Luận án tiến sĩ hus nghiên cứu gen mã hóa enzyme tham gia thủy phân cellulose từ khu hệ vi khuẩn ruột mối bằng kỹ thuật metagenomics

Luận án tiến sĩ kỹ thuật phân tích hus nghiên cứu gen mã hóa enzyme tham gia thủy phân cellulose từ khu hệ vi khuẩn ruột mối bằng kỹ, xây dựng cơ sở lý luận, kiểm chứng thực

• Tác giả: Nguyễn Thị Thảo
• Người hướng dẫn: TS. Trương Nam Hải
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Nghiên cứu gen mã hóa enzyme tham gia thủy phân cellulose từ khu hệ vi khuẩn trong ruột mối bằng kỹ thuật metagenomics
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• MỞ ĐẦU
• 0.1. Tính cấp thiết của đề tài
• 0.2. Mục tiêu của đề tài
• 0.3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
• 0.4. Nội dung nghiên cứu
• 0.5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
• 0.6. Đóng góp mới của đề tài
• 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ LIGNOCELLULOSE
• 1.2. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CELLULASE
• 1.2.1. Cơ chế hoạt động của cellulase và sự thủy phân cellulose
• 1.2.2. Cấu trúc của cellulase
• 1.2.2.1. Cấu trúc chung của cellulase
• 1.2.2.2. Cellulosome thủy phân cellulose
• 1.3. CELLULASE CỦA VI KHUẨN
• 1.3.1. Sơ lược về họ cellulase
• 1.3.2. Cellulase của vi khuẩn và vi khuẩn cổ
• 1.3.3. Cellulase vi khuẩn và vi khuẩn cổ ưa ấm
• 1.3.4. Cellulase ở vi khuẩn và vi khuẩn cổ ưa nhiệt
• 1.4. Ứng dụng của cellulase
• 1.4.1. Ứng dụng của cellulase trong công nghệ sản xuất bia, rượu vang, chế biến thực phẩm và thức ăn
• 1.4.2. Ứng dụng cellulase trong dệt may
• 1.4.3. Ứng dụng cellulase trong chế biến bột giấy và giấy
• 1.4.4. Ứng dụng của cellulase trong sản xuất cồn sinh học
• 1.5. MỐI VÀ HỆ VI SINH VẬT RUỘT MỐI LIÊN QUAN ĐẾN SỰ THỦY PHÂN LIGNOCELLULOSE
• 1.5.1. Sơ lược về mối và đa dạng mối ở Việt Nam
• 1.5.2. Hệ vi sinh vật trong ruột mối bậc thấp
• 1.5.3. Sự tiêu hóa lignocellulose của mối
• 1.5.4. Tình hình nghiên cứu gen mã hóa cellulase của sinh vật trong đường ruột mối bậc thấp
• 1.6. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ METAGENOMICS
• 1.6.1. Phương pháp tiếp cận tìm gen mới bằng Metagenomics
• 1.6.2. Phân lập gen từ thư viện DNA đa hệ gen
• 1.6.3. Khai thác và phân lập gen từ dữ liệu trình tự DNA đa hệ gen
• 1.6.4. Phương pháp giải trình tự của một số hệ thống máy thế hệ mới
• 1.6.5. Tập hợp các read thành contig
• 1.6.6. Ứng dụng của Metagenomics
• 1.6.6.1. Ứng dụng của Metagenomics trong khai thác gen mới và đánh giá sự đa dạng vi sinh vật
• 1.6.6.2. Tiềm năng ứng dụng của Metagenomics
• 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ MÁY MÓC
• 2.1.1. Đối tượng và vật liệu
• 2.1.2. Hóa chất và thiết bị máy móc
• 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.2.1. Các phương pháp vi sinh
• 2.2.2. Các phương pháp sinh học phân tử
• 2.2.2.1. Tách chiết DNA hệ gen của mối
• 2.2.2.2. Phương pháp thu nhận vi khuẩn ruột mối và tách chiết DNA đa hệ gen của chúng
• 2.2.2.3. Tinh sạch DNA đa hệ gen bằng phương pháp máng đơn (troughing)
• 2.2.2.4. Giải trình tự DNA đa hệ gen bằng máy giải trình tự thế hệ mới HiSeq2000 của Illumina
• 2.2.2.5. Phương pháp biến nạp DNA plasmid vào vi khuẩn E. coli bằng sốc nhiệt
• 2.2.2.6. Phương pháp tách chiết DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn E
• 2.2.2.7. Phương pháp cắt và ghép nối gen
• 2.2.2.8. Phương pháp tinh sạch DNA từ gel agarose bằng QIAquick Gel Extraction kit
• 2.2.2.9. Kỹ thuật PCR
• 2.2.2.10. Thiết kế vector biểu hiện pET22b(+) mang gen egc
• 2.2.2.11. Điện di DNA trên gel agarose
• 2.2.2.12. Phương pháp biểu hiện gen
• 2.2.2.13. Điện di biến tính protein trên gel polyacrylamide-SDS
• 2.2.2.14. Điện di protein trên gel polyacrylamide không SDS
• 2.2.3. Các phương pháp hóa sinh protein
• 2.2.3.1. Phương pháp tinh chế protein bằng sắc kí ái lực his-tag
• 2.2.3.2. Định lượng protein bằng phương pháp Bradford
• 2.2.3.3. Định lượng đường khử bằng phương pháp DNS
• 2.2.3.4. Phương pháp xác định hoạt tính endoglucanase
• 2.2.3.5. Phương pháp xác định hoạt tính β-glucosidase và β-xylosidase
• 2.2.3.6. Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, các ion kim loại và một số hóa chất lên hoạt tính endoglucanase
• 2.2.3.7. Xác định độ bền của enzyme
• 2.2.3.8. Xác định thông số động học của enzyme
• 2.2.4. Các phương pháp tin sinh học và xử lý số liệu bằng phần mềm sinh học
• 2.2.4.1. Phân tích trình tự DNA đa hệ gen vi khuẩn ruột mối
• 2.2.4.2. So sánh trình tự ORF của dữ liệu DNA đa hệ gen với CSDL của NCBI
• 2.2.4.3. Thiết kế mồi bằng phần mềm FastPCR
• 2.2.4.4. Kiểm tra vị trí của các enzyme hạn chế trên gen quan tâm bằng phần mềm trực tuyến RestrictionMapper
• 2.2.4.5. Chuyển mã trình tự DNA sang trình tự axit amin bằng chương trình dịch mã ExPASy
• 2.2.4.6. Xây dựng cây phát sinh loài của loài mối nghiên cứu với các loài mối khác bằng phần mềm Genedoc và MEGA5
• 2.2.4.7. Dự đoán cấu trúc của EGC bằng phần mềm Phyre2
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. KẾT QUẢ ĐỊNH LOÀI MỐI NGHIÊN CỨU BẰNG PHƢƠNG PHÁP PHÂN TỬ
• 3.1.1. Tách chiết DNA hệ gen của mối
• 3.1.2. PCR khuếch đại đoạn DNA của gen mã hóa RNA ribosome 16S ti thể mối
• 3.1.3. Phân tích sản phẩm PCR
• 3.2. TÁCH CHIẾT, ĐỌC VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ DNA ĐA HỆ GEN VI KHUẨN RUỘT MỐI C
• 3.2.1. Tách chiết và tinh sạch DNA đa hệ gen vi khuẩn ruột mối C
• 3.2.2. Đọc và phân tích trình tự DNA đa hệ gen vi khuẩn ruột mối C
• 3.2.3. Tập hợp trình tự và xác định gen
• 3.2.4. Đa dạng vi sinh vật ruột mối C
• 3.3. GEN MÃ HÓA ENZYME THUỶ PHÂN CELLULOSE CỦA VI KHUẨN RUỘT MỐI C
• 3.3.1. Dự đoán chức năng gen của DNA đa hệ gen vi khuẩn ruột mối C
• 3.3.2. Gen mã hóa enzyme phân hủy cellulose
• 3.3.3. Lựa chọn ORF cellulase để biểu hiện
• 3.4. TÁCH DÕNG GEN egc
• 3.4.1. Trình tự ORF GL0130684
• 3.4.2. Khuếch đại gen egc
• 3.4.3. Ghép nối sản phẩm khuếch đại gen egc vào vector tách dòng pJET1
• 3.4.4. Biến nạp sản phẩm ghép nối vào tế bào E
• 3.4.5. Cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme hạn chế
• 3.4.6. Phân tích trình tự gen wegc phân lập được từ DNA đa hệ gen vi khuẩn ruột mối C
• 3.4.7. Khuếch đại gen egc không chứa tín hiệu tiết từ khuôn pJET-wegc
• 3.4.8. Thiết kế vector biểu hiện gen egc
• 3.4.9. Ghép nối gen egc vào vector biểu hiện
• 3.4.10. Cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET22-egc
• 3.5. BIỂU HIỆN GEN egc TRONG VI KHUẨN E
• 3.5.1. Chọn dòng biểu hiện gen egc trong tế bào E
• 3.5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự biểu hiện gen egc trong tế bào E
• 3.5.3. Ảnh hưởng của nồng độ IPTG đến hiệu quả cảm ứng
• 3.5.4. Điện di và kiểm tra hoạt tính endoglucanase của EGC
• 3.5.5. Tinh chế protein EGC bằng cột sắc kí ái lực His-tag
• 3.5.6. Tính đặc hiệu cơ chất của EGC
• 3.5.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính endoglucanase của EGC
• 3.5.8. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của EGC
• 3.5.9. Độ bền nhiệt của EGC
• 3.5.10. Ảnh hưởng của một số ion kim loại và hóa chất lên hoạt tính của EGC
• 3.5.11. Đặc điểm động học của EGC
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu gen enzyme thủy phân cellulose

Nghiên cứu gen enzyme thủy phân cellulose từ vi khuẩn ruột mối bằng metagenomics là một lĩnh vực đang thu hút sự chú ý trong ngành sinh học phân tử và công nghệ sinh học. Việc tìm hiểu về các enzyme này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế phân hủy cellulose mà còn mở ra cơ hội ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như sản xuất năng lượng sinh học và chế biến thực phẩm. Cellulose là thành phần chính trong lignocellulose, một nguồn tài nguyên tái tạo quan trọng. Việc khai thác enzyme thủy phân cellulose từ vi khuẩn ruột mối có thể giúp tối ưu hóa quá trình phân hủy cellulose, từ đó nâng cao hiệu suất sản xuất năng lượng sinh học.

1.1. Tầm quan trọng của enzyme thủy phân cellulose

Enzyme thủy phân cellulose đóng vai trò quan trọng trong quá trình phân hủy cellulose thành glucose. Glucose sau đó có thể được sử dụng để sản xuất ethanol và các sản phẩm sinh học khác. Việc nghiên cứu enzyme này từ vi khuẩn ruột mối giúp phát hiện các enzyme mới có khả năng hoạt động hiệu quả hơn trong điều kiện công nghiệp.

1.2. Khái niệm metagenomics trong nghiên cứu vi sinh vật

Metagenomics là một phương pháp nghiên cứu gen từ các mẫu môi trường mà không cần nuôi cấy vi sinh vật. Phương pháp này cho phép phân tích toàn bộ hệ gen của vi sinh vật trong ruột mối, từ đó phát hiện các gen mã hóa enzyme thủy phân cellulose. Điều này giúp mở rộng hiểu biết về tính đa dạng vi sinh vật và khả năng phân hủy cellulose trong tự nhiên.

II. Thách thức trong nghiên cứu enzyme thủy phân cellulose

Mặc dù nghiên cứu enzyme thủy phân cellulose từ vi khuẩn ruột mối mang lại nhiều tiềm năng, nhưng cũng đối mặt với nhiều thách thức. Một trong những thách thức lớn nhất là việc xác định và phân lập các gen mã hóa enzyme từ các mẫu vi sinh vật phức tạp. Hệ vi sinh vật trong ruột mối rất đa dạng, với nhiều loài vi khuẩn khác nhau, điều này làm cho việc phân tích gen trở nên khó khăn. Ngoài ra, việc tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy và biểu hiện enzyme cũng là một vấn đề cần được giải quyết.

2.1. Đối mặt với sự đa dạng vi sinh vật

Sự đa dạng của vi sinh vật trong ruột mối tạo ra khó khăn trong việc phân lập và xác định các gen mã hóa enzyme. Các phương pháp metagenomics cần được áp dụng một cách hiệu quả để khai thác toàn bộ tiềm năng của hệ vi sinh vật này.

2.2. Khó khăn trong việc biểu hiện enzyme

Việc biểu hiện enzyme thủy phân cellulose trong các hệ thống vi sinh vật như E. coli có thể gặp khó khăn do sự khác biệt trong điều kiện sinh trưởng và hoạt động của enzyme. Cần có các nghiên cứu sâu hơn để tối ưu hóa điều kiện biểu hiện và tinh chế enzyme.

III. Phương pháp nghiên cứu gen enzyme thủy phân cellulose

Nghiên cứu gen enzyme thủy phân cellulose từ vi khuẩn ruột mối thường sử dụng các phương pháp sinh học phân tử hiện đại. Các bước chính bao gồm thu thập mẫu, tách chiết DNA, giải trình tự và phân tích dữ liệu. Phương pháp metagenomics cho phép thu thập thông tin gen từ toàn bộ hệ vi sinh vật mà không cần nuôi cấy. Điều này giúp phát hiện các gen mới và đánh giá tính đa dạng vi sinh vật trong ruột mối.

3.1. Tách chiết DNA từ mẫu vi sinh vật

Quá trình tách chiết DNA từ mẫu vi sinh vật trong ruột mối là bước đầu tiên và quan trọng. Các phương pháp hóa học và cơ học được sử dụng để đảm bảo thu được DNA chất lượng cao, phục vụ cho các bước phân tích tiếp theo.

3.2. Giải trình tự DNA và phân tích dữ liệu

Sau khi tách chiết DNA, bước tiếp theo là giải trình tự DNA bằng các công nghệ hiện đại như Illumina. Dữ liệu thu được sẽ được phân tích để xác định các gen mã hóa enzyme thủy phân cellulose, từ đó đánh giá khả năng hoạt động của chúng.

IV. Ứng dụng thực tiễn của enzyme thủy phân cellulose

Enzyme thủy phân cellulose có nhiều ứng dụng thực tiễn trong các lĩnh vực như sản xuất năng lượng sinh học, chế biến thực phẩm và dệt may. Việc sử dụng enzyme này giúp tăng hiệu suất phân hủy cellulose, từ đó nâng cao hiệu quả sản xuất ethanol và các sản phẩm sinh học khác. Ngoài ra, enzyme cũng được ứng dụng trong ngành công nghiệp chế biến thực phẩm để cải thiện chất lượng sản phẩm.

4.1. Ứng dụng trong sản xuất năng lượng sinh học

Enzyme thủy phân cellulose có vai trò quan trọng trong quá trình sản xuất ethanol từ sinh khối. Việc tối ưu hóa enzyme này có thể giúp giảm chi phí sản xuất và tăng hiệu suất chuyển đổi cellulose thành glucose.

4.2. Ứng dụng trong chế biến thực phẩm

Trong ngành chế biến thực phẩm, enzyme thủy phân cellulose được sử dụng để cải thiện độ trong suốt và độ nhớt của sản phẩm. Điều này giúp nâng cao chất lượng và giá trị dinh dưỡng của thực phẩm.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu gen enzyme thủy phân cellulose từ vi khuẩn ruột mối bằng metagenomics mở ra nhiều cơ hội mới trong lĩnh vực sinh học phân tử và công nghệ sinh học. Việc phát hiện và tối ưu hóa các enzyme mới có thể giúp cải thiện hiệu suất sản xuất năng lượng sinh học và chất lượng sản phẩm trong nhiều ngành công nghiệp. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho xã hội và môi trường.

5.1. Tiềm năng phát triển enzyme mới

Việc nghiên cứu và phát hiện các enzyme mới từ vi khuẩn ruột mối có thể giúp mở rộng ứng dụng của enzyme trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Các enzyme này có thể được tối ưu hóa để hoạt động hiệu quả hơn trong điều kiện công nghiệp.

5.2. Hướng nghiên cứu trong tương lai

Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc khai thác tiềm năng của metagenomics để phát hiện các gen mới và đánh giá tính đa dạng vi sinh vật. Điều này sẽ giúp nâng cao hiểu biết về cơ chế phân hủy cellulose và phát triển các ứng dụng mới trong công nghệ sinh học.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ sinh học với đề tài "Nghiên cứu gen mã hóa enzyme tham gia thủy phân cellulose từ khu hệ vi khuẩn ruột mối bằng kỹ thuật Metagenomics" do nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Thảo thực hiện tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội (bảo vệ năm 2015), chuyên ngành Di truyền học (mã số: 62 42 01 21), dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Trương Nam Hải và TS. Đỗ Thị Huyền. Nghiên cứu được triển khai tại Phòng Kỹ thuật di truyền thuộc Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ sinh học (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam), với sự tài trợ từ Đề tài Nghị định thư Việt Nam - Nhật Bản: “Phân lập hệ gen mã hóa cho enzyme thủy phân lignocellulose từ khu hệ vi sinh ruột mối Việt Nam bằng kỹ thuật Metagenomics”.

Tính cấp thiết của đề tài xuất phát từ nhu cầu xử lý nguồn phế phụ phẩm nông nghiệp chứa lignocellulose (như rơm rạ, bã mía, lá mía) ước tính lên tới 50 triệu tấn mỗi năm tại Việt Nam, vốn chủ yếu bị đốt gây ô nhiễm môi trường. Việc ứng dụng enzyme cellulase để thủy phân cellulose thành đường lên men sản xuất cồn sinh học thế hệ thứ hai gặp trở ngại lớn do chi phí enzyme cao và thiếu các chế phẩm cellulase hoạt động ổn định ở điều kiện công nghiệp. Khoảng trống nghiên cứu then chốt được tác giả xác định là:

• Mối là côn trùng có khả năng phân giải lignocellulose hiệu quả nhờ sự cộng tác giữa hệ enzyme của vật chủ và khu hệ vi sinh vật đường ruột.
• Tại Việt Nam có hơn 100 loài mối đã được ghi nhận nhưng khu hệ vi sinh vật đường ruột cũng như nguồn gen mã hóa enzyme thủy phân lignocellulose của chúng chưa từng được điều tra, khảo sát.
• Các nghiên cứu quốc tế về ruột mối bậc thấp phần lớn chỉ tập trung vào động vật nguyên sinh (protozoa), trong khi khu hệ vi khuẩn và tiềm năng gen cellulase từ vi khuẩn ruột mối chưa được khảo sát đầy đủ.
• Khoảng 99% vi sinh vật tự nhiên không nuôi cấy được bằng phương pháp vi sinh truyền thống; do đó, kỹ thuật Metagenomics (đa hệ gen) là giải pháp trực tiếp để tiếp cận toàn bộ nguồn gen vi khuẩn ruột mối mà không cần qua khâu nuôi cấy.

Mục tiêu tổng quát của đề tài là phân lập, tách dòng và biểu hiện được 1 gen mã hóa cellulase từ DNA đa hệ gen vi khuẩn ruột mối bằng kỹ thuật Metagenomics.

Nội dung nghiên cứu được đánh số theo văn bản luận án gồm 5 nhiệm vụ:

1. Tách chiết DNA đa hệ gen của vi khuẩn ruột mối Coptotermes.
2. Giải trình tự và xử lý trình tự DNA đa hệ gen.
3. Từ bộ dữ liệu trình tự DNA đa hệ gen, dự đoán gen và chú thích gen theo hai khía cạnh là đa dạng sinh vật và chức năng.
4. Chọn 1 trình tự gen để thiết kế mồi, phân lập, tách dòng và biểu hiện.
5. Xác định đặc điểm của sản phẩm biểu hiện gen phân lập được.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Khu hệ vi khuẩn sống trong đường ruột loài mối thuộc chi Coptotermes (mối do Viện Sinh thái và Bảo vệ công trình cung cấp; mẫu nghiên cứu thu thập tại phường Văn Quán, quận Hà Đông, Hà Nội, được định danh phân tử là loài Coptotermes gestroi).
• Phạm vi nghiên cứu: Tập trung vào vi khuẩn ruột sau của mối thợ; khai thác DNA đa hệ gen bằng giải trình tự thế hệ mới (NGS); sàng lọc các khung đọc mở (ORF) mã hóa endoglucanase; biểu hiện gen tái tổ hợp trong tế bào chủ Escherichia coli BL21(DE3) và đánh giá các đặc tính hóa sinh của enzyme tái tổ hợp ở quy mô phòng thí nghiệm.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã hệ thống hóa các hướng nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến cấu trúc lignocellulose, cơ chế xúc tác của cellulase, hệ vi sinh vật ruột mối và kỹ thuật Metagenomics:

Cấu trúc lignocellulose và cơ chế enzyme cellulase: Tác giả tổng hợp các công trình của Perez et al. (2002), Zhang & Lynd (2004), Bayer et al. (1998, 2004), Lynd et al. (2002). Lignocellulose gồm 3 thành phần chính: cellulose (polysaccharide đồng thể từ các gốc D-glucose nối bằng liên kết $\beta$-1,4-glycoside, gồm vùng tinh thể và vùng vô định hình), hemicellulose (polysaccharide dị thể phân nhánh chứa D-xylose, L-arabinose, D-galactose, D-glucose, D-mannose) và lignin (polyme phenylpropanoid phức tạp từ các đơn vị p-coumaryl alcohol, coniferyl alcohol và sinapyl alcohol). Quá trình thủy phân cellulose đòi hỏi sự phối hợp của 3 nhóm enzyme:

• Endoglucanase (EC 3.2.1.4): cắt ngẫu nhiên các liên kết $\beta$-1,4-glycoside bên trong vùng vô định hình của sợi cellulose.
• Exoglucanase/Cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91, EC 3.2.1.74): cắt từ đầu khử hoặc không khử giải phóng cellobiose hoặc glucose.
• $\beta$-glucosidase (EC 3.2.1.21): thủy phân cellobiose và cello-oligosaccharide ngắn thành glucose. Cấu trúc cellulase điển hình gồm vùng xúc tác (Catalytic Domain - CD), vùng gắn carbohydrate (Carbohydrate Binding Domain - CBD) và đoạn peptide nối (linker) giàu proline, threonine, serine. Ở vi khuẩn kỵ khí, cellulase còn tồn tại dưới dạng phức hợp cellulosome gắn trên bề mặt tế bào thông qua protein khung (scaffolding) chứa cohesin và dockerin (như mô tả của Doi & Kosugi, 2004 ở Clostridium cellulovorans).

Phân loại cellulase: Dựa trên cơ sở dữ liệu CAZy (tính đến tháng 8/2015), các glycoside hydrolase (GH) được chia thành 133 họ, trong đó cellulase phân bố ở 24 họ GH khác nhau (họ 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 16, 17, 26, 30, 44, 45, 48, 51, 61, 74, 94, 116, 124, 131).

Khu hệ vi sinh vật ruột mối: Theo Brune (2006, 2014), Breznak (1982, 2002), mối được chia thành mối bậc thấp (chứa cả động vật nguyên sinh, vi khuẩn và vi khuẩn cổ) và mối bậc cao (không chứa động vật nguyên sinh). Ở mối bậc thấp (Coptotermes formosanus, Reticulitermes speratus), vi khuẩn thuộc các ngành Spirochaetes, Bacteroidetes, Firmicutes, Proteobacteria, Fibrobacteres, Elusimicrobia. Inoue et al. (2005) đã tách dòng gen endo-$\beta$-1,4-glucanase dài 921 bp từ cDNA của động vật nguyên sinh ruột mối C. formosanus. Tartar et al. (2009) phân tích 10.000 EST ở ruột mối Reticulitermes flavipes, phát hiện 171 gen lignocellulase (cellulase từ động vật nguyên sinh chiếm 66%, vi khuẩn chiếm 18%). Scharf et al. (2011) giải mã metatranscriptome ruột mối R. flavipes trên hệ thống 454-Roche, thu được 76 mRNA mã hóa cellulase thuộc 5 họ GH (3, 5, 7, 8, 45). Mattéotti et al. (2011, 2012) sàng lọc thư viện metagenome vi sinh vật ruột mối Reticulitermes santonensis (14.700 dòng), tìm được 3 ORF mã hóa BglG (831 bp), BglF (1.851 bp) và BglB (1.392 bp).

Khai thác gen bằng Metagenomics: Phương pháp bắt nguồn từ ý tưởng của Pace (1991) và Healy et al. (1995). Các nghiên cứu sàng lọc chức năng từ thư viện metagenome đã phân lập được cellulase từ dạ cỏ trâu (Singh et al., 2014), dịch thải nhà máy giấy (Wang et al., 2012), dạ dày thỏ (Feng et al., 2011 với gen umcel5G/umcel5A), đất compost (Pang, 2007 với các gen umcel9A, 9B, 9C, 5A), ruột lợn (Ferrer et al., 2012). Dự án giải trình tự metagenome phân người châu Âu của Qin et al. (2010) trên máy Illumina đạt 576,7 Gb dữ liệu, phát hiện 3,3 triệu gen vi sinh vật.

Vị trí của luận án: Tại Việt Nam, theo Động vật chí Việt Nam (Nguyễn Đức Khảm, 2007), đã xác định được 101 loài mối thuộc 33 giống của 4 họ (Kalotermitidae, Termopsidae, Rhinotermitidae, Termitidae), nhưng chưa có nghiên cứu nào công bố về việc khai thác gen cellulase từ vi sinh vật ruột mối bằng metagenomics. Luận án giải quyết trực tiếp khoảng trống này bằng cách sử dụng công nghệ giải trình tự thế hệ mới Illumina để giải mã toàn bộ metagenome vi khuẩn ruột mối Coptotermes gestroi thu thập tại Việt Nam, từ đó sàng lọc và biểu hiện thực nghiệm một gen endoglucanase chức năng.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án sử dụng hướng tiếp cận Metagenomics dựa trên giải trình tự (sequence-based metagenomics) kết hợp sinh học phân tử thực nghiệm và hóa sinh protein.

Khung lý thuyết và các khái niệm sử dụng

• Khái niệm Metagenome: toàn bộ DNA hệ gen của quần xã vi sinh vật thu nhận trực tiếp từ mẫu môi trường tự nhiên mà không qua nuôi cấy.
• Hệ thống phân loại CAZy (Carbohydrate-Active EnZymes): phân nhóm các enzyme glycoside hydrolase dựa trên mức độ tương đồng trình tự axit amin, cấu trúc không gian và cơ chế phản ứng.
• Đồ thị de Bruijn: phương pháp toán học chia các đoạn đọc ngắn thành các chuỗi k-mer gối nhau với chiều dài $k-1$ để tập hợp de novo dữ liệu giải trình tự thế hệ mới mà không cần hệ gen tham chiếu.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Quy trình kỹ thuật được tiến hành qua các nhóm phương pháp chính:

Nhóm phương pháp	Kỹ thuật / Công cụ cụ thể	Mục đích thực hiện
Xử lý mẫu sinh học	Thu gom mối thợ, tách ruột sau, ly tâm thu sinh khối vi khuẩn	Thu nhận phân đoạn vi khuẩn ruột mối, loại bỏ tối đa mô vật chủ
Sinh học phân tử	Tách chiết DNA hệ gen mối; PCR vùng gen rRNA 16S ti thể	Định danh chính xác loài mối nghiên cứu
	Tinh sạch DNA đa hệ gen bằng phương pháp máng đơn (troughing)	Loại bỏ chất ức chế enzym trên gel agarose trước khi giải trình tự
	Giải trình tự thế hệ mới trên máy Illumina HiSeq 2000	Đọc trình tự đa hệ gen dạng paired-end (PE 100 bp)
	Kỹ thuật PCR, cắt giới hạn, ghép nối ligase, biến nạp sốc nhiệt	Tạo dòng gen trong vector pJET1.2/blunt và vector biểu hiện pET22b(+)
Tin sinh học	Phần mềm SOAPdenovo	Tập hợp các đoạn đọc ngắn (read) thành contig de novo
	Phần mềm FragGeneScan (FGS)	Dự đoán các khung đọc mở (ORF)/gen từ contig
	BLAST, MEGAN kết hợp CSDL NCBI NR	Phân tích đa dạng taxon vi sinh vật ruột mối
	Cơ sở dữ liệu KEGG, COG, CAZy	Phân loại chức năng gen và xác định các họ GH phân giải cellulose
	FastPCR, RestrictionMapper, ExPASy, Phyre2	Thiết kế mồi, lập bản đồ enzym cắt, dịch mã và dựng mô hình 3D
	MEGA5, GeneDoc	Xây dựng cây phát sinh loài (Neighbor-Joining)
Hóa sinh protein	SDS-PAGE (12,6%) và Native-PAGE (9% chứa 0,1% CMC)	Đánh giá độ tinh sạch, khối lượng phân tử và zymogram hoạt tính
	Sắc ký ái lực kim loại (IMAC/His-tag) cột Ni-NTA	Tinh chế enzyme tái tổ hợp EGC có đuôi 6xHis
	Phương pháp Bradford (chuẩn BSA)	Định lượng nồng độ protein tổng số và protein tinh sạch
	Phương pháp DNS (3,5-dinitrosalicylic acid)	Đo lượng đường khử giải phóng để xác định hoạt tính enzyme
	Đồ thị Lineweaver-Burk	Xác định các thông số động học enzym ($K_m$ và $V_{max}$)

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Tổng quan tài liệu

Chương này cung cấp luận cứ lý thuyết về sinh khối lignocellulose, cellulase và khu hệ vi sinh vật ruột mối:

• Tỷ lệ các thành phần lignocellulose từ các nguồn nguyên liệu khác nhau được tổng hợp trong văn bản luận án như sau:

Nguồn lignocellulose	Cellulose (%)	Hemicellulose (%)	Lignin (%)
Gỗ cứng	40 - 55	24 - 40	18 - 25
Gỗ mềm	45 - 50	25 - 35	25 - 35
Vỏ hạt	25 - 30	25 - 30	30 - 40
Lõi bắp ngô	45	35	15
Cỏ	25 - 40	35 - 50	10 - 30
Rơm lúa mì	30	50	15
Rơm lúa	32,1	24	18
Lá	15 - 20	80 - 85	0

• Cơ chế phân hủy cellulose diễn ra qua các bước: nới lỏng cấu trúc bề mặt sợi, cắt ngẫu nhiên bên trong chuỗi cellulose vô định hình nhờ endoglucanase, cắt giải phóng cellobiose nhờ exoglucanase và chuyển hóa cellobiose thành glucose nhờ $\beta$-glucosidase.
• Phân loại cellulase của vi khuẩn được tác giả tổng hợp theo bảng danh mục gồm 7 nhóm chính:

Tên enzyme	Số EC	Hoạt tính xúc tác chính	Họ GH
Endo-$\beta$-1,4-glucanase	3.2.1.4	Cắt ngẫu nhiên liên kết $\beta$-1,4-glycoside bên trong chuỗi	5, 6, 7, 8, 10, 12, 44, 51, 61, 74
Exoglucanase (Cellobiohydrolase)	3.2.1.91	Cắt liên kết $\beta$-1,4 giải phóng cellobiose từ đầu không khử	5, 6, 7, 9, 10, 48
Exoglucanase	3.2.1.74	Tách cellobiose từ cellooligosaccharide hoặc p-nitrophenyl-$\beta$-D-cellobioside	-
$\beta$-Glucosidase	3.2.1.21	Thủy phân cellodextrin và cellobiose thành D-glucose	1, 3, 9
Cellobiose phosphorylase	2.4.1.20	Phân cắt cellobiose khi có mặt $H_3PO_4$ tạo $\alpha$-D-glucose-1-P và glucose	94
Cellulodextrin phosphorylase	2.4.1.49	Phân cắt cellodextrin khi có mặt $H_3PO_4$	94
Cellobiose 2-epimerase	5.1.3.11	Biến đổi cellobiose thành 4-O-$\beta$-D-glucosylmannose	-

• Tổng quan chi tiết về ứng dụng cellulase trong các ngành: sản xuất cồn sinh học thế hệ hai (sơ đồ chuyển hóa sinh khối qua các bước tiền xử lý, thủy phân bằng enzyme và lên men); công nghiệp dệt may (loại xơ ngắn, làm mềm vải, tạo hiệu ứng mài stonewashing thay thế đá bọt); công nghiệp giấy (hỗ trợ nghiền sợi, giảm 20% đến 40% năng lượng nghiền, tẩy mực in); sản xuất bia, rượu vang và chế biến thức ăn gia súc.
• Cấu tạo giải phẫu đường tiêu hóa mối (ruột trước, ruột giữa, ruột sau) và đặc điểm vi sinh vật cộng sinh. Động vật chí Việt Nam ghi nhận 101 loài mối thuộc 4 họ: Kalotermitidae, Termopsidae, Rhinotermitidae (có chi Coptotermes) và Termitidae.
• Nguyên lý kỹ thuật Metagenomics: quy trình giải trình tự Illumina HiSeq 2000 (cơ chế tổng hợp SBS sử dụng dNTP gắn huỳnh quang có chất kết thúc đảo ngược), thuật toán dựng contig de novo qua sơ đồ gối và sơ đồ de Bruijn, cùng các phần mềm dự đoán gen (FragGeneScan, MetaGeneMark, MetaGeneAnnotator, Orphelia, Prodigal).

Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết đối tượng, hóa chất, thiết bị và các quy trình thao tác:

• Nguồn mẫu mối: thu thập tại 6 địa điểm, mẫu mối nghiên cứu chính thu tại phường Văn Quán, quận Hà Đông, Hà Nội do Viện Sinh thái và Bảo vệ công trình cung cấp.
• Chủng vi sinh vật và vector: chủng vi khuẩn E. coli DH5$\alpha$ dùng để nhân dòng plasmid; E. coli BL21(DE3) dùng để biểu hiện protein; vector tách dòng pJET1.2/blunt (Thermo Scientific); vector biểu hiện pET22b(+) (Novagen).
• Hóa chất và thiết bị: kit tách chiết gel QIAquick, enzyme hạn chế (NcoI, XhoI, BglII...), T4 DNA ligase, Taq DNA polymerase, Phusion High-Fidelity DNA Polymerase; chất cảm ứng IPTG, cơ chất carboxymethyl cellulose (CMC), avicel, p-nitrophenyl-$\beta$-D-glucopyranoside (pNPG), 4-nitrophenyl $\beta$-D-xylopyranoside (pNPX), thuốc thử DNSA; hệ thống giải trình tự Illumina HiSeq 2000; máy quang phổ đo mật độ quang OD.
• Quy trình tinh sạch DNA đa hệ gen bằng phương pháp máng đơn (troughing) trên gel agarose để loại bỏ tạp chất ức chế.
• Quy trình thiết kế vector biểu hiện tái tổ hợp pET22b(+) mang gen đích không chứa chuỗi peptide tín hiệu tiết của vi khuẩn gốc nhằm tối ưu hóa sự tích lũy protein hòa tan trong tế bào chất E. coli.
• Phương pháp xác định hoạt tính enzym bằng phương pháp DNS: phản ứng giữa đường khử giải phóng từ cơ chất CMC với thuốc thử axit 3,5-dinitrosalicylic tạo màu hấp thụ quang phổ tại bước sóng quy định; lập đường chuẩn glucose để quy đổi hoạt độ enzyme (U).

Chương 3. Kết quả và thảo luận

Chương này trình bày các phát hiện thực nghiệm được chia thành 5 phần:

3.1. Kết quả định loài mối nghiên cứu bằng phương pháp phân tử

• DNA tổng số của mẫu mối thu tại Văn Quán (Hà Đông) được tách chiết và khuếch đại gen mã hóa RNA ribosome 16S ti thể bằng kỹ thuật PCR.
• Hai đoạn sản phẩm PCR kích thước 430 bp và 126 bp được giải trình tự và so sánh với cơ sở dữ liệu NCBI. Kết quả phân tích mức độ tương đồng và dựng cây phát sinh loài (bằng MEGA5 và Genedoc) với các loài thuộc chi Coptotermes khẳng định mẫu mối nghiên cứu là loài Coptotermes gestroi.

3.2. Tách chiết, đọc và phân tích trình tự DNA đa hệ gen vi khuẩn ruột mối C. gestroi

• DNA đa hệ gen của vi khuẩn ruột sau mối C. gestroi được tách chiết và làm sạch triệt để bằng kỹ thuật máng đơn, đạt tiêu chuẩn giải trình tự NGS.
• Toàn bộ mẫu DNA được giải trình tự trên hệ thống Illumina HiSeq 2000, tạo ra hàng triệu đoạn đọc ngắn dạng paired-end (PE 100 bp).
• Dữ liệu thô được tập hợp de novo bằng phần mềm SOAPdenovo thành các contig dài.
• Phần mềm FragGeneScan (FGS) được áp dụng để dự đoán khung đọc mở (ORF), nhận diện được số lượng lớn các gen tiềm năng.
• Phân tích đa dạng vi sinh vật bằng phần mềm MEGAN dựa trên so sánh BLAST các read/contig với cơ sở dữ liệu NCBI NR cho thấy vi khuẩn ruột mối C. gestroi phân bố chủ yếu ở 7 ngành ưu thế, trong đó chiếm tỷ lệ lớn nhất là các ngành:
  1. Bacteroidetes
  2. Spirochaetes
  3. Firmicutes
  4. Proteobacteria
  5. Fibrobacteres
  6. Elusimicrobia
  7. Actinobacteria (và các nhóm vi khuẩn khác).
• Phân loại ở cấp độ sâu hơn xác định được 12 bộ vi khuẩn chiếm ưu thế trong đường ruột mối C. gestroi.

3.3. Gen mã hóa enzyme thủy phân cellulose của vi khuẩn ruột mối C. gestroi

• Dự đoán chức năng các ORF bằng cách đối chiếu với CSDL KEGG và COG/KOG, lập danh mục các lớp chức năng tham gia vào các con đường chuyển hóa sinh học, đặc biệt là chuyển hóa carbohydrate.
• Sàng lọc các ORF mã hóa enzyme thuộc các họ Glycoside Hydrolase (GH) có khả năng phân hủy cellulose và hemicellulose.
• Phân tích 5 ORF hoàn chỉnh mã hóa endoglucanase: so sánh độ tương đồng nucleotide và trình tự axit amin suy diễn với dữ liệu GenBank của NCBI.
• Khung đọc mở mang ký hiệu ORF GL0130684 (mã hóa enzyme endoglucanase, ký hiệu là EGC) được lựa chọn để tiến hành biểu hiện thực nghiệm. Trình tự cấu trúc không gian 3D của protein EGC được mô hình hóa thành công bằng phần mềm Phyre2.

3.4. Tách dòng gen egc

• Cặp mồi đặc hiệu được thiết kế bằng phần mềm FastPCR để khuếch đại đoạn gen hoàn chỉnh mã hóa endoglucanase (ký hiệu là wegc) từ khuôn DNA đa hệ gen vi khuẩn ruột mối C. gestroi.
• Sản phẩm PCR được ghép nối vào vector tách dòng pJET1.2/blunt và biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5$\alpha$. Các dòng plasmid tái tổ hợp pJET-wegc được kiểm tra bằng cắt enzyme hạn chế và giải trình tự nucleotide khẳng định độ chính xác của gen tách dòng.
• Thiết kế vector biểu hiện: để enzyme biểu hiện ở dạng hòa tan nội bào và thuận lợi cho tinh chế, tác giả thiết kế cặp mồi khuếch đại gen loại bỏ trình tự mã hóa peptide tín hiệu tiết ở đầu N (đoạn gen này ký hiệu là egc), bổ sung vị trí cắt của enzyme hạn chế NcoI và XhoI.
• Gen egc và vector pET22b(+) được xử lý bằng cặp enzyme NcoI/XhoI, ghép nối bằng T4 ligase tạo cấu trúc plasmid tái tổ hợp pET22-egc (chứa đoạn mã hóa 6xHis-tag ở đầu C).

3.5. Biểu hiện gen egc trong vi khuẩn E. coli và đặc trưng hóa enzyme EGC

• Chuyển vector pET22-egc vào chủng biểu hiện E. coli BL21(DE3).
• Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy cảm ứng (20°C, 25°C, 30°C, 37°C):
  • Ở 37°C, protein EGC được tổng hợp mạnh nhưng phần lớn kết tụ ở dạng thể vùi không tan (inclusion bodies).
  • Ở 20°C sau khi cảm ứng, tỷ lệ protein EGC tồn tại ở dạng hòa tan trong dịch chiết tế bào đạt mức cao nhất.
• Khảo sát nồng độ chất cảm ứng IPTG: thử nghiệm trong dải từ 0,0 đến 2,0 mM trong môi trường LBA; xác định được nồng độ IPTG tối ưu để thu hồi lượng enzyme hòa tan cực đại.
• Tinh chế enzyme: protein EGC hòa tan mang đuôi polyhistidine được tinh sạch qua cột sắc ký ái lực kim loại His-tag (Ni-NTA). Độ sạch của các phân đoạn rửa giải được kiểm tra trên điện di SDS-PAGE 12,6%, cho thấy một băng protein đơn nhất có kích thước phân tử phù hợp với tính toán lý thuyết.
• Kiểm tra hoạt tính endoglucanase trực tiếp trên bản gel zymogram (Native-PAGE 9% có bổ sung 0,1% CMC, nhuộm bằng đỏ Congo): xuất hiện vệt phân giải sáng rõ tại vị trí tương ứng của băng enzyme EGC tinh sạch.
• Tính đặc hiệu cơ chất: EGC thể hiện hoạt tính phân giải mạnh trên cơ chất carboxymethyl cellulose (CMC); không thể hiện hoặc thể hiện hoạt tính không đáng kể trên các cơ chất avicel (cellulose tinh thể), pNPG (cơ chất đặc hiệu của $\beta$-glucosidase) và pNPX (cơ chất đặc hiệu của $\beta$-xylosidase).
• Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH: xác định được dải nhiệt độ hoạt động tối ưu và giá trị pH tối ưu cho phản ứng thủy phân CMC của EGC; đánh giá độ bền nhiệt của enzyme khi ủ ở các mốc nhiệt độ khác nhau theo thời gian.
• Ảnh hưởng của ion kim loại và hóa chất: hoạt tính endoglucanase của EGC bị ức chế bởi một số hóa chất biến tính/tạo phức (như SDS, EDTA) và một số cation kim loại nặng; đặc biệt, sự bổ sung ion $Co^{2+}$ làm tăng rõ rệt hoạt tính xúc tác của enzyme EGC.
• Động học enzyme: khảo sát tốc độ phản ứng ở các nồng độ cơ chất CMC khác nhau và xây dựng đồ thị Lineweaver-Burk, từ đó xác định chính xác hằng số Michaelis ($K_m$) và vận tốc cực đại ($V_{max}$) của enzyme EGC tái tổ hợp.

Kết quả và những đóng góp mới

Luận án tự xác định các đóng góp mới về mặt lý luận khoa học và giá trị thực tiễn như sau:

Về mặt lý luận khoa học:

• Đây là công trình đầu tiên tại Việt Nam áp dụng thành công kỹ thuật Metagenomics kết hợp công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS) Illumina HiSeq 2000 để giải mã và phân tích toàn diện DNA đa hệ gen của khu hệ vi khuẩn ruột mối Coptotermes gestroi.
• Cung cấp dẫn liệu khoa học mới về cơ cấu phân loại của khu hệ vi khuẩn đường ruột mối C. gestroi tại Việt Nam, chứng minh sự ưu thế của 7 ngành vi khuẩn (Bacteroidetes, Spirochaetes, Firmicutes, Proteobacteria, Fibrobacteres, Elusimicrobia...) và xác định hệ thống các gen mã hóa enzyme phân hủy carbohydrate thuộc các họ Glycoside Hydrolase (GH).
• Lần đầu tiên phân lập, tách dòng và xác định trình tự một gen mã hóa endoglucanase hoàn chỉnh (ORF GL0130684, gen egc) từ metagenome vi khuẩn ruột mối C. gestroi; mô hình hóa thành công cấu trúc 3D của protein bằng công cụ tin sinh học Phyre2.

Về mặt thực tiễn:

• Thiết kế thành công hệ thống vector biểu hiện pET22-egc trong tế bào chủ E. coli BL21(DE3) không mang peptide tín hiệu tiết, sản xuất được enzyme endoglucanase EGC tái tổ hợp ở trạng thái hòa tan có hoạt tính sinh học.
• Xây dựng quy trình tinh chế một bước bằng sắc ký ái lực His-tag thu được enzyme EGC có độ sạch cao; xác lập bộ thông số hóa sinh và động học enzym ($K_m$, $V_{max}$, pH và nhiệt độ tối ưu, hiệu ứng hoạt hóa của $Co^{2+}$), làm cơ sở cho việc định hướng ứng dụng enzyme này trong công nghiệp sản xuất cồn sinh học và chế biến phế phẩm nông nghiệp.

Kiến nghị và đề xuất:

• Tiếp tục khai thác, tách dòng và biểu hiện các ORF tiềm năng khác đã được chú giải trong bộ dữ liệu metagenome vi khuẩn ruột mối C. gestroi, đặc biệt là các gen mã hóa exoglucanase và $\beta$-glucosidase.
• Nghiên cứu phối hợp enzyme EGC với các cellulase và hemicellulase khác để xây dựng các phức hệ enzyme có khả năng thủy phân trực tiếp rơm rạ, bã mía chưa qua tiền xử lý hóa chất độc hại.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Văn bản luận án phản ánh một số điểm giới hạn gắn liền với phạm vi kỹ thuật:

• Do đặc điểm của công nghệ giải trình tự Illumina HiSeq 2000 thời điểm nghiên cứu là tạo ra các đoạn đọc ngắn (paired-end 100 bp), việc tập hợp de novo tạo ra nhiều đoạn contig kích thước ngắn, chưa thể tái lập hoàn chỉnh toàn bộ hệ gen của từng loài vi khuẩn riêng biệt trong quần xã ruột mối.
• Các phần mềm dự đoán gen metagenome (như FragGeneScan) dù có độ chính xác cao nhưng vẫn bỏ sót một tỷ lệ gen tiềm năng; một số ORF dự đoán được chưa thể gán chức năng sinh học chính xác do sự hạn chế của cơ sở dữ liệu tham chiếu đối với vi sinh vật đường ruột côn trùng.
• Nghiên cứu thực nghiệm mới chỉ tập trung phân lập, biểu hiện và khảo sát đặc tính của 1 gen endoglucanase (egc / ORF GL0130684); các khung đọc mở khác mã hóa enzyme phân giải lignocellulose trong tập dữ liệu chưa được kiểm chứng thực nghiệm.
• Quá trình biểu hiện và khảo sát enzyme mới dừng lại ở quy mô bình tam giác phòng thí nghiệm, chưa tiến hành thử nghiệm thủy phân trên sinh khối lignocellulose thực tế ở quy mô bán công nghiệp (pilot).

Hướng nghiên cứu tiếp theo được xác định là mở rộng biểu hiện các gen cellulase và xylanase còn lại trong bộ dữ liệu đa hệ gen, đồng thời nghiên cứu biến tính hoặc tối ưu hóa điều kiện lên men nhằm gia tăng độ bền nhiệt và hiệu suất xúc tác của enzyme EGC.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu chuyên khảo có giá trị ứng dụng và tham khảo cho các đối tượng sau:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên: Chuyên ngành Di truyền học, Sinh học phân tử, Công nghệ sinh học và Vi sinh vật học. Luận án cung cấp quy trình mẫu về kỹ thuật tách chiết, tinh sạch DNA đa hệ gen từ mẫu đường ruột côn trùng bằng kỹ thuật máng đơn (troughing) để loại bỏ tạp chất ức chế phản ứng sinh học phân tử.
• Nhà nghiên cứu tin sinh học (Bioinformatics): Tham khảo quy trình phân tích dữ liệu giải trình tự NGS thông lượng cao, từ khâu tập hợp de novo bằng SOAPdenovo, dự đoán gen bằng FragGeneScan, đến phân tích phân loại vi sinh vật bằng MEGAN và chú giải chức năng chuyển hóa qua cơ sở dữ liệu KEGG, COG, CAZy.
• Nhà công nghệ sinh học enzyme và năng lượng sinh học: Tham khảo phương pháp thiết kế cấu trúc biểu hiện protein ngoại lai hòa tan trong E. coli (loại bỏ chuỗi peptide tín hiệu tiết), quy trình tinh chế protein qua cột sắc ký ái lực His-tag và phương pháp đo động học enzyme theo Lineweaver-Burk.

Câu hỏi thường gặp

1. Loài mối được sử dụng trong luận án là loài nào và tác giả xác định loài bằng phương pháp gì?

Loài mối được sử dụng trong nghiên cứu là Coptotermes gestroi, thuộc phân họ Coptotermitinae, họ Rhinotermitidae. Tác giả định danh loài bằng phương pháp phân tử: tách chiết DNA hệ gen của mối thợ thu tại phường Văn Quán (Hà Đông, Hà Nội), khuếch đại PCR các đoạn gen mã hóa rRNA 16S ti thể (vùng kích thước 430 bp và 126 bp), giải trình tự nucleotide, so sánh BLAST với cơ sở dữ liệu GenBank (NCBI) và xây dựng cây phát sinh loài bằng phần mềm GeneDoc và MEGA5.

2. Kỹ thuật giải trình tự và phần mềm tập hợp contig nào được sử dụng để phân tích metagenome vi khuẩn ruột mối?

Tác giả sử dụng hệ thống máy giải trình tự thế hệ mới HiSeq 2000 của hãng Illumina, áp dụng phương pháp giải trình tự theo nguyên lý tổng hợp (sequencing by synthesis - SBS) với cấu hình đọc đoạn cặp hai đầu (paired-end, 100 bp). Để tập hợp hàng triệu read ngắn thành các contig dài mà không cần hệ gen tham chiếu (de novo assembly), tác giả sử dụng phần mềm chuyên dụng SOAPdenovo hoạt động dựa trên thuật toán xây dựng đồ thị de Bruijn với kích thước k-mer tối ưu.

3. Vì sao tác giả phải loại bỏ trình tự peptide tín hiệu tiết khi thiết kế vector biểu hiện gen egc?

Trong cấu trúc gen tự nhiên ban đầu (wegc), đoạn đầu N chứa trình tự mã hóa peptide tín hiệu tiết giúp vi khuẩn đưa enzyme qua màng tế bào. Tuy nhiên, khi biểu hiện ngoại lai trong hệ thống tế bào chủ E. coli, peptide tín hiệu tiết thường khiến protein tái tổ hợp bị cuộn gập sai hoặc chuyển vị không hoàn chỉnh, dẫn đến hình thành các thể vùi không tan (inclusion bodies) mất hoạt tính. Tác giả thiết kế cặp mồi PCR khuếch đại riêng đoạn gen egc đã cắt bỏ đoạn tín hiệu tiết này để biểu hiện enzyme trực tiếp trong tế bào chất E. coli, từ đó thu được enzyme EGC ở dạng hòa tan và giữ nguyên hoạt tính xúc tác.

4. Nhiệt độ nuôi cấy cảm ứng có ảnh hưởng như thế nào đến khả năng hòa tan của enzyme EGC trong E. coli BL21(DE3)?

Thực nghiệm khảo sát biểu hiện ở 4 mức nhiệt độ (20°C, 25°C, 30°C và 37°C) cho thấy nhiệt độ nuôi cấy cảm ứng quyết định trực tiếp trạng thái của protein tái tổ hợp. Ở 37°C, enzyme EGC được sinh tổng hợp với số lượng lớn nhưng hầu hết tồn tại ở dạng kết tụ không tan trong thể vùi. Ngược lại, khi hạ nhiệt độ nuôi cấy cảm ứng xuống 20°C, tốc độ dịch mã chậm lại giúp chuỗi polypeptide cuộn gập chính xác, làm tăng tối đa tỷ lệ protein EGC ở dạng hòa tan trong dịch chiết tế bào.

5. Enzyme EGC tái tổ hợp thể hiện đặc điểm xúc tác và đáp ứng với ion kim loại ra sao?

Enzyme EGC thể hiện hoạt tính xúc tác đặc hiệu đối với liên kết $\beta$-1,4-glycoside nội mạch trên cơ chất carboxymethyl cellulose (CMC), xác nhận đây là một endoglucanase điển hình; enzyme không phân giải hoặc phân giải không đáng kể avicel, pNPG và pNPX. Về mặt hóa sinh, hoạt tính của EGC bị ức chế bởi các chất biến tính như SDS hoặc chất tạo phức EDTA, nhưng lại được gia tăng đáng kể khi bổ sung ion kim loại $Co^{2+}$ vào hỗn hợp phản ứng.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Nguyễn Thị Thảo đã ứng dụng thành công kỹ thuật Metagenomics dựa trên nền tảng giải trình tự thế hệ mới Illumina HiSeq 2000 để phân tích toàn diện DNA đa hệ gen của khu hệ vi khuẩn ruột loài mối Coptotermes gestroi tại Việt Nam. Công trình đã làm sáng tỏ cơ cấu đa dạng taxon của 7 ngành vi khuẩn chiếm ưu thế và lập danh mục các gen chức năng thuộc các họ Glycoside Hydrolase tham gia chuyển hóa carbohydrate. Từ dữ liệu đa hệ gen, luận án đã phân lập, tách dòng và biểu hiện thành công một gen mã hóa endoglucanase (gen egc / ORF GL0130684) trong tế bào E. coli BL21(DE3), đồng thời xác định đầy đủ các đặc tính xúc tác, độ bền và động học của enzyme EGC tinh sạch. Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở dữ liệu quan trọng cho nghiên cứu di truyền học vi sinh vật đường ruột côn trùng và mở ra tiềm năng ứng dụng nguồn gen cellulase mới trong công nghệ sản xuất cồn sinh học từ phế phẩm nông nghiệp.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Cellulase là nhóm enzyme được sử dụng phổ biến trong các ngành công nghiệp như chế biến thực phẩm, chế biến thức ăn, sản xuất giấy, sản xuất rượu, sản xuất bia, công nghệ dệt…. Đặc biệt, cellulase đang được quan tâm nghiên cứu ứng dụng trong sản xuất nhiên liệu sinh học [8] như cồn sinh học từ nguồn phế phẩm lignocellulose dồi dào thay thế cho nguồn nhiên liệu hóa thạch đang trên đà cạn kiệt. Trong vòng hơn 25 năm qua, sản lượng cồn sinh học đã tăng trưởng và đạt mức nhảy vọt kể từ năm 2000.

Cồn sinh học có thể được dùng như nguồn nhiên liệu độc lập cho các loại xe có động cơ chuyên biệt hoặc làm phụ gia nhiên liệu cho loại xe có động cơ truyền thống với tỉ lệ lên đến 30% [126]. Ở nước ta, ước tính hàng năm, nguồn nguyên liệu lignocellulose từ phế phẩm nông nghiệp như rơm, rạ, lá mía và bã cây mía bỏ phí lên đến 50 triệu tấn. Biện pháp xử lý nguồn phế phẩm này chủ yếu là đốt đã gây ra những ảnh hưởng tiêu cực đến môi trường sống và sức khoẻ con người [32, 135]. Việc tận dụng được nguồn nguyên vật liệu lignocellulose phế phẩm này vào sản xuất cồn sinh học sẽ đem đến nhiều lợi ích to lớn cho môi trường cũng như cho nền kinh tế của nước ta.

Việc sử dụng cellulase thay thế các hóa chất truyền thống như axit, kiềm và nhiệt độ cao vào trong quá trình sản xuất của các ngành công nghiệp đã giải quyết được nhiều vấn đề như hạn chế ô nhiễm môi trường, tiết kiệm năng lượng và bảo vệ được sức khoẻ người lao động cũng như tăng hiệu quả sản xuất. Tuy nhiên, vấn đề đặt ra là cần thiết phải có được nguồn cellulase hoạt động ở điều kiện pH và nhiệt độ thích hợp cho các quá trình sản xuất đó [95]. Hơn nữa, việc sản xuất cồn sinh học đang gặp một số khó khăn trong việc giảm chi phí sản xuất đặc biệt là nguồn cellulase để phân cắt cellulose thành glucose hiệu quả [62, 154]. Do đó, vấn đề quan trọng nhất là tìm ra được nguồn cellulase mới phù hợp với điều kiện sản xuất của các ngành công nghiệp liên quan, phát triển các phức hợp cellulase hiệu quả và ổn định để khắc phục khó khăn trong quá trình sản xuất.

Metagenomics là kỹ thuật cho phép thu nhận trực tiếp DNA đa hệ gen của toàn bộ các vi sinh vật trong môi trường sống nhất định [44, 121]. Chính vì lợi thế 18 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] là thu nhận và phân tích được tất cả hệ gen của vi sinh vật phong phú và đa dạng, đặc biệt là 99% vi sinh vật chưa nuôi cấy được [4] mà Metagenomics trở thành công cụ giúp các nhà nghiên cứu khai thác nguồn gen mới hiệu quả nhất. Thực tế đã chứng minh, sau 20 năm phát triển, đặc biệt là khoảng 5 năm gần đây, khi kỹ thuật giải mã gen thế hệ mới được áp dụng, Metagenomics đã được sử dụng rất hiệu quả để tìm hiểu sự đa dạng vi sinh vật cũng như khai thác các gen mới từ nhiều môi trường sống khác nhau như nước, đất, sinh vật (các đường tiêu hóa), phế thải, … Mối đóng một vai trò quan trọng đối với hệ sinh thái bởi khả năng phân hủy sinh khối lignocellulose và góp phần vào chu trình carbon. Khả năng phân hủy hiệu quả lignocellulose của mối là kết quả hoạt động tổng hợp của cellulase và hemicellulase được tiết ra từ bản thân mối và từ vi sinh vật sống trong ruột mối.

Trong đó, hệ vi sinh vật ruột mối đóng vai trò quan trọng trong việc tiêu hóa hiệu quả nguồn thức ăn lignocellulose của mối [16, 68]. Vì vậy, vi sinh vật ruột mối mang nguồn gen mã hóa enzyme phong phú cần được khai thác nhằm tìm ra các cellulase mới liên quan đến sự phân hủy cellulose. Ở Việt Nam, cho đến nay, hơn 100 loài mối khác nhau đã được mô tả [1, 45]. Tuy nhiên, hệ vi sinh vật của chúng vẫn chưa được nghiên cứu.

Vì thế toàn bộ hệ enzyme thủy phân lignocellulose có nguồn gốc từ vi sinh vật trong ruột mối cũng chưa được điều tra và khảo sát. Với đặc điểm đặc trưng của quần xã vi sinh vật sống trong ruột mối và vai trò của chúng giúp vật chủ phân hủy thức ăn, quần xã vi sinh vật ở mối bậc thấp được xem là nguồn khai thác gen cellulase mới lý tưởng sử dụng trong quá trình thủy phân cellusose. Mặc dù, trên thế giới cũng đã có nhiều nghiên cứu về gen cellulase của vi sinh vật ruột mối bậc thấp, nhưng tất cả đều tập trung nghiên cứu sự đa dạng của động vật nguyên sinh và nguồn gen của chúng, rất ít nghiên cứu nào đánh giá sự đa dạng của vi khuẩn cũng như sự đa dạng gen cellulase của chúng ở môi trường ruột mối bậc thấp. Chính vì vậy, bằng kỹ thuật Metagenomics với hướng tiếp cận là giải trình tự đa hệ gen, chúng tôi lựa chọn đối tượng là vi khuẩn ruột mối bậc thấp thuộc chi Coptotermes để thực hiện đề tài “Nghiên cứu gen mã hóa enzyme tham gia thủy phân cellulose từ khu hệ vi khuẩn ruột mối bằng kỹ thuật Metagenomics”.

19 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Mục tiêu của đề tài Phân lập, tách dòng và biểu hiện được 1 gen mã hóa cellulase từ DNA đa hệ gen vi khuẩn ruột mối bằng kỹ thuật Metagenomics. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu Đối tượng là vi khuẩn ruột mối thuộc chi Coptotermes. Mối do Viện Sinh thái và Bảo vệ công trình cung cấp.

Nội dung nghiên cứu (1) Tách chiết DNA đa hệ gen của vi khuẩn ruột mối Coptotermes. (2) Giải trình tự và xử lý trình tự DNA đa hệ gen. (3) Từ bộ dữ liệu trình tự DNA đa hệ gen, dự đoán gen và chú thích gen theo hai khía cạnh là đa dạng sinh vật và chức năng. (4) Chọn 1 trình tự gen để thiết kế mồi, phân lập, tách dòng và biểu hiện.

(5) Xác định đặc điểm của sản phẩm biểu hiện gen phân lập được. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án Ý nghĩa khoa học (1) Đã phân lập, tách dòng và biểu hiện được 1 gen mã hóa endoglucanase từ DNA đa hệ gen của vi khuẩn ruột mối Coptotermes gestroi. (2) Đã đánh giá được sự đa dạng vi khuẩn và đa đạng gen cellulase của vi khuẩn sống trong ruột mối C. gestroi ở Việt Nam.

Ý nghĩa thực tiễn Góp phần đánh giá tiềm năng và khả năng sử dụng nguồn gen mã hóa endoglucanase từ vi khuẩn ruột mối C. gestroi ở Việt Nam vào quá trình phân giải cơ chất cellulose thuộc một số lĩnh vực trong các ngành công nghiệp. Đóng góp mới của đề tài (1) Đây là nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam ứng dụng kỹ thuật Metagenomics để tìm hiểu sự đa dạng vi khuẩn trong ruột mối Coptotermes và bước đầu phân lập được gen mã hóa protein có hoạt tính endoglucanase từ DNA đa hệ gen vi khuẩn ruột mối C. 20 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Chƣơng 1.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ LIGNOCELLULOSE Lignocellulose là thành phần chính có trong gỗ và phế phụ phẩm nông nghiệp như rơm rạ, vỏ trấu, lõi ngô, cỏ kê. Lignocellulose cấu tạo chủ yếu từ 3 thành phần cơ bản là cellulose, hemicellulose và lignin [103, 107] (Bảng 1. Thực Sợi to vật Tế bào sợi nhỏ Thành tế bào Cellulose tinh thể Hình 1.

Cấu trúc của lignocellulose [107]. Cellulose là thành phần chiếm tỷ lệ cao nhất, được cấu tạo từ các phân tử glucose. Hemicellulose được cấu tạo từ các đơn phân là đường 5 và 6 carbon như arabinose, galactose, glucose, mannose và xylose. Lignin được cấu tạo từ 3 thành phần chính là p-coumaryl alcohol (H), coniferyl alcohol (G) và sinapyl alcohol (S).

21 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Các thành phần này polyme hóa để tổng hợp lignin và tỷ lệ của chúng khác nhau ở các thực vật khác nhau. Tỷ lệ của cellulose, hemicellulose và lignin trong sinh khối lignocellulose [123]. Nguồn lignocellulose Cellulose (%) Hemicellulose (%) Lignin (%) Gỗ cứng 40-55 24-40 18-25 Gỗ mềm 45-50 25-35 25-35 Vỏ hạt 25-30 25-30 30-40 Lõi bắp ngô 45 35 15 Cỏ 25-40 35-50 10-30 Rơm lúa mì 30 50 15 Rơm lúa 32,1 24 18 Lá 15-20 80-85 0 1. Cellulose Cellulose là một hợp chất hữu cơ có ở tất các cả các loài thực vật và một số loài động vật nguyên sinh, một số động vật biển, vi khuẩn và nấm [118], đặc biệt, ở thực vật, cellulose là phần cấu tạo chính [105, 120].

Do đó, cellulose được xem là hợp chất hữu cơ tự nhiên có mặt nhiều nhất trên trái đất [32, 118]. Ước tính, mỗi năm, trên toàn thế giới có khoảng 1014 kg (khoảng 100.000 tỷ tấn) cellulose được tạo ra [105]. Cấu trúc cơ bản của cellulose là các sợi nhỏ. Mỗi sợi nhỏ gồm nhiều chuỗi polysaccharide không phân nhánh xếp song song và liên kết với nhau bằng liên kết hydro [105, 118].

Trong đó, mỗi chuỗi polysaccharide được cấu tạo từ các đơn phân là D-glucopyranose (hay còn gọi là D-glucose). Các đơn phân nối với nhau bằng liên kết β-1,4-glycoside (Hình 1. Ở mỗi chuỗi đều có một đầu không khử mang cấu trúc vòng khép kín và một đầu khử mang một cấu trúc aldehyde béo (Hình 1.2) tạo nên chuỗi cellulose có tính phân cực. Chính vì vậy, chuỗi cellulose có thể thêm các đơn phân glucose mới để kéo dài chuỗi từ đầu không khử [28].

Mỗi chuỗi cellulose đều có vùng tinh thể và vùng vô định hình (Hình 1. Trong đó, vùng tinh 22 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] thể được tạo thành nhờ các liên kết β-1,4-glycoside trong mỗi chuỗi polysaccharide, các liên kết hydro và lực Van der Waal giữa các chuỗi polysaccharide cũng như giữa các sợi nhỏ ở cạnh nhau. Các liên kết này giúp cho cấu trúc tinh thể rất ổn định, vững chắc và bền nhiệt nên không một loại enzyme nào cũng như nước có thể xâm nhập vào cellulose [28, 33, 105, 118]. Còn vùng vô định hình thì ngược lại, các liên kết trên bị phá vỡ nên các phân tử kết hợp không chặt chẽ.

Tuy nhiên, các chuỗi polysacharide ở vùng này được bố trí xoắn so le nên cùng với vùng tinh thể tạo thành một cấu trúc cellulose tổng thể rất vững chắc [33]. Cellulose vô Cellulose Cellulose vô định hình tinh thể định hình Đầu không khử, hình thành Đầu khử, C1 tự do liên kết glycoside ở C1 Hình 1. Cấu trúc tinh thể và vô định hình của cellulose. Cấu trúc tinh thể được ổn định nhờ các liên kết hydro và lực Van der Waal, trong vùng cấu trúc vô định hình các chuỗi polysaccharide xoắn làm thay đổi sự sắp xếp có trật tự trong cấu trúc [33].