MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn dề Ung thƣ là một loại bệnh nguy hiểm và đang có xu hƣớng tăng cao về tỉ lệ tử vong tại nhiều nƣớc theo thống kê của trang Global Cancer Obsevatory năm 2020. Theo Bộ Y Tế về tình hình ung thƣ tại Việt Nam năm 2021, theo đó nƣớc ta cũng là một trong những nƣớc có tỷ lệ ngƣời mắc ung thƣ cao trên thế giới và đang có xu hƣớng gia tăng. Bởi vậy, việc nghiên cứu các loại thuốc chống ung thƣ luôn là những đề tài đƣợc tập trung và đầu tƣ.
Podophyllotoxin là một chất hóa học đƣợc sử dụng làm tiền chất để tổng hợp thuốc chống ung thƣ etoposide và teniposide (Canel C và cộng sự, 2001; Stahelin và cộng sự, 1991). Podophyllotoxin hiện đƣợc thu nhận chủ yếu từ một số cây thuộc chi Podophyllum (Podophyllum hexandrum), cây Táo ma (Podophyllum peltatum) hay một số cây thuộc chi Juniperus nhƣ Juniperus sabina, Juniperus thurifera, Juniperus chinensis.), và một số loài thuộc chi Linum (Xiang và cộng sự, 2017). Mặc dù podophyllotoxin đƣợc khai thác nhiều ở thực vật nhƣng việc sản xuất podophyllotoxin từ các loài thực vật này đã mang lại hàm lƣợng thu hồi ít, quá trình thu hồi phức tạp và không hiệu quả. Các nhà khoa học đã hƣớng đến một con đƣờng khai thác podophyllotoxin khác, đó là từ vi nấm nội sinh trong chính loài thực vật đó.
Trong quá trình kết hợp lâu dài của vi nấm nội sinh và thực vật chủ, vi nấm đã thích nghi với môi trƣờng bên trong các mô thực vật bằng nhiều cách khác nhau và trong đó có sự biến đổi gen, bao gồm cả sự thu nhận DNA của thực vật chủ vào bộ gen của chúng (Germaine và cộng sự, 2004). Điều này có thể dẫn đến khả năng của một số vi nấm nội sinh nhất định để sinh tổng hợp một số chất ban đầu liên quan đến vật chủ thực vật (Stierle và cộng sự, 1993). Do đó, dựa trên các cơ sở khoa học, các nhà khoa học đã thực hiện khai thác podophyllotoxin ở vi nấm nội sinh trong chính các loài thực vật đó. Việc này đã mở ra một con đƣờng, một hƣớng nghiên cứu mới để nâng cao đƣợc 1 năng suất khi thu hồi podophyllotoxin phục vụ cho quá trình sản xuất thuốc chống ung thƣ trong tƣơng lai.
Tính mới của đề tài Nghiên cứu in silico và biểu hiện enzyme khử phenylcoumaran benzylic ether dự đoán liên quan đến con đƣờng sinh tổng hợp podophyllotoxin ở vi nấm nội sinh trong cây Dysosma difformis. Mục đích và yêu cầu - Mục đích: Phân lập đƣợc gen PCBER-SDR từ chủng vi nấm nội sinh Penicillium và thiết kế đƣợc vector mang gen PCBER-SDR mã hóa sinh enzyme khử phenylcoumaran benzylic ether đồng thời kiểm tra đƣợc các mức độ biểu hiện ở vi khuẩn E. - Yêu cầu: i) Tách chiết RNA và DNA tổng số của chủng vi nấm nội sinh Penicillium herquei. ii) Phân lập gen PCBER-SDR và đọc trình tự gen phân lập từ DNA tổng số và cDNA đƣợc nhân dòng.
iii) Thiết kế các cấu trúc vector tách dòng và vector biểu hiện mang gen PCBER-SDR mã hóa sinh enzyme khử phenylcoumaran benzylic ether. iv) Kiểm tra biểu hiện gen PCBER-SDR trên vi khuẩn E. 2 CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Podophyllotoxin Podophyllotoxin là một lignan loại aryltetralin có nguồn gốc từ thực vật, đƣợc phân lập chủ yếu từ rễ và thân của một số loài thuộc chi Podophyllum (Gordaliza M.
và cộng sự, 2004). Theo Hartwell JL và cộng sự năm 1951, hai nguồn phổ biến đƣợc phân lập là thân rễ của Podophyllum peltatum (thuộc họ Dứa Mỹ) và Podophyllum hexandrum Royle (họ Barberry). Đặc biệt, Podophyllum hexandrum Royle đƣợc công nhận là có chứa lƣợng podophyllotoxin cao hơn (4.3%) so với các loài thực vật có khả năng sinh podophyllotoxin khác (Kumar P và cộng sự, 2015). Podophyllotoxin còn đƣợc sử dụng làm thuốc hay còn đƣợc gọi là podofilox, là một loại kem y tế đƣợc sử dụng để điều trị mụn cóc sinh dục.
Ngoài ra, một số chiết xuất của podophyllotoxin còn đƣợc sử dụng nhƣ một loại thuốc nhuận tràng. Cùng với đó, một số thuốc khác cũng có chiết xuất từ podophyllotoxin đƣợc dùng để chữa trị các bệnh nhƣ bệnh lậu, bệnh lao, rối loạn kinh nguyệt…. Podophyllotoxin đƣợc sử dụng làm tiền chất để tổng hợp thuốc chống ung thƣ etoposide và teniposide (Canel C và cộng sự, 2001; Stahelin và cộng sự, 1991). Vào cuối năm 2010, các nhà nghiên cứu đã phân lập đƣợc podophyllotoxin từ các loài thực vật khác nhau nhƣ các cây thuộc chi Podophyllum (cây táo ma), chi Juniperus (nhƣ Juniperus sabina, Juniperus thuifera,…) và một số loài thuộc chi Linum (Xiang và cộng sự, 2017).
Cấu trúc hóa học của Podophyllotoxin (Wikipedia) Liên quan đến hoạt tính sinh học, khả năng gây độc tế bào của podophyllotoxin hoạt động nhƣ một chất ức chế lắp rắp các vi ống. Podophyllotoxin đƣợc chứng minh qua nhiều bài báo khoa học về khả năng kiềm hãm hay ức chế cho nhiều bệnh ung thƣ nhƣ ung thƣ phổi, u tinh hoàn, u nguyên bào thần kinh, u gan và các khối u khác (Cannel và cộng sự, 2000 và Liu và cộng sự, 2015). Điển hình nhƣ nghiên cứu của Sheng và cộng sự năm 2015, họ đã chứng minh tác dụng chống ung thƣ của deoxypodophyllotoxin đối với tế bào Pca ngƣời DU-145 (tế bào ung thƣ tuyến tiền liệt). Báo cáo cho thấy deoxypodophillotoxin đã làm giảm đáng kể sự gia tăng của tế bào và kích hoạt mức biểu hiện của caspase-3 (một protease tham gia vào quá trình phân hủy DNA) do sự gia tăng chết tế bào theo chƣơng trình (apoptosis) trong các tế bào DU-145.
Ngoài ra, việc điều trị với DPPT còn làm giảm đáng kể mức phosphoryl hóa Akt và kích hoạt động dẫn tín hiệu XEN (Bax)/phosphatase và Tensin homolog (PTEN) trong các tế bào DU-145 (Sheng và cộng sự, 2016). Ngoài ra từ podophyllotoxin, các nhà khoa học đã thực hiện cải tiến cấu trúc và tạo ra hàng loạt các chất có hoạt tính tốt trên lâm sàng nhƣ etoposid, teniposid. Etoposid là một chất chống ung thƣ hiệu quả và đƣợc sử dụng trong lâm sàng để điều trị ung thƣ phổi tế bào nhỏ, ung thƣ tinh hoàn và ung thƣ biểu mô lympho, thƣờng sử dụng trong các liệu pháp kết hợp với các thuốc chống ung thƣ khác. Về teniposid, Bedows và Hatfield đã chỉ ra rằng teniposid có đặc tính chống ung thƣ tƣơng tự etoposid, có vai trò quan trọng trong điều trị bệnh thần kinh ở trẻ 4 em (Paul, 2022).
Teniposide là một loại thuốc hóa trị đƣợc sử dụng trong điều trị bệnh bạch cầu tăng tế bào lympho cấp tính ở trẻ em, ung thƣ hạch Hodgkin, các loại khối u não và một số ung thƣ khác (Jasek và cộng sự, 2007). Bên cạnh đó, podophyllptoxin cũng cho thấy các hoạt động chống virus bằng cách can thiệp vào một số hoạt động nhân bản virus quan trọng. Ngoài ra, một số dẫn xuất podophyllotoxin từ dịch chiết của một số loài Dysosma cho thấy sự ức chế sự sao chép của HIV do ức chế virus của podophyllotoxin, α – peltatin, và diphyllin trên cytomegalovirus murin (MCMV, virus ADN) và virus Sindbis (virus ARN). Castro cùng cộng sự đã tổng hợp một số dẫn xuất podophyllotoxin các chất tạo ra, có hai dẫn xuất của podophyllotoxin có hoạt tính cao ở hàm lƣợng 23 và 25 µg/ml.
Dƣới đây là bảng 1 nhằm chỉ ra nguồn cung cấp podophyllotoxin ở các loại cây điển hình. Các loại cây là nguồn cung cấp Podophyllotoxin Loài thực vật Cung cấp Podophyllotoxin Nguồn tham khảo Họ Hoa tán (Apiaceae); Deoxy podorhizone và Rollinger J.M và cộng Chaerophyllum aurium deoxypodophyllotoxin sự, 2003 Họ Ô rô (Acanthaceae); Al-Juaid S.S và cộng sự, Podophyllotoxin lignan Justicia heterocarpa 2004 Họ Bìm bìm (Berberidaceae); Podophyllotoxin, kaempferol Jeffersonia diphylla, Yu P.Z và cộng sự, và quercetin, các dẫn xuất Dysosma pleiantha, 1991; Bedir E và cộng của podophyllotoxin, 4- Dysosma sự, 2002 demethylisopodophyllotoxin versipellis var. tomentosa , Dysosma versipellis Họ Bìm bìm Các dẫn xuất của Wickramaratne D.M (Burseraceae); podophyllotoxin, và cộng sự, 1995; 5 Loài thực vật Cung cấp Podophyllotoxin Nguồn tham khảo C. incisa Deoxypodophyllotoxin, 4- Jutiviboonsuk A và cộng B.
permollis demethyldeoxypodophylloto sự, 2005; Bianchi E và B. fagaroides xin cộng sự, 1968 B. konkinensis Thuộc họ Dâu tằm Podophyllotoxin và các dẫn Feliciano A.S và cộng (Broginaceae); xuất sự, 1989 L. erythrorhizon Họ Hoa tán (Cupressaceae); Hartwell J.L và cộng sự, Podophyllotoxin và các dẫn J.L và xuất, Deoxypodophyllotoxin, J.
virginia cộng sự, 2013; Renouard 5-methoxypodophyllotoxin J. conferta S và cộng sự, 2015 C. perenne Podophyllotoxin, các dẫn Doussot J và cộng sự, L. scabrellum xuất của podophyllotoxin, 5- 2017; Mikac S và cộng L.
methoxypodophyllotoxin, 6- sự, 2021; Broomhead L.J và cộng sự, 1990 L. Các vi nấm nội sinh sinh hoạt chất Podophyllotoxin Trong các loài thực vật luôn tồn tại hệ thống vi sinh vật, hệ thống đó thƣờng đƣợc gọi là endophytes (vi nấm nội sinh) (Schulz và cộng sự, 2002; Strobel và cộng sự, 2004 ). Vi nấm nội sinh tồn tại rộng rãi bên trong các mô khỏe mạnh của thực vật sống, chúng có thể dành toàn bộ vòng đời cho các cây 6 ký chủ và là thành phần quan trọng của hệ sinh thái vi sinh vật. Trong suốt thời gian dài tiến hóa, một số vi nấm cùng tồn tại và các cây chủ của chúng đã thiết lập một mối quan hệ đặc biệt với nhau và các chất trao đổi đƣợc tạo ra từ vi nấm nội sinh có thể bị ảnh hƣởng bởi thực vật chủ và tƣơng tự, vi nấm cũng có thể ảnh hƣởng đáng kể đến sự hình thành các sản phẩm trao đổi chất trong thực vật (Kusari và cộng sự, 2012).
Sự liên kết giữa thực vật và vi nấm nội sinh cũng có thể điều chỉnh việc sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp trong cây thực vật chủ. Các chất chuyển hóa thứ cấp đƣợc phân lập từ vi nấm nội sinh cũng thể hiện đƣợc một loạt các đặc tính dƣợc lý bao gồm hoạt tính chống ung thƣ, kháng vi- rút, kháng khuẩn và kháng nấm (Jalgaonwala và cộng sự, 2017). Việc sản xuất podophyllotoxin của các chủng vi nấm nội sinh hỗ trợ cho lý thuyết rằng trong quá trình kết hợp lâu dài của vi nấm nội sinh với thực vật chủ, chúng thích nghi với môi trƣờng bên trong các mô thực vật bằng cách nhiều cách bao gồm cả sự biến đổi gen, sự thu nhận DNA của thực vật chủ vào bộ gen của chúng (Germaine và cộng sự, 2004). Điều này có thể đã dẫn đến dự đoán rằng một số vi nấm nội sinh nhất định có thể có khả năng sinh tổng hợp các loại chất ban đầu liên quan đến thực vật chủ (Stierle và cộng sự, 1993).
Do vậy, việc nghiên cứu phân lập các chủng vi nấm nội sinh trong thực vật có khả năng sản sinh hoạt chất podophyllotoxin có cơ sở khoa học và hiện đƣợc các nhà khoa học ngày càng quan tâm nhằm tạo nguồn sản xuất podophyllotoxin cho các ngành công nghiệp dƣợc.