MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Cellulase là nhóm enzyme được sử dụng phổ biến trong các ngành công nghiệp như chế biến thực phẩm, chế biến thức ăn, sản xuất giấy, sản xuất rượu, sản xuất bia, công nghệ dệt…. Đặc biệt, cellulase đang được quan tâm nghiên cứu ứng dụng trong sản xuất nhiên liệu sinh học [8] như cồn sinh học từ nguồn phế phẩm lignocellulose dồi dào thay thế cho nguồn nhiên liệu hóa thạch đang trên đà cạn kiệt. Trong vòng hơn 25 năm qua, sản lượng cồn sinh học đã tăng trưởng và đạt mức nhảy vọt kể từ năm 2000.
Cồn sinh học có thể được dùng như nguồn nhiên liệu độc lập cho các loại xe có động cơ chuyên biệt hoặc làm phụ gia nhiên liệu cho loại xe có động cơ truyền thống với tỉ lệ lên đến 30% [126]. Ở nước ta, ước tính hàng năm, nguồn nguyên liệu lignocellulose từ phế phẩm nông nghiệp như rơm, rạ, lá mía và bã cây mía bỏ phí lên đến 50 triệu tấn. Biện pháp xử lý nguồn phế phẩm này chủ yếu là đốt đã gây ra những ảnh hưởng tiêu cực đến môi trường sống và sức khoẻ con người [32, 135]. Việc tận dụng được nguồn nguyên vật liệu lignocellulose phế phẩm này vào sản xuất cồn sinh học sẽ đem đến nhiều lợi ích to lớn cho môi trường cũng như cho nền kinh tế của nước ta.
Việc sử dụng cellulase thay thế các hóa chất truyền thống như axit, kiềm và nhiệt độ cao vào trong quá trình sản xuất của các ngành công nghiệp đã giải quyết được nhiều vấn đề như hạn chế ô nhiễm môi trường, tiết kiệm năng lượng và bảo vệ được sức khoẻ người lao động cũng như tăng hiệu quả sản xuất. Tuy nhiên, vấn đề đặt ra là cần thiết phải có được nguồn cellulase hoạt động ở điều kiện pH và nhiệt độ thích hợp cho các quá trình sản xuất đó [95]. Hơn nữa, việc sản xuất cồn sinh học đang gặp một số khó khăn trong việc giảm chi phí sản xuất đặc biệt là nguồn cellulase để phân cắt cellulose thành glucose hiệu quả [62, 154]. Do đó, vấn đề quan trọng nhất là tìm ra được nguồn cellulase mới phù hợp với điều kiện sản xuất của các ngành công nghiệp liên quan, phát triển các phức hợp cellulase hiệu quả và ổn định để khắc phục khó khăn trong quá trình sản xuất.
Metagenomics là kỹ thuật cho phép thu nhận trực tiếp DNA đa hệ gen của toàn bộ các vi sinh vật trong môi trường sống nhất định [44, 121]. Chính vì lợi thế 18 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com là thu nhận và phân tích được tất cả hệ gen của vi sinh vật phong phú và đa dạng, đặc biệt là 99% vi sinh vật chưa nuôi cấy được [4] mà Metagenomics trở thành công cụ giúp các nhà nghiên cứu khai thác nguồn gen mới hiệu quả nhất. Thực tế đã chứng minh, sau 20 năm phát triển, đặc biệt là khoảng 5 năm gần đây, khi kỹ thuật giải mã gen thế hệ mới được áp dụng, Metagenomics đã được sử dụng rất hiệu quả để tìm hiểu sự đa dạng vi sinh vật cũng như khai thác các gen mới từ nhiều môi trường sống khác nhau như nước, đất, sinh vật (các đường tiêu hóa), phế thải, … Mối đóng một vai trò quan trọng đối với hệ sinh thái bởi khả năng phân hủy sinh khối lignocellulose và góp phần vào chu trình carbon. Khả năng phân hủy hiệu quả lignocellulose của mối là kết quả hoạt động tổng hợp của cellulase và hemicellulase được tiết ra từ bản thân mối và từ vi sinh vật sống trong ruột mối.
Trong đó, hệ vi sinh vật ruột mối đóng vai trò quan trọng trong việc tiêu hóa hiệu quả nguồn thức ăn lignocellulose của mối [16, 68]. Vì vậy, vi sinh vật ruột mối mang nguồn gen mã hóa enzyme phong phú cần được khai thác nhằm tìm ra các cellulase mới liên quan đến sự phân hủy cellulose. Ở Việt Nam, cho đến nay, hơn 100 loài mối khác nhau đã được mô tả [1, 45]. Tuy nhiên, hệ vi sinh vật của chúng vẫn chưa được nghiên cứu.
Vì thế toàn bộ hệ enzyme thủy phân lignocellulose có nguồn gốc từ vi sinh vật trong ruột mối cũng chưa được điều tra và khảo sát. Với đặc điểm đặc trưng của quần xã vi sinh vật sống trong ruột mối và vai trò của chúng giúp vật chủ phân hủy thức ăn, quần xã vi sinh vật ở mối bậc thấp được xem là nguồn khai thác gen cellulase mới lý tưởng sử dụng trong quá trình thủy phân cellusose. Mặc dù, trên thế giới cũng đã có nhiều nghiên cứu về gen cellulase của vi sinh vật ruột mối bậc thấp, nhưng tất cả đều tập trung nghiên cứu sự đa dạng của động vật nguyên sinh và nguồn gen của chúng, rất ít nghiên cứu nào đánh giá sự đa dạng của vi khuẩn cũng như sự đa dạng gen cellulase của chúng ở môi trường ruột mối bậc thấp. Chính vì vậy, bằng kỹ thuật Metagenomics với hướng tiếp cận là giải trình tự đa hệ gen, chúng tôi lựa chọn đối tượng là vi khuẩn ruột mối bậc thấp thuộc chi Coptotermes để thực hiện đề tài “Nghiên cứu gen mã hóa enzyme tham gia thủy phân cellulose từ khu hệ vi khuẩn ruột mối bằng kỹ thuật Metagenomics”.
19 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Mục tiêu của đề tài Phân lập, tách dòng và biểu hiện được 1 gen mã hóa cellulase từ DNA đa hệ gen vi khuẩn ruột mối bằng kỹ thuật Metagenomics. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu Đối tượng là vi khuẩn ruột mối thuộc chi Coptotermes. Mối do Viện Sinh thái và Bảo vệ công trình cung cấp.
Nội dung nghiên cứu (1) Tách chiết DNA đa hệ gen của vi khuẩn ruột mối Coptotermes. (2) Giải trình tự và xử lý trình tự DNA đa hệ gen. (3) Từ bộ dữ liệu trình tự DNA đa hệ gen, dự đoán gen và chú thích gen theo hai khía cạnh là đa dạng sinh vật và chức năng. (4) Chọn 1 trình tự gen để thiết kế mồi, phân lập, tách dòng và biểu hiện.
(5) Xác định đặc điểm của sản phẩm biểu hiện gen phân lập được. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án Ý nghĩa khoa học (1) Đã phân lập, tách dòng và biểu hiện được 1 gen mã hóa endoglucanase từ DNA đa hệ gen của vi khuẩn ruột mối Coptotermes gestroi. (2) Đã đánh giá được sự đa dạng vi khuẩn và đa đạng gen cellulase của vi khuẩn sống trong ruột mối C. gestroi ở Việt Nam.
Ý nghĩa thực tiễn Góp phần đánh giá tiềm năng và khả năng sử dụng nguồn gen mã hóa endoglucanase từ vi khuẩn ruột mối C. gestroi ở Việt Nam vào quá trình phân giải cơ chất cellulose thuộc một số lĩnh vực trong các ngành công nghiệp. Đóng góp mới của đề tài (1) Đây là nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam ứng dụng kỹ thuật Metagenomics để tìm hiểu sự đa dạng vi khuẩn trong ruột mối Coptotermes và bước đầu phân lập được gen mã hóa protein có hoạt tính endoglucanase từ DNA đa hệ gen vi khuẩn ruột mối C. 20 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chƣơng 1.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ LIGNOCELLULOSE Lignocellulose là thành phần chính có trong gỗ và phế phụ phẩm nông nghiệp như rơm rạ, vỏ trấu, lõi ngô, cỏ kê. Lignocellulose cấu tạo chủ yếu từ 3 thành phần cơ bản là cellulose, hemicellulose và lignin [103, 107] (Bảng 1. Thực Sợi to vật Tế bào sợi nhỏ Thành tế bào Cellulose tinh thể Hình 1.
Cấu trúc của lignocellulose [107]. Cellulose là thành phần chiếm tỷ lệ cao nhất, được cấu tạo từ các phân tử glucose. Hemicellulose được cấu tạo từ các đơn phân là đường 5 và 6 carbon như arabinose, galactose, glucose, mannose và xylose. Lignin được cấu tạo từ 3 thành phần chính là p-coumaryl alcohol (H), coniferyl alcohol (G) và sinapyl alcohol (S).
21 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Các thành phần này polyme hóa để tổng hợp lignin và tỷ lệ của chúng khác nhau ở các thực vật khác nhau. Tỷ lệ của cellulose, hemicellulose và lignin trong sinh khối lignocellulose [123]. Nguồn lignocellulose Cellulose (%) Hemicellulose (%) Lignin (%) Gỗ cứng 40-55 24-40 18-25 Gỗ mềm 45-50 25-35 25-35 Vỏ hạt 25-30 25-30 30-40 Lõi bắp ngô 45 35 15 Cỏ 25-40 35-50 10-30 Rơm lúa mì 30 50 15 Rơm lúa 32,1 24 18 Lá 15-20 80-85 0 1. Cellulose Cellulose là một hợp chất hữu cơ có ở tất các cả các loài thực vật và một số loài động vật nguyên sinh, một số động vật biển, vi khuẩn và nấm [118], đặc biệt, ở thực vật, cellulose là phần cấu tạo chính [105, 120].
Do đó, cellulose được xem là hợp chất hữu cơ tự nhiên có mặt nhiều nhất trên trái đất [32, 118]. Ước tính, mỗi năm, trên toàn thế giới có khoảng 1014 kg (khoảng 100.000 tỷ tấn) cellulose được tạo ra [105]. Cấu trúc cơ bản của cellulose là các sợi nhỏ. Mỗi sợi nhỏ gồm nhiều chuỗi polysaccharide không phân nhánh xếp song song và liên kết với nhau bằng liên kết hydro [105, 118].
Trong đó, mỗi chuỗi polysaccharide được cấu tạo từ các đơn phân là D-glucopyranose (hay còn gọi là D-glucose). Các đơn phân nối với nhau bằng liên kết β-1,4-glycoside (Hình 1. Ở mỗi chuỗi đều có một đầu không khử mang cấu trúc vòng khép kín và một đầu khử mang một cấu trúc aldehyde béo (Hình 1.2) tạo nên chuỗi cellulose có tính phân cực. Chính vì vậy, chuỗi cellulose có thể thêm các đơn phân glucose mới để kéo dài chuỗi từ đầu không khử [28].
Mỗi chuỗi cellulose đều có vùng tinh thể và vùng vô định hình (Hình 1. Trong đó, vùng tinh 22 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com thể được tạo thành nhờ các liên kết β-1,4-glycoside trong mỗi chuỗi polysaccharide, các liên kết hydro và lực Van der Waal giữa các chuỗi polysaccharide cũng như giữa các sợi nhỏ ở cạnh nhau. Các liên kết này giúp cho cấu trúc tinh thể rất ổn định, vững chắc và bền nhiệt nên không một loại enzyme nào cũng như nước có thể xâm nhập vào cellulose [28, 33, 105, 118]. Còn vùng vô định hình thì ngược lại, các liên kết trên bị phá vỡ nên các phân tử kết hợp không chặt chẽ.
Tuy nhiên, các chuỗi polysacharide ở vùng này được bố trí xoắn so le nên cùng với vùng tinh thể tạo thành một cấu trúc cellulose tổng thể rất vững chắc [33]. Cellulose vô Cellulose Cellulose vô định hình tinh thể định hình Đầu không khử, hình thành Đầu khử, C1 tự do liên kết glycoside ở C1 Hình 1. Cấu trúc tinh thể và vô định hình của cellulose. Cấu trúc tinh thể được ổn định nhờ các liên kết hydro và lực Van der Waal, trong vùng cấu trúc vô định hình các chuỗi polysaccharide xoắn làm thay đổi sự sắp xếp có trật tự trong cấu trúc [33].