên cứu hòa hợp HLA trong ghép tế bào gốc là một lĩnh vực quan trọng và cần thiết trong y học hiện đại. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều tiến bộ mới, giúp cải thiện hiệu quả điều trị cho bệnh nhân. Việc nâng cao nhận thức về tầm quan trọng của HLA và khuyến khích hiến tế bào gốc sẽ là những yếu tố quyết định cho sự thành công trong tương lai.

5.1. Tiềm năng phát triển nghiên cứu hòa hợp HLA

Nghiên cứu hòa hợp HLA có tiềm năng phát triển mạnh mẽ trong tương lai, với nhiều công nghệ mới được áp dụng. Điều này sẽ giúp nâng cao hiệu quả trong việc ghép tế bào gốc và điều trị bệnh.

5.2. Khuyến khích hiến tế bào gốc trong cộng đồng

Việc nâng cao nhận thức về tầm quan trọng của hiến tế bào gốc và sự hòa hợp HLA sẽ giúp tăng cường nguồn cung tế bào gốc cho bệnh nhân. Các chiến dịch truyền thông cần được triển khai để khuyến khích mọi người tham gia hiến tặng.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Thalassemia là bệnh di truyền phổ biến nhất Đông Nam Á và trên thế giới, với khoảng 7% dân số mang gen bệnh và hàng năm có khoảng 300.000 trẻ sinh ra mắc bệnh thalassemia mức độ nặng. Tại Việt Nam, ước tính khoảng 10% dân số mang gen bệnh và mỗi năm có khoảng 20.000 trẻ sinh ra bị thalassemia. Bệnh nhân thalassemia phải điều trị thường xuyên bằng truyền máu và thải sắt, gây gánh nặng kinh tế lớn cho gia đình và xã hội, đồng thời ảnh hưởng đến chất lượng giống nòi. Ghép tế bào gốc tạo máu (TBG) đồng loài hiện là phương pháp điều trị tiềm năng nhất, đặc biệt khi có nguồn tế bào gốc hòa hợp kháng nguyên bạch cầu người (HLA).

Nghiên cứu này nhằm xác định mức độ hòa hợp HLA giữa bệnh nhân thalassemia và người hiến tế bào gốc bằng kỹ thuật PCR-SSO, từ đó định hướng ghép tế bào gốc hiệu quả. Phạm vi nghiên cứu bao gồm 80 bệnh nhân thalassemia có chỉ định ghép, 58 người hiến cùng huyết thống và 3000 đơn vị máu dây rốn cộng đồng tại Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương, thực hiện từ tháng 12/2015 đến tháng 6/2017. Việc xác định chính xác HLA giúp nâng cao tỷ lệ thành công ghép, giảm nguy cơ thải ghép và bệnh ghép chống chủ, góp phần cải thiện chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân thalassemia.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

HLA (Human Leukocyte Antigen) là hệ thống kháng nguyên bạch cầu người, quy định bởi vùng gen trên nhiễm sắc thể số 6, đóng vai trò quan trọng trong nhận diện miễn dịch và thải ghép. HLA gồm ba lớp chính: lớp I (HLA-A, B, C), lớp II (HLA-DR, DQ, DP) và lớp III (mã hóa bổ thể và các protein khác). HLA lớp I biểu hiện trên hầu hết các tế bào có nhân, trình diện peptide cho tế bào T CD8; HLA lớp II biểu hiện trên tế bào trình diện kháng nguyên, kích hoạt tế bào T CD4. Mức độ hòa hợp HLA giữa người cho và người nhận quyết định thành công ghép tế bào gốc.

Kỹ thuật PCR-SSO (Sequence Specific Oligonucleotide) kết hợp với hệ thống Luminex được sử dụng để xác định HLA ở độ phân giải cao, cho phép phân tích đồng thời nhiều mẫu và nhiều locus HLA với độ chính xác cao. Kỹ thuật này dựa trên phản ứng PCR khuếch đại gen HLA, sau đó lai với các đầu dò đặc hiệu gắn trên hạt nhựa mã hóa huỳnh quang, phân tích bằng máy Luminex để xác định alen HLA.

Các khái niệm chính bao gồm:

• HLA và vai trò trong ghép tế bào gốc
• Tế bào gốc tạo máu từ máu ngoại vi, máu dây rốn và tủy xương
• Mức độ hòa hợp HLA tối thiểu 4/6 locus (HLA-A, B, DR) cho ghép tế bào gốc từ máu dây rốn
• Kỹ thuật PCR-SSO và hệ thống Luminex trong định nhóm HLA

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu mô tả cắt ngang, kết hợp hồi cứu và tiến cứu, thực hiện tại Ngân hàng Tế bào gốc, Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương từ tháng 12/2015 đến tháng 6/2017. Cỡ mẫu gồm 80 bệnh nhân thalassemia có chỉ định ghép, trong đó 58 bệnh nhân có người hiến cùng huyết thống (anh/chị/em ruột) và 22 bệnh nhân không có người hiến cùng huyết thống. Ngoài ra, 3000 đơn vị máu dây rốn cộng đồng được sử dụng để tìm kiếm người hiến không cùng huyết thống.

Mẫu ADN được tách từ máu bệnh nhân, dịch tế bào ối (thai nhi) và máu dây rốn bằng kit tách ADN OMEGA. Xác định HLA được thực hiện bằng kỹ thuật PCR-SSO trên hệ thống Luminex, phân tích 3 locus chính HLA-A, HLA-B, HLA-DRB1 với độ phân giải cao. Mức độ hòa hợp HLA được đánh giá theo số alen hòa hợp trên tổng số 6 alen (3 locus x 2 alen mỗi locus).

Phân tích số liệu sử dụng phần mềm SPSS 16, với các chỉ số nghiên cứu bao gồm đặc điểm bệnh nhân, người hiến, kết quả định nhóm HLA, mức độ hòa hợp HLA, thể tích và số lượng tế bào CD34+, tế bào có nhân trong đơn vị máu dây rốn. Tiêu chuẩn đạo đức được tuân thủ nghiêm ngặt, bảo mật thông tin và có sự đồng ý của người tham gia nghiên cứu.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Đặc điểm bệnh nhân thalassemia: Trong 80 bệnh nhân, 96,2% là beta thalassemia, 3,8% alpha thalassemia; tuổi trung bình 5,9 ± 2,4 tuổi, cân nặng trung bình 15,9 ± 5,4 kg. Dân tộc Kinh chiếm 55%, Tày 25,2%, Thái 7,5%.
2. Đặc điểm người hiến cùng huyết thống: 58 người hiến, trong đó 94,8% là thai nhi (dịch ối), 5,2% là anh/chị ruột. Trong thai nhi, 25,9% bình thường, 68,9% mang gen thalassemia. Lượng ADN tách từ dịch ối trung bình 183,1 ± 80,3 ng, độ tinh sạch 2,03 ± 0,06.
3. Đặc điểm đơn vị máu dây rốn cộng đồng: 3000 đơn vị, 55,3% nam, nhóm máu O chiếm 43,3%, RhD(+) chiếm 99,97%. Thể tích trung bình 133,7 ± 20,2 ml, số tế bào có nhân trung bình 131,5 ± 43,7 x10^7, tế bào CD34+ trung bình 46,5 ± 32 x10^5. Thể tích máu dây rốn có tương quan thuận với số lượng tế bào CD34+ (r=0,64, p<0,05) và tế bào có nhân (r=0,67, p<0,05).
4. Phân bố alen HLA:
   • Locus HLA-A: alen phổ biến nhất là A11:01 (24-25%), A02:01 (14-17%), A*24:02 (12%).
   • Locus HLA-B: alen phổ biến B15:02 (12-16%), B46:01 (11-16%), B*58:01 (7-9%).
   • Locus HLA-DRB1: alen phổ biến DRB112:02 (21-31%), DRB109:01 (8-11%), DRB1*15:02 (7-10%).
5. Mức độ hòa hợp HLA giữa bệnh nhân và người hiến cùng huyết thống: Trong 58 cặp, 36,2% có mức độ hòa hợp ≥4/6, trong đó 19% hòa hợp hoàn toàn 6/6. 55% trong số các trường hợp hòa hợp đã thu thập và lưu trữ máu dây rốn thành công.
6. Tìm kiếm người hiến không cùng huyết thống từ ngân hàng máu dây rốn cộng đồng: Trong 59 bệnh nhân cần tìm kiếm, 96,6% tìm được đơn vị máu dây rốn hòa hợp tối thiểu 4/6, 26,2% hòa hợp hoàn toàn 6/6.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ hòa hợp HLA giữa bệnh nhân và người hiến cùng huyết thống tương đương với các nghiên cứu quốc tế (khoảng 25-36%). Việc sử dụng dịch tế bào ối để xác định HLA cho thai nhi giúp sàng lọc sớm, giảm lãng phí nguồn máu dây rốn không hòa hợp, tiết kiệm chi phí và tăng hiệu quả điều trị. Phân bố alen HLA trong quần thể nghiên cứu tương đồng với các quần thể người Kinh Việt Nam, Thái Lan và Trung Quốc, khác biệt rõ rệt so với quần thể người Mỹ gốc Phi, phản ánh đặc điểm nhân chủng học vùng Đông Nam Á.

Nguồn tế bào gốc từ máu dây rốn cộng đồng có ưu điểm là dễ thu thập, sẵn có và yêu cầu hòa hợp HLA thấp hơn so với tủy xương, giúp tăng cơ hội tìm được người hiến phù hợp cho bệnh nhân không có người hiến cùng huyết thống. Mối tương quan thuận giữa thể tích máu dây rốn và số lượng tế bào CD34+ cho thấy việc thu thập máu dây rốn với thể tích lớn là yếu tố quan trọng để đảm bảo liều tế bào gốc đủ cho ghép.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ phân bố alen HLA, bảng tỷ lệ hòa hợp HLA giữa bệnh nhân và người hiến, biểu đồ tương quan thể tích máu dây rốn với số lượng tế bào CD34+ và tế bào có nhân, giúp minh họa rõ ràng các phát hiện chính.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Tăng cường sàng lọc HLA trước sinh bằng kỹ thuật PCR-SSO trên dịch tế bào ối nhằm xác định sớm mức độ hòa hợp HLA giữa thai nhi và bệnh nhân thalassemia, giúp quyết định lưu trữ máu dây rốn hợp lý, giảm lãng phí chi phí. Thời gian thực hiện: ngay trong thai kỳ, chủ thể thực hiện: các trung tâm y tế sản khoa và di truyền.
2. Mở rộng và nâng cao chất lượng Ngân hàng máu dây rốn cộng đồng để tăng số lượng và đa dạng mẫu máu dây rốn, đảm bảo khả năng tìm kiếm người hiến hòa hợp HLA cho bệnh nhân không có người hiến cùng huyết thống. Thời gian: liên tục, chủ thể: Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương và các cơ sở y tế liên quan.
3. Tuyên truyền nâng cao nhận thức cộng đồng về bệnh thalassemia và lợi ích của ghép tế bào gốc nhằm khuyến khích người dân tham gia hiến máu dây rốn và sàng lọc gen bệnh. Thời gian: dài hạn, chủ thể: Bộ Y tế, các tổ chức xã hội và truyền thông.
4. Đào tạo và nâng cao năng lực kỹ thuật cho cán bộ y tế trong lĩnh vực định nhóm HLA và ghép tế bào gốc để đảm bảo kết quả xét nghiệm chính xác, kịp thời phục vụ điều trị. Thời gian: định kỳ hàng năm, chủ thể: các viện nghiên cứu và bệnh viện chuyên khoa.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Bác sĩ và chuyên gia huyết học, di truyền học: Nắm bắt kiến thức về kỹ thuật PCR-SSO, phân tích HLA và ứng dụng trong ghép tế bào gốc điều trị thalassemia.
2. Nhân viên Ngân hàng Tế bào gốc và các trung tâm ghép tế bào gốc: Áp dụng quy trình xác định HLA và tìm kiếm người hiến phù hợp, nâng cao hiệu quả ghép.
3. Nhà nghiên cứu trong lĩnh vực di truyền miễn dịch và y sinh học: Tham khảo dữ liệu phân bố alen HLA, phương pháp nghiên cứu và kết quả thực nghiệm để phát triển nghiên cứu sâu hơn.
4. Cán bộ quản lý y tế và hoạch định chính sách: Sử dụng kết quả nghiên cứu để xây dựng chính sách phát triển ngân hàng máu dây rốn, chương trình sàng lọc trước sinh và điều trị thalassemia.

Câu hỏi thường gặp

1. PCR-SSO là gì và ưu điểm của kỹ thuật này trong định nhóm HLA?
   PCR-SSO là kỹ thuật sử dụng đoạn đầu dò đặc hiệu lai với sản phẩm PCR để xác định alen HLA với độ phân giải cao. Ưu điểm là có thể phân tích nhiều locus cùng lúc, độ chính xác cao, phù hợp với lượng ADN nhỏ như dịch tế bào ối, giúp sàng lọc HLA hiệu quả cho ghép tế bào gốc.

2. Tại sao cần xác định mức độ hòa hợp HLA trong ghép tế bào gốc?
   Hòa hợp HLA giúp giảm nguy cơ thải ghép và bệnh ghép chống chủ, tăng tỷ lệ thành công ghép. Mức độ hòa hợp tối thiểu 4/6 locus (HLA-A, B, DR) được chấp nhận cho ghép tế bào gốc từ máu dây rốn.

3. Máu dây rốn có ưu điểm gì so với nguồn tế bào gốc khác?
   Máu dây rốn dễ thu thập, không ảnh hưởng sức khỏe người hiến, tế bào gốc non trẻ, ít gây bệnh ghép chống chủ, yêu cầu hòa hợp HLA thấp hơn, phù hợp cho trẻ em và người lớn khi có liều tế bào gốc đủ.

4. Làm thế nào để tìm người hiến tế bào gốc phù hợp khi không có người hiến cùng huyết thống?
   Có thể tìm kiếm trong ngân hàng máu dây rốn cộng đồng với tỷ lệ tìm được đơn vị hòa hợp HLA tối thiểu 4/6 lên tới 96,6%, giúp mở rộng cơ hội điều trị cho bệnh nhân.

5. Tại sao việc xác định HLA trên dịch tế bào ối lại quan trọng?
   Xác định HLA trên dịch tế bào ối giúp sàng lọc sớm mức độ hòa hợp giữa thai nhi và bệnh nhân, quyết định lưu trữ máu dây rốn hợp lý, tránh lãng phí và giảm chi phí cho gia đình, đồng thời tăng hiệu quả điều trị ghép.

Kết luận

• Nghiên cứu xác định thành công mức độ hòa hợp HLA giữa bệnh nhân thalassemia và người hiến cùng huyết thống, cũng như tìm kiếm người hiến không cùng huyết thống từ ngân hàng máu dây rốn cộng đồng với tỷ lệ hòa hợp cao.
• Kỹ thuật PCR-SSO trên hệ thống Luminex cho kết quả định nhóm HLA chính xác, phù hợp với mẫu ADN từ dịch tế bào ối và máu dây rốn.
• Phân bố alen HLA trong quần thể nghiên cứu tương đồng với các quần thể Đông Nam Á, hỗ trợ việc tìm kiếm người hiến phù hợp.
• Việc xác định HLA trước sinh giúp sàng lọc sớm, giảm lãng phí và chi phí điều trị cho bệnh nhân thalassemia.
• Đề xuất mở rộng ngân hàng máu dây rốn cộng đồng, nâng cao năng lực kỹ thuật và tuyên truyền cộng đồng để nâng cao hiệu quả điều trị ghép tế bào gốc.

Next steps: Triển khai áp dụng kỹ thuật PCR-SSO trong sàng lọc trước sinh rộng rãi, phát triển ngân hàng máu dây rốn cộng đồng đa dạng, đào tạo nhân lực chuyên môn và tăng cường hợp tác nghiên cứu quốc tế.

Các cơ sở y tế, viện nghiên cứu và nhà quản lý y tế cần phối hợp thực hiện các giải pháp đề xuất nhằm nâng cao hiệu quả điều trị thalassemia bằng ghép tế bào gốc, góp phần cải thiện sức khỏe cộng đồng và giảm gánh nặng xã hội.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Thalassemia là bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường, được đặc trưng bởi sự suy giảm hoặc mất tổng hợp chuỗi globin và là bệnh di truyền phổ biến nhất Đông Nam Á và trên thế giới [14]. Theo ước tính của Liên đoàn Thalassemia Thế giới, có khoảng 7% dân số mang gen bệnh thalassemia và hàng năm có khoảng 300.000 trẻ sinh ra bị bệnh thalassemia mức độ nặng [58]. Ở Thái Lan tỷ lệ người mang gen α-thalassemia là 14%, β-thalassemia từ 3-9%, HbE là 13%. Với 1% dân số mang gen thì hàng năm có khoảng 12.000 trẻ sinh ra mắc căn bệnh này [68].

Cũng theo ước tính trên, tại Việt Nam có khoảng 10% dân số mang gen bệnh này và mỗi năm có 20.000 đứa trẻ sinh ra bị bệnh thalassemia [16]. Người bệnh thalassemia phải điều trị thường xuyên bằng truyền máu, thải sắt và điều trị các biến chứng. Chi phí điều trị bệnh thalassemia lớn làm kinh tế gia đình suy giảm, bệnh nhân trở thành gánh nặng cho xã hội và ảnh hưởng tới chất lượng giống nòi. Hiện nay với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, tiến bộ của các phương pháp điều trị giúp cải thiện sức khỏe cho bệnh nhân thalassemia.

G ện nay đượ halassemia [76]. Đặc biệt số ca ghép tế bào gốc lấy nguồn từ anh/chị em ruột ngày càng tăng và cho kết quả cải thiện đáng kể trong ba thập kỷ qua [75, 76]. Việc ghép thành công tế bào gốc đòi hỏi cần phải có nguồn cho tế bào gốc hòa hợp kháng nguyên bạch cầu người (HLA-Human leukocyte antigen). Các locus thường sử dụng để xác định sự hòa hợp trong ghép tế bào gốc đồng loài bao gồm các locus quy định HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1 và HLA-DQB1, trong đó yêu cầu hòa hợp HLA đối với nguồn tế bào gốc là máu dây rốn chỉ cần tối thiểu 4/6 locus HLA-A, HLA-B, HLA-DR ở độ phân giải cao [39].

Khả năng hòa hợp HLA của người nhận với người cho cùng huyết thống cao hơn so với người trong cộng đồng [75, 76]. Trong gia đình càng có nhiều ngườ ợc người cho hòa hợp ỷ lệ ghép thành công càng lớ Tuy nhiên, đối với những trường hợp bệnh nhân không có anh/chị/em ruột hòa hợp HLA để hiến tế bào gốc thì cơ hội Luận văn thạc sĩ khoa học 2015 - 2017 1 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Lê Xuân Thịnh K24 - Sinh học điều trị ghép gần như không còn. Để giải quyết khó khăn này, nhiều trung tâm lớn trên Thế giới cũng như tại Việt Nam, Ngân hàng Tế bào gốc của Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương đã triển khai xây dựng Ngân hàng máu dây rốn cộng đồng [11]. Nguồn tế bào gốc này có một số ưu điểm nổi bật như sẵn có, thu thập dễ dàng, không ảnh hưởng đến sức khỏe của người hiến và đặc biệt là yêu cầu về hòa hợp HLA giữa người hiến và bệnh nhân không cao.

Chính vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu xác định hòa hợp HLA giữa bệnh nhân và ngƣời hiến bằng kỹ thuật PCR-SSO để định hƣớng ghép tế bào gốc trong điều trị bệnh thalassemia” với 2 mục tiêu: 1. Xác định được HLA của bệnh nhân thalassemia và người hiến tế bào gốc bằng kỹ thuật RCR-SSO. Đánh giá được mức độ hòa hợp HLA của bệnh nhân thalassemia và người hiến để định hướng ghép tế bào gốc. Nội dung nghiên cứu gồm: ‐ Xác định HLA của bệnh nhân thalassemia có chỉ định ghép tế bào gốc và người hiến cùng huyết thống; ‐ Đánh giá mức độ hòa hợp HLA của bệnh nhân có người hiến cùng huyết thống với người hiến và của bệnh nhân không có người hiến cùng huyết thống với các đơn vị máu dây rốn cộng đồng.

Luận văn thạc sĩ khoa học 2015 - 2017 2 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Lê Xuân Thịnh K24 - Sinh học Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Kháng nguyên hệ bạch cầu ngƣời 1. Khái niệm human leukocyte antigen HLA (Human Leucocyte Antigen) là tên gọi tắt quốc tế của kháng nguyên bạch cầu người. Việc khám phá ra phức hợp hòa hợp mô chủ yếu (Major Histocompatibility Complex - MHC) và vai trò của nó trong thải ghép, đáp ứng miễn dịch và cơ sở di truyền bệnh dẫn đến sự ra đời của một lĩnh vực khoa học mới là di truyền miễn dịch [60].

Đây là lĩnh vực quan trọng không chỉ trong nghiên cứu y sinh học cơ bản mà còn trong y học lâm sàng. Phức hợp hòa hợp mô chủ yếu ở người là hệ thống kháng nguyên bạch cầu người được quy định bởi vùng gen nằm trên cánh ngắn nhiễm sắc thể số 6 (6p21) [61, 62]. HLA lần đầu tiên được phát hiện trên bề mặt tế bào bạch cầu nhờ vai trò trong thải ghép [71]. Hiện nay khoa học đã chứng minh các protein của hệ thống gen HLA hiện diện trên bề mặt tế bào của đa số động vật có xương sống, kháng nguyên HLA tham gia vào nhiều công đoạn trong nhận diện miễn dịch bao gồm tương tác giữa các tế bào lympho khác nhau cũng như giữa các tế bào lympho với các tế bào trình diện kháng nguyên [60].

Do vậy, việc xác định các kháng nguyên HLA hay định nhóm HLA (HLA typing) còn được gọi là định nhóm mô (tissue typing) [56]. Danh pháp Theo Marsh SG và cộng sự (2010) danh pháp HLA như sau [69]: Tên gen + dấu * + mã số alen + dấu : + mã số protein HLA riêng + dấu : + mã số ADN tương ứng trong vùng mã hóa + dấu : + mã số ADN ngoài vùng mã hóa + Hậu tố: - Hậu tố N: alen không được biểu hiện (Null); - Hậu tố L: alen của protein biểu hiện ở bề mặt tế bào thấp hơn bình thường (Low); - Hậu tố S: alen của protein tan nhanh nhưng không biểu hiện trên bề mặt tế bào (Secret); Luận văn thạc sĩ khoa học 2015 - 2017 3 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Lê Xuân Thịnh K24 - Sinh học - Hậu tố C: alen của protein ở trong tế bào chất chứ không ở bề mặt tế bào (Cytoplasm); - Hậu tố A: khi nghi ngờ protein có được biểu hiện không (Aberrant); - Hậu tố Q: alen có đột biến trước đó đã được chứng minh là có ảnh hưởng đến việc biểu hiện trên tế bào nhưng chưa được xác nhận vị trí và vẫn còn nghi vấn (Questionable). Cấu trúc tên HLA [69] Ví dụ: Khi viết alen HLA-A*11:01 thì có nghĩa là: locus HLA-A, alen 11, protetin 01. Hệ thống HLA Dựa trên cấu trúc và chức năng, các kháng nguyên HLA được chia thành hai lớp: HLA lớp I và HLA lớp II (Hình1.

Kích thước tổng thể của hệ thống gen HLA là khoảng 3,5 triệu cặp bazơ niơ [62]. Trong đó, vùng gen HLA lớp I và lớp II chiếm khoảng 1/3 mỗi loại. Phần còn lại là vùng gen HLA lớp III mã hóa bổ thể, hormon, xử lý peptide nội bào và một số chức năng khác. Do đó, vùng gen HLA lớp III không thực sự là một phần của hệ thống HLA, nhưng chúng nằm trong khu vực HLA và có liên quan đến các chức năng của kháng nguyên HLA hoặc có cơ chế kiểm soát tương tự như các gen HLA [60].

Cho tới nay, người ta đã biết khoảng 17330 alen của hệ thống HLA, các alen này tạo ra kháng nguyên và phát hiện được bằng kháng thể đặc hiệu. Luận văn thạc sĩ khoa học 2015 - 2017 4 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Lê Xuân Thịnh K24 - Sinh học Bảng 1.1: Số alen HLA phát hiện được (2017) + Loci A có 3997 alen + Loci DR có 2395 alen + Loci B có 4859 alen + Loci DP có 942 alen + Loci C có 3605 alen + Loci DQ có 1152 alen Hệ thống HLA chia làm 3 lớp: Lớp I, II, III (Class I, Class II, Class III). Class I: Có các nhóm (loci): ký hiệu là A, B, C, E, F, G, J… trong đó A, B, C có vai trò quan trọng trong chức năng của lớp I. Class II: Có các nhóm DR, DQ, DN, DN, DP.

Trong đó, DR, DQ có vai trò quan trọng trong chức năng của lớp II. Class III: Vùng của các thành phần tế bào và bổ thể: C2, C4, Bf, TNF α, TNF β. Bản đồ vùng gen mã hoá HLA [69]  HLA lớp I HLA lớp I gồm 3 locus chính là HLA-A, B, C, mã hóa cho các glycopeptide, chúng biểu hiện trên bề mặt của hầu hết các tế bào có nhân của cơ thể. Ngoài ra, chúng được tìm thấy ở dạng hòa tan trong huyết tương và được hấp phụ lên bề mặt của tiểu cầu.

Hồng cầu cũng hấp phụ kháng nguyên HLA lớp I ở mức độ khác nhau tùy thuộc vào đặc trưng (ví dụ như HLA-B7, A28 và B57 được nhận biết trên hồng cầu còn được gọi là kháng nguyên "Bg"). Các nghiên cứu miễn dịch học chỉ ra rằng HLA-B có tính đa hình cao nhất và cũng là locus HLA lớp I có vai trò quan trọng Luận văn thạc sĩ khoa học 2015 - 2017 5 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Lê Xuân Thịnh K24 - Sinh học nhất, tiếp theo là HLA-A và sau đó HLA-C. Ngoài ra, HLA lớp I còn có các locus khác như HLA-E, F, G, H, J, K và L nhưng hầu hết trong số này không có vai trò trong "trình diện peptide" [56]. Các kháng nguyên HLA lớp I bao gồm một chuỗi nặng glycopeptide xuyên màng (45 kDa) với ba domain (α1, α2, α3), liên kết không đồng hóa trị với một chuỗi nhẹ ngoại màng β2-microglobulin (12 kDa, mã hóa bởi một gen ngoài hệ thống HLA, không có tính đa hình) đóng một vai trò quan trọng trong việc hỗ trợ cấu trúc của chuỗi nặng.

Các phân tử HLA lớp I được tổng hợp bên trong tế bào và cuối cùng định vị trên bề mặt tế bào với một phần ở lớp lipid kép của màng tế bào và có một phần đuôi ngắn nằm trong tế bào chất [71]. Về mặt cấu trúc không gian, phân tử HLA lớp I tạo ra một khe có thể chứa được một peptide dài 9 axit amin. Do sự đa hình của các locus lớp I, nhất là vùng mã hóa domain α1 và α2, số peptide có thể tổ hợp được rất đa dạng lên tới 1011 [60]. Phần ngoài màng Hình 1.

Cấu trúc phân tử HLA lớp I và lớp II [69] Trong thực tế, nếu một tế bào bị nhiễm virus, các protein trong tế bào sẽ “cắt xén” virus thành các peptide nhỏ, sau đó những peptide được gắn vào khe liên kết của các phân tử HLA lớp I. Vai trò của các phân tử HLA lớp I là trình diện những mảnh peptide (kháng nguyên) này trên bề mặt tế bào nhiễm cho tế bào T CD8 trong các Luận văn thạc sĩ khoa học 2015 - 2017 6 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.