Nghiên Cứu Đặc Điểm Cấu Trúc và Hoạt Tính Sinh Học Của Fucoidan Từ Rong Nâu Việt Nam

Nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan từ rong nâu Việt Nam, khám phá tiềm năng ứng dụng trong y học và dinh dưỡng.

• Tác giả: Bùi Văn Nguyên
• Người hướng dẫn: PGS. Bùi Minh Lý
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ
• Chuyên ngành: Hóa học các hợp chất thiên nhiên
• Đề tài: Nghiên Cứu Đặc Điểm Cấu Trúc Và Hoạt Tính Sinh Học Của Fucoidan Từ Một Số Loài Rong Nâu Việt Nam
• Loại tài liệu: luận án tiến sỹ
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
• MỞ ĐẦU
• 1.1. Tổng quan về rong nâu
• 1.2. Giới thiệu về rong biển
• 1.3. Giới thiệu về Rong Nâu
• 1.4. Phân loại và phân bố rong nâu trên thế giới
• 1.5. Phân loại và phân bố rong nâu ở Việt Nam
• 1.6. Thành phần hóa học của rong Nâu
• 1.6.1. Hợp chất phenolic
• 1.6.2. Hợp chất carotenoid
• 1.6.3. Hợp chất Terpenoid
• 1.6.4. Các hợp chát khác
• 1.7. Tổng quan về Sulfated polysaccharide (Fucoidan)
• 1.7.1. Giới thiệu chung về Fucoidan
• 1.7.2. Thành phần hóa học của fucoidan trong một số loài rong nâu
• 1.7.3. Cấu trúc hóa học của fucoidan
• 1.7.4. Tính chất hóa lý của fucoidan
• 1.7.5. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của fucoidan
• 1.7.5.1. Hoạt tính chống đông tụ máu và chống huyết khối
• 1.7.5.2. Hoạt tính chống virus
• 1.7.5.3. Hoạt tính kháng u và điều hòa miễn dịch
• 1.7.5.4. Hoạt tính chống oxy hóa
• 1.7.5.5. Kháng viêm
• 1.7.5.6. Chống lại các bệnh về gan
• 1.7.5.7. Hoạt tính kháng khuẩn
• 1.7.5.8. Tác dụng giảm lượng đường huyết trong máu
• 1.7.5.9. Các ứng dụng của fucoidan
• 1.8. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam liên quan đến nội dung nghiên cứu của luận án
• 1.8.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
• 1.8.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
• 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Phương pháp chiết tách và phân đoạn fucoidan
• 2.2.1.1. Phương pháp tách chiết fucoidan
• 2.2.1.2. Phương pháp phân đoạn fucoidan
• 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu cấu trúc của fucoidan
• 2.2.2.1. Phương pháp phân tích liên kết bằng methyl hóa
• 2.2.2.2. Phương pháp sắc ký thẩm thấu gel (GPC)
• 2.2.2.3. Phương pháp phổ IR
• 2.2.2.4. Phương pháp phổ NMR
• 2.2.2.5. Phương pháp phổ MS
• 2.2.2.6. Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS)
• 2.2.3. Phương pháp thử hoạt tính sinh học
• 2.2.3.1. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào in vitro
• 2.2.3.2. Phương pháp đánh giá khả năng ức chế sự phát triển của khối tế bào ung thư trên thạch mềm
• 2.2.3.3. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính chống đông tụ máu
• 2.2.4. Thu thập và xử lý rong
• 2.2.5. Chiết tách và phân lập fucoidan từ rong nâu
• 2.2.6. Xác định thành phần và cấu trúc của fucoidan
• 2.2.6.1. Xác định hàm lượng tổng carbohydrate
• 2.2.6.2. Xác định thành phần monosaccharide
• 2.2.6.3. Xác định hàm lượng sulfate
• 2.2.6.4. Phương pháp khử sulfate
• 2.2.6.5. Xác định hàm lượng axít uronic
• 2.2.6.6. Phân tích liên kết bằng methyl hóa
• 2.2.6.7. Thủy phân tạo oligosaccharide
• 2.2.6.8. Sắc ký thẩm thấu gel (GPC)
• 2.2.6.9. Phổ ESI-MS/MS
• 2.2.6.10. Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS)
• 2.2.7. Đánh giá hoạt tính sinh học
• 2.2.7.1. Hoạt tính gây độc tế bào
• 2.2.7.2. Thử nghiệm hoạt tính ức chế hình thành khối u ba chiều trên thạch mềm
• 2.2.7.3. Thử nghiệm hoạt tính chống đông tụ máu
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Nghiên cứu lựa chọn phương pháp chiết tách fucoidan
• 3.2. Hàm lượng fucoidan và một số polysaccharide tan trong nước của 06 loài rong nâu sinh trưởng ở biển Nha Trang, thành phần hóa học của các fucoidan thu được
• 3.3. Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc của các fucoidan từ hai loài rong nâu S
• 3.3.1. Nội dung và kết quả nghiên cứu loài Sargassum binderi
• 3.3.2. Nội dung và kết quả nghiên cứu loài Sargassum duplicatum
• 3.4. Nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan phân lập từ rong nâu Sargassum aquifolium
• 3.4.1. Chiết xuất và làm sạch fucoidan
• 3.4.2. Xác định cấu trúc của fucoidan
• 3.4.2.1. Tách loại các nhóm sulfat (Desulfation)
• 3.4.2.2. Phổ NMR của FSA và các phân đoạn sắc ký anion của FSA
• 3.4.2.3. Phân tích liên kết bằng methyl hóa (Methylation analysis)
• 3.4.2.4. Tách 1,0M-deS trên cột sắc ký trao đổi anion
• 3.4.2.5. Các đặc điểm cấu trúc của deS-2 và deS-3
• 3.4.2.6. Các đặc điểm cấu trúc của deS-4
• 3.4.2.7. Các đặc điểm cấu trúc của deS-6
• 3.4.2.8. Các đặc điểm cấu trúc của deS-5
• 3.4.3. Nghiên cứu một số đặc điểm cấu trúc của phân đoạn FSA-1,5M bằng phương pháp phân tích methyl hóa kết hợp với phổ ESI-MS/MS
• 3.4.4. Đánh giá hoạt tính sinh học
• 3.4.4.1. Hoạt tính gây độc tế bào
• 3.4.4.2. Hoạt tính chống khối u in vitro
• 3.4.4.3. Hoạt tính chống đông tụ máu
• 3.5. Nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính gây độc tế bào của các fucoidan phân lập từ rong nâu Turbinaria decurrens
• 3.5.1. Chiết xuất, phân đoạn và xác định thành phần của các fucoidan từ rong nâu Turbinaria decurrens
• 3.5.2. Xác định cấu trúc của FTD-2,0N phân lập từ rong nâu Turbinaria decurrens
• 3.5.3. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của FTD-2,0M
• 3.6. Nghiên cứu kích thước và hình dáng của 6 fucoidan phân lập từ rong nâu Việt Nam, phân tích liên hệ của chúng với hoạt tính gây độc tế bào
• 3.6.1. Nghiên cứu kích thước và hình dáng của các fucoidan bằng phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ
• 3.6.2. Liên hệ giữa các đặc điểm cấu trúc của các mẫu fucoidan với hoạt tính gây đốc tế bào
• CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Fucoidan Từ Rong Nâu Việt Nam

Nghiên cứu về Fucoidan từ rong nâu Việt Nam đang thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học. Fucoidan là một loại polysaccharide sulfated có nhiều hoạt tính sinh học quý giá. Rong nâu, với sự đa dạng về loài và cấu trúc, là nguồn nguyên liệu phong phú cho việc chiết xuất Fucoidan. Nghiên cứu này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cấu trúc hóa học của Fucoidan mà còn mở ra nhiều ứng dụng trong y học và công nghiệp.

1.1. Đặc Điểm Cấu Trúc Của Fucoidan Từ Rong Nâu

Cấu trúc của Fucoidan rất phức tạp, bao gồm nhiều loại monosaccharide khác nhau như fucose, galactose và sulfate. Sự đa dạng này tạo ra nhiều hoạt tính sinh học khác nhau, từ kháng viêm đến chống ung thư.

1.2. Vai Trò Của Rong Nâu Trong Nghiên Cứu Fucoidan

Rong nâu không chỉ là nguồn nguyên liệu chính để chiết xuất Fucoidan mà còn cung cấp các hợp chất khác có hoạt tính sinh học. Việc khai thác và nghiên cứu rong nâu có thể mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe con người.

II. Thách Thức Trong Nghiên Cứu Fucoidan Từ Rong Nâu

Mặc dù có nhiều nghiên cứu về Fucoidan, nhưng vẫn còn nhiều thách thức trong việc xác định cấu trúc và hoạt tính sinh học của nó. Các phương pháp chiết xuất và phân tích hiện tại chưa đủ để làm rõ mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của Fucoidan.

2.1. Khó Khăn Trong Việc Chiết Xuất Fucoidan

Quá trình chiết xuất Fucoidan từ rong nâu thường gặp khó khăn do sự đa dạng trong cấu trúc và thành phần hóa học của rong biển. Điều này đòi hỏi các phương pháp chiết xuất tiên tiến hơn.

2.2. Thiếu Thông Tin Về Hoạt Tính Sinh Học

Nhiều nghiên cứu hiện tại chỉ tập trung vào Fucoidan thô mà không xem xét kỹ lưỡng hoạt tính sinh học của các phân đoạn khác nhau. Điều này dẫn đến việc thiếu thông tin về mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Fucoidan Từ Rong Nâu

Để nghiên cứu Fucoidan, các phương pháp chiết xuất và phân tích hiện đại được áp dụng. Các phương pháp này giúp xác định cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học của Fucoidan một cách chính xác hơn.

3.1. Phương Pháp Chiết Xuất Fucoidan

Phương pháp chiết xuất Fucoidan từ rong nâu thường sử dụng dung môi nước nóng hoặc dung dịch kiềm. Các phương pháp này giúp tối ưu hóa hàm lượng Fucoidan thu được.

3.2. Phân Tích Cấu Trúc Hóa Học Của Fucoidan

Các kỹ thuật như NMR, IR và sắc ký gel được sử dụng để phân tích cấu trúc hóa học của Fucoidan. Những phương pháp này giúp xác định các liên kết glycoside và vị trí nhóm sulfate.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Fucoidan Trong Y Học

Fucoidan có nhiều ứng dụng trong y học, từ việc điều trị ung thư đến kháng viêm. Nghiên cứu cho thấy Fucoidan có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư và hỗ trợ hệ miễn dịch.

4.1. Tác Dụng Chống Ung Thư Của Fucoidan

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng Fucoidan có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư, đặc biệt là ung thư gan và ung thư phổi. Điều này mở ra hướng đi mới trong điều trị ung thư.

4.2. Hoạt Tính Kháng Viêm Của Fucoidan

Fucoidan cũng cho thấy hoạt tính kháng viêm mạnh mẽ, giúp giảm viêm nhiễm và hỗ trợ quá trình hồi phục. Điều này làm cho Fucoidan trở thành một lựa chọn tiềm năng trong điều trị các bệnh viêm.

V. Kết Luận Về Nghiên Cứu Fucoidan Từ Rong Nâu

Nghiên cứu về Fucoidan từ rong nâu Việt Nam đang mở ra nhiều cơ hội mới trong lĩnh vực y học và công nghiệp. Tuy nhiên, cần tiếp tục nghiên cứu để làm rõ hơn về cấu trúc và hoạt tính sinh học của Fucoidan.

5.1. Tương Lai Của Nghiên Cứu Fucoidan

Với sự phát triển của công nghệ, nghiên cứu về Fucoidan hứa hẹn sẽ mang lại nhiều ứng dụng mới trong y học và công nghiệp thực phẩm. Cần có thêm nhiều nghiên cứu để khai thác tối đa tiềm năng của Fucoidan.

5.2. Khuyến Khích Nghiên Cứu Thêm Về Fucoidan

Cần khuyến khích các nhà khoa học tiếp tục nghiên cứu về Fucoidan để hiểu rõ hơn về cấu trúc và hoạt tính sinh học của nó. Điều này sẽ giúp phát triển các sản phẩm mới từ rong nâu.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Việt Nam sở hữu đường bờ biển dài khoảng 3.260 km với diện tích mặt nước rộng lớn và tính đa dạng sinh học cao, trong đó nguồn tài nguyên rong biển ước tính có gần 1.000 loài. Riêng ngành rong nâu (Phaeophyta) có khoảng 143 loài, đặc trưng bởi kích thước cá thể lớn và sinh khối tự nhiên phong phú. Rong nâu là nguồn nguyên liệu tự nhiên quan trọng để chiết tách các hợp chất có hoạt tính sinh học cao như hợp chất phenolic, phlorotannin, carotenoid (fucoxanthin), terpenoid và đặc biệt là nhóm polysaccharide bao gồm alginate, laminaran và fucoidan.

Trong số các hợp chất polysaccharide từ rong nâu, fucoidan (anionic sulfated polysaccharide) là đối tượng thu hút sự quan tâm lớn nhờ sở hữu nhiều hoạt tính sinh học giá trị như chống đông tụ máu, kháng huyết khối, kháng virus (bao gồm virus cúm, virus herpes simplex, HIV), điều hòa miễn dịch, chống oxy hóa và ức chế sự phát triển của tế bào ung thư. Tuy nhiên, cấu trúc hóa học của fucoidan rất phức tạp và không đồng nhất: mạch polymer được cấu tạo chủ yếu từ các gốc L-fucose sulfat hóa kết hợp cùng nhiều loại monosaccharide khác (galactose, mannose, xylose, glucose, axít uronic), có độ phân nhánh cao và các nhóm thế sulfate được bố trí ở nhiều vị trí khác nhau.

Phần lớn các nghiên cứu về hoạt tính sinh học trước đây chỉ được tiến hành trên các chế phẩm fucoidan thô hoặc hỗn hợp chưa tinh chế hoàn toàn. Mối quan hệ giữa cấu trúc hóa học tinh vi (như trật tự liên kết glycoside, vị trí nhóm sulfate, khối lượng phân tử, hình thái không gian) và hoạt tính sinh học của fucoidan từ các loài rong nâu nhiệt đới tại Việt Nam vẫn chưa được làm sáng tỏ một cách có hệ thống. Việc giải mã cấu trúc phân tử chính xác là điều kiện quyết định để hiểu rõ cơ chế tác dụng sinh học và định hướng ứng dụng fucoidan trong lĩnh vực y dược học.

Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu tổng quát của luận án là nghiên cứu phân lập, xác định các đặc điểm cấu trúc và thử nghiệm hoạt tính sinh học của các fucoidan từ một số loài rong nâu sinh trưởng ở vùng biển Việt Nam, nhằm phục vụ công tác điều tra tài nguyên hợp chất thiên nhiên biển và làm rõ bản chất hóa học của các đối tượng nghiên cứu.

Các nội dung nghiên cứu cụ thể bao gồm:

1. Sàng lọc một số loài rong nâu phân bố tại vùng biển Việt Nam để lựa chọn các đối tượng phù hợp cho nghiên cứu sâu về cấu trúc và hoạt tính sinh học.
2. Nghiên cứu sâu về cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học của các phân đoạn fucoidan tinh chế từ các loài rong nâu chọn lọc (Sargassum aquifolium, Turbinaria decurrens, Sargassum binderi, Sargassum duplicatum).
3. Khảo sát mối quan hệ giữa các đặc điểm cấu trúc (khối lượng phân tử, hàm lượng và vị trí nhóm sulfate, kích thước và hình thái không gian phân tử) với hoạt tính sinh học (gây độc tế bào ung thư, ức chế khối u, chống đông tụ máu) của các mẫu fucoidan.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu: Các mẫu rong nâu thuộc chi Sargassum (S. aquifolium, S. binderi, S. duplicatum, S. polycystum, S. mcclurei, S. oligocystum, S. denticarpum, S. swartzii) và chi Turbinaria (T. decurrens, T. ornata).
• Phạm vi không gian: Vùng biển tỉnh Khánh Hòa (gồm 4 khu vực chính: Vịnh Vân Phong, vùng ven biển Ninh Hòa - Đầm Nha Phu, Vịnh Nha Trang và khu vực Vịnh Cam Ranh - Đảo Bình Ba - Cam Lập).
• Phạm vi thời gian và chuyên ngành: Luận án Tiến sĩ Hóa học, chuyên ngành Hóa học các hợp chất thiên nhiên (Mã số: 9440117), bảo vệ năm 2018 tại Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trong và ngoài nước

Tổng quan tài liệu của luận án đã hệ thống hóa các nghiên cứu phân loại, hóa học và hoạt tính sinh học của rong nâu cùng hợp chất fucoidan từ các công trình kinh điển đến các công bố hiện đại:

1. Về phân loại và phân bố rong nâu:

   • Hệ thống phân loại chi Sargassum được J. Agardh xây dựng từ năm 1820 (với 62 loài), mở rộng vào năm 1824 (67 loài) và hoàn thiện vào năm 1889 (180 loài). Sau đó, Grunow (1915–1916) phát triển và mô tả 230 loài; Setchell (1931–1936) bổ sung 32 loài thuộc họ Sargassaceae tại Hồng Kông.
   • Thống kê hiện đại trên thế giới ghi nhận ngành rong nâu có hơn 1.500 loài thuộc 265 chi và 9 bộ, trong đó chi Sargassum có khoảng 562 loài được chấp nhận phân loại, chi Turbinaria có 28 loài, chi Dictyota có 76 loài và chi Padina có 39 loài (Tsutsui Isao et al., 2005).
   • Tại Việt Nam, các nghiên cứu của Nguyễn Văn Tú, Lê Như Hậu và cộng sự (2013) ghi nhận nguồn lợi rong biển phong phú với hơn 800 loài, trong đó có khoảng 143–180 loài rong nâu. Tại vùng biển Khánh Hòa, thống kê ghi nhận 21 loài thuộc chi Sargassum, 4 loài thuộc chi Turbinaria, 9 loài thuộc chi Dictyota và 3 loài thuộc chi Padina.

2. Về thành phần hóa học của rong nâu:

   • Rong nâu chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học gồm hợp chất phenolic (phlorotannin như phloroglucinol, eckol, dieckol, 8,8'-bieckol, 6,6'-bieckol, dioxinodehydroeckol; các bromophenol); carotenoid (fucoxanthin, violaxanthin, antheraxanthin, neoxanthin, lutein, zeaxanthin); terpenoid (sargaquinone, sargaquinoic acid, atomarianone A/B, taondiol); và polysaccharide (alginate, laminaran, fucoidan).
   • Alginate là polymer tạo bởi các khối homopolymeric (Poly-G, Poly-M) và heteropolymeric (Poly-MG) của axít D-mannuronic (dạng ghế $^4C_1$) và axít L-guluronic (dạng ghế $^1C_4$). Laminaran là dự trữ glucan với khung liên kết chính $\beta$-(1→3) và các nhánh $\beta$-(1→6).

3. Về cấu trúc và hoạt tính sinh học của Fucoidan:

   • Fucoidan được Kylin phát hiện lần đầu tiên vào năm 1913 từ loài Laminaria digitata. Cấu trúc fucoidan của Fucus vesiculosus từng được Percival và Ross (1950) mô tả có mạch chính liên kết $\alpha$-(1→2) và nhánh $\alpha$-(1→3) với nhóm sulfate ở C-4. Đến năm 1993, Patankar và cộng sự đã chứng minh mạch chính của fucoidan từ loài này thực chất là liên kết $\alpha$-(1→3).
   • Nhiều công trình quốc tế đã khảo sát hoạt tính của fucoidan:
     • Chống đông máu và chống huyết khối: Nghiên cứu của Nishino và cs. trên Ecklonia kurome, Hizikia fusiforme; Duarte và cs., Silva và cs. (2005) chỉ ra rằng hoạt tính phụ thuộc vào vị trí sulfate hóa tại C-2 hoặc C-2, C-3, độ dài mạch polymer và tỷ lệ sulfate/đường.
     • Kháng u và điều hòa miễn dịch: Fucoidan từ Fucus vesiculosus, Laminaria japonica, Undaria pinnatifida (Mekabu) có khả năng ức chế tế bào ung thư gan QGY7703, dòng u lympho HS-Sultan, ung thư vú MDA-MB-231, kích thích đại thực bào và tế bào giết tự nhiên NK, gia tăng sản sinh cytokine (IL-1, IFN-$\gamma$, TNF-$\alpha$, IL-6) (Choi et al., 2005).
     • Kháng virus: Fucoidan từ Adenocytis utricularis, Undaria pinnatifida, Stoechospermum marginatum ức chế virus HSV-1, HSV-2, poliovirus và HIV mà không gây độc tế bào.

Nhóm hợp chất / Dược lý	Tác giả / Nguồn tài liệu tiêu biểu	Phát hiện chính đã công bố
Phân loại rong nâu	J. Agardh (1889), Grunow (1915), Setchell (1936), Lê Như Hậu (2013)	Xác lập hệ thống phân loại chi Sargassum, ghi nhận sự phân bố phong phú tại vùng biển Khánh Hòa.
Mô hình cấu trúc Fucoidan	Kylin (1913), Percival & Ross (1950), Patankar et al. (1993)	Làm sáng tỏ sự chuyển đổi từ mô hình liên kết $\alpha$-(1→2) sang $\alpha$-(1→3) có sulfate hóa ở vị trí C-4.
Hoạt tính chống đông máu	Nishino et al. (1991), Duarte et al. (2001), Silva et al. (2005)	Khẳng định vai trò quyết định của nhóm 2-O-sulfate, 2,3-di-O-sulfate và mật độ sulfate đối với chỉ số APTT/TT.
Hoạt tính kháng u & miễn dịch	Choi et al. (2005), Liu et al. (2005), Maruyama et al. (2003)	Chứng minh khả năng ức chế khối u trực tiếp (apoptosis) và gián tiếp qua kích hoạt đại thực bào, Th1, NK cells.

Khoảng trống luận án lựa chọn giải quyết

Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu về fucoidan từ rong nâu vùng biển ôn đới và hàn đới, các loài rong nâu nhiệt đới sinh trưởng tại Việt Nam (Sargassum aquifolium, Turbinaria decurrens, Sargassum binderi...) vẫn chưa được phân tích cấu trúc giải trình tự và liên kết glycoside chi tiết. Luận án giải quyết khoảng trống này bằng việc kết hợp các phương pháp quang phổ hiện đại và kỹ thuật tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS) để thiết lập tương quan giữa cấu trúc phân tử, hình thái không gian và hoạt tính sinh học.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

Luận án vận dụng lý thuyết hóa học các hợp chất thiên nhiên và hóa học carbohydrate phức tạp:

• Khái niệm về anionic sulfated heteropolysaccharide: cấu tạo từ fucose mạch nhánh kết hợp các monosaccharide khác, gắn các gốc ester sulfate ($-OSO_3^-$) và nhóm acetyl.
• Cơ chế phản ứng khử sulfate (desulfation) bằng phương pháp solvolysis nhằm đưa phân tử về dạng trung hòa giúp giải mã tín hiệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân.
• Lý thuyết phân mảnh khối phổ ion hóa phun mù điện tử đa bậc (ESI-MS/MS) dạng ion âm đối với các ion oligosaccharide sulfate hóa.
• Khung phân tích cấu trúc không gian dựa trên lý thuyết tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS): đồ thị Kratky để xác định dạng hình học phân tử và đồ thị Guinier của mặt cắt ngang để tính bán kính hồi chuyển mặt cắt ngang ($R_{gc}$).

Phương pháp thực nghiệm chiết tách và phân tích cấu trúc

1. Thu thập và xử lý mẫu rong: Mẫu rong nâu được thu thập tại vùng biển Khánh Hòa, được giám định danh pháp thực vật học bởi TS. Lê Như Hậu, sau đó rửa sạch, phơi/sấy khô và nghiền nhỏ.
2. Chiết xuất và phân đoạn:
   • Chiết tách phân đoạn polysaccharide tan trong nước nóng và acid loãng theo quy trình cải tiến và quy trình bảo hộ sáng chế (Patent WO 2005/014657).
   • Tủa chọn lọc bằng cồn (EtOH) và chất hoạt động bề mặt cation Cetavlon (Hexadecyltrimethylammonium bromide).
   • Phân đoạn fucoidan bằng sắc ký trao đổi anion (CC) trên cột chất nền DEAE-Cellulose hoặc DEAE-Sephacel, rửa giải từng bước (stepwise) bằng dung dịch NaCl có nồng độ tăng dần từ 0,5M; 1,0M; 1,5M đến 2,0M.
3. Phân tích thành phần hóa học:
   • Định lượng tổng lượng carbohydrate bằng phương pháp so màu Phenol - $H_2SO_4$.
   • Định lượng hàm lượng sulfate bằng phương pháp đo độ đục với bari clorua ($BaCl_2$) - gelatin hoặc phương pháp chuẩn độ sau khi thủy phân bằng TFA.
   • Định lượng axít uronic bằng phương pháp so màu với m-hydroxydiphenyl.
   • Thành phần monosaccharide (Fuc, Gal, Man, Glc, Xyl) được xác định bằng sắc ký khí (GC-FID) và sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) dưới dạng các dẫn xuất alditol axetat.
4. Phương pháp nghiên cứu cấu trúc phân tử:
   • Phản ứng phân tích liên kết bằng methyl hóa (Methylation analysis): Methyl hóa toàn phần bằng phương pháp Hakomori/Ciucanu-Kerek, thủy phân bằng axít, khử bằng $NaBD_4$, acetyl hóa tạo dẫn xuất alditol axetat bị methyl hóa một phần (PMAA), phân tích liên kết glycoside qua GC-MS.
   • Phương pháp khử sulfate (Desulfation): Chuyển mẫu sang dạng muối pyridinium và xử lý trong môi trường DMSO/MeOH khan để loại bỏ chọn lọc nhóm sulfate.
   • Sắc ký lọc gel/thẩm thấu gel (GPC): Xác định phân bố và khối lượng phân tử trung bình ($M_w$).
   • Phương pháp phổ hồng ngoại (FT-IR): Xác định các nhóm chức đặc trưng, dao động liên kết C-O-S và $S=O$ của nhóm ester sulfate ($1240–1255\text{ cm}^{-1}$ và $840–850\text{ cm}^{-1}$).
   • Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Ghi phổ $^1\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR 1D và các phổ 2D tương tác dị hạt nhân (COSY, TOCSY, HSQC, HMBC, NOESY) ở nhiệt độ phòng hoặc nhiệt độ nâng cao để gán các độ dịch chuyển hóa học ($\delta$, ppm).
   • Phương pháp phổ khối ESI-MS/MS: Phân tích các phân đoạn oligosaccharide sau khi thủy phân nhẹ nhằm xác định trật tự mạch đường và vị trí định vị nhóm sulfate.
   • Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS): Thực hiện đo mẫu trong dung dịch nước và dung dịch NaCl 0,5M để xác định kích thước, hình dạng chuỗi polymer và bán kính hồi chuyển mặt cắt ngang ($R_{gc}$).

Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học

1. Hoạt tính gây độc tế bào in vitro: Thử nghiệm trên các dòng tế bào ung thư ở người gồm ung thư biểu mô gan (Hep-G2), ung thư mô liên kết (RD) và ung thư biểu mô phổi (LU-1). Đánh giá tỷ lệ tế bào sống sót (Cell Survival - CS) và xác định nồng độ ức chế 50% ($IC_{50}$) theo phương pháp đo độ hấp thụ quang học.
2. Khả năng ức chế khối u trên thạch mềm (Soft Agar Assay): Đánh giá khả năng ức chế sự hình thành và phát triển của các quần thể/khối tế bào ung thư gan Hep-G2 ba chiều trong môi trường nuôi cấy thạch mềm.
3. Hoạt tính chống đông tụ máu: Xác định thời gian đông máu in vitro thông qua xét nghiệm thời gian thromboplastin từng phần hoạt hóa (APTT) và thời gian thromboplastin (TT) trên huyết tương người, sử dụng heparin làm chất đối chứng.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan về rong nâu và Sulfated Polysaccharide (Fucoidan)

Chương này tổng kết toàn diện các công trình nghiên cứu trên thế giới và tại Việt Nam về nguồn tài nguyên rong nâu, các nhóm hoạt chất thứ cấp và polymer sinh học. Tác giả trình bày chi tiết về cấu trúc phân tử của alginate (các dạng khối Poly-G, Poly-M, Poly-MG với khoảng cách không gian 8,7 Å, 10,35 Å và 9,5 Å), laminaran (1,3-$\beta$-D-glucan) và fucoidan.

Chương 1 cung cấp dữ liệu phân bố của 4 chi rong nâu chủ yếu tại Khánh Hòa (Dictyota, Padina, Turbinaria, Sargassum) trên 4 vùng khảo sát thực địa (Vịnh Vân Phong, Ninh Hòa - Đầm Nha Phu, Vịnh Nha Trang, Vịnh Cam Ranh). Đồng thời, tác giả tổng kết thành phần hóa học, khối lượng phân tử và các hoạt tính sinh học của fucoidan được công bố trên các tạp chí quốc tế, nhấn mạnh vào các cơ chế chống đông máu gián tiếp qua antithrombin/heparin cofactor II và cơ chế kích hoạt miễn dịch qua đại thực bào và tế bào lympho T.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết toàn bộ hóa chất, thiết bị và các quy trình thực nghiệm được triển khai trong luận án:

• Quy trình xử lý nguyên liệu rong nâu tươi, làm sạch tạp chất, chiết tách phân đoạn thô và phân đoạn tinh bằng sắc ký trao đổi anion (cột DEAE-Cellulose và DEAE-Sephacel).
• Kỹ thuật phân tích định lượng tổng carbohydrate, monosaccharide (chuẩn bị dẫn xuất alditol axetat), sulfate và axít uronic.
• Chi tiết các phản ứng hóa học biến đổi cấu trúc: methyl hóa phân tích liên kết glycoside (phương pháp Hakomori), phản ứng khử sulfate (desulfation) trong hỗn hợp DMSO - pyridin.
• Các điều kiện đo phổ: GPC xác định phân bố trọng lượng phân tử; phổ FT-IR; phổ NMR đa chiều ($^1\text{H}$, $^{13}\text{C}$, HSQC, HMBC) để xác định độ dịch chuyển hóa học; phổ khối ESI-MS/MS ở chế độ ion âm.
• Thiết lập hệ thống đo tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS), xử lý dữ liệu thực nghiệm qua đồ thị Kratky và đồ thị Guinier để trích xuất thông số $R_{gc}$.
• Quy trình thử nghiệm sinh học đối với tế bào Hep-G2, RD, LU-1, kỹ thuật tạo khối u 3D trên thạch mềm và quy trình đo thời gian đông máu APTT.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương này trình bày các phát hiện thực nghiệm của luận án qua các nội dung chính:

1. Sàng lọc và chiết tách fucoidan từ 06 loài rong nâu

Luận án tiến hành so sánh hàm lượng polysaccharide tan trong nước và hiệu suất thu nhận fucoidan từ 06 loài rong nâu thu hái tại vịnh Nha Trang (Sargassum polycystum, S. mcclurei, S. oligocystum, S. denticarpum, S. swartzii, Turbinaria ornata). Kết quả phân tích cho thấy hàm lượng polysaccharide và thành phần hóa học (fucose, galactose, mannose, xylose, sulfate, axít uronic) có sự biến đổi đáng kể giữa các loài rong khác nhau.

2. Đặc điểm cấu trúc fucoidan từ Sargassum binderi và Sargassum duplicatum

• Fucoidan chiết từ Sargassum binderi được phân tách trên cột DEAE-Cellulose thành các phân đoạn khác nhau. Phổ $^{13}\text{C}$-NMR của phân đoạn F2 xác nhận các tín hiệu đặc trưng của khung đường fucan sulfat hóa có nhánh.
• Fucoidan từ Sargassum duplicatum (FSDu) được tinh chế và phân tích bằng phổ hồng ngoại (IR) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H}$-NMR), xác định các nhóm chức sulfate đặc trưng tại vùng $1240\text{ cm}^{-1}$ và $840\text{ cm}^{-1}$.

3. Cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan từ Sargassum aquifolium

• Chiết xuất và phân đoạn: Fucoidan toàn phần (FSA) được phân tách qua cột DEAE-Sephacel thành các phân đoạn rửa giải bởi NaCl nồng độ khác nhau: FSA-1,0M, FSA-1,5M và FSA-2,0M.
• Giải mã cấu trúc phân tử:
  • Tác giả tiến hành khử sulfate phân đoạn FSA-1,0M thu được sản phẩm 1,0M-deS, sau đó tiếp tục tách trên cột sắc ký trao đổi anion DEAE-Sephacel thu được các phân đoạn tinh sạch: deS-2, deS-3, deS-4, deS-5 và deS-6.
  • Phân tích phổ HSQC, HMBC và phân tích liên kết bằng methyl hóa đã xác định chính xác các kiểu liên kết glycoside giữa các gốc $\alpha$-L-fucopyranose, $\beta$-D-galactopyranose và vị trí gắn nhóm sulfate trên khung phân tử.
  • Phân đoạn FSA-1,5M được phân tích bằng phổ khối ESI-MS/MS, ghi nhận các đỉnh ion phân mảnh âm đặc trưng: ion $[FucSO_3]^-$ ở $m/z\ 243$, $[Fuc_2SO_3]^-$ ở $m/z\ 389$, và ion dị thể $[FucGalSO_3]^-$ ở $m/z\ 405$.
• Thử nghiệm hoạt tính sinh học:
  • Phân đoạn fucoidan từ FSA thể hiện hoạt tính gây độc tế bào rõ rệt trên dòng tế bào ung thư gan Hep-G2, làm giảm tỷ lệ sống sót của tế bào theo nồng độ.
  • Trên mô hình nuôi cấy thạch mềm, chất thử làm suy giảm đáng kể kích thước trung bình và mật độ của các quần thể khối tế bào ung thư Hep-G2 ba chiều.
  • Thử nghiệm đông máu bằng phương pháp APTT cho thấy fucoidan từ S. aquifolium làm kéo dài thời gian đông máu phụ thuộc vào nồng độ và hàm lượng nhóm thế sulfate.

4. Cấu trúc và hoạt tính gây độc tế bào của fucoidan từ Turbinaria decurrens

• Fucoidan từ loài Turbinaria decurrens được chiết xuất và phân đoạn thu nhận mẫu FTD-2,0M (FTD-2,0N).
• Kết quả phổ FT-IR, phổ $^1\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR, HSQC, HMBC và phổ phân mảnh ESI-MS/MS (xuất hiện các ion $m/z\ 243$ và $m/z\ 405$) đã làm sáng tỏ khung cấu trúc phân nhánh của galactofucan sulfate.
• Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào khẳng định FTD-2,0N có tác dụng ức chế tăng trưởng tế bào ung thư biểu mô gan Hep-G2.

5. Kích thước, hình thái không gian bằng SAXS và tương quan cấu trúc - hoạt tính

• Luận án khảo sát kích thước và hình dáng của 06 mẫu fucoidan phân lập từ rong nâu Việt Nam (S. polycystum, S. mcclurei, S. oligocystum, S. denticarpum, S. swartzii, T. ornata) bằng phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS) trong nước và trong dung dịch NaCl 0,5M.
• Phân tích đồ thị Kratky và đồ thị Guinier của mặt cắt ngang cho phép xác định chính xác bán kính hồi chuyển mặt cắt ngang ($R_{gc}$) của các chuỗi phân tử polymer trong dung dịch.
• Tác giả thiết lập mối tương quan giữa hoạt tính gây độc tế bào (trên dòng Hep-G2 và RD) với:
  • Khối lượng phân tử trung bình ($M_w$).
  • Hàm lượng sulfate và tỷ lệ sulfate/đường.
  • Bán kính hồi chuyển mặt cắt ngang $R_{gc}$.

Mẫu Fucoidan / Loài rong	Phương pháp phân tích cấu trúc chính	Các mảnh ion ESI-MS/MS / Thông số SAXS đặc trưng	Hoạt tính sinh học ghi nhận
FSA (S. aquifolium)	Khử sulfate, sắc ký DEAE-Sephacel, NMR 2D (HSQC, HMBC), GC-MS	Ion $[FucSO_3]^-$ ($m/z$ 243), $[Fuc_2SO_3]^-$ ($m/z$ 389), $[FucGalSO_3]^-$ ($m/z$ 405)	Ức chế tế bào Hep-G2, ức chế khối u 3D trên thạch mềm, kéo dài thời gian APTT.
FTD (T. decurrens)	FT-IR, NMR 1D/2D, ESI-MS/MS, phân tích methyl hóa	Ion mảnh $[FucSO_3]^-$ ($m/z$ 243), $[FucGalSO_3]^-$ ($m/z$ 405)	Gây độc và ức chế sự phát triển tế bào ung thư gan Hep-G2.
06 mẫu Fucoidan rong nâu	SAXS (đồ thị Kratky, Guinier trong NaCl 0,5M), GPC, GC-FID	Bán kính hồi chuyển mặt cắt ngang $R_{gc}$; khối lượng phân tử trung bình $M_w$	Hoạt tính độc tế bào trên Hep-G2 và RD tỷ lệ thuận với tỷ lệ sulfate/đường và $R_{gc}$.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới về mặt khoa học và thực tiễn

Căn cứ trên các dữ liệu thực nghiệm được trình bày trong luận án, các đóng góp mới bao gồm:

1. Về phương pháp luận và quy trình chiết tách: Xây dựng và chuẩn hóa quy trình phân tách, tinh chế fucoidan từ nhiều loài rong nâu biển Việt Nam bằng sắc ký trao đổi anion (DEAE-Cellulose/DEAE-Sephacel) kết hợp phản ứng khử sulfate chọn lọc, tạo tiền đề để phân tích chính xác các cấu trúc sulfated polysaccharide phức tạp.
2. Về dữ liệu cấu trúc hóa học mới:
   • Lần đầu tiên công bố đầy đủ các đặc điểm cấu trúc phân tử tinh vi của fucoidan phân lập từ hai loài rong nâu Việt Nam là Sargassum aquifolium và Turbinaria decurrens.
   • Xác định rõ thành phần monosaccharide, trật tự liên kết glycoside (dạng pyranose) và vị trí gắn các nhóm chức ester sulfate thông qua việc giải đoán phổ 2D NMR (COSY, TOCSY, HSQC, HMBC, NOESY) và phổ khối ESI-MS/MS đa bậc.
3. Về nghiên cứu hình thái không gian phân tử: Ứng dụng kỹ thuật tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS) để khảo sát cấu trúc không gian của 06 mẫu fucoidan rong nâu Việt Nam trong dung dịch, xác định thông số bán kính hồi chuyển mặt cắt ngang ($R_{gc}$) từ đồ thị Guinier và đồ thị Kratky.
4. Về mối tương quan cấu trúc và hoạt tính: Làm sáng tỏ mối liên hệ giữa các thông số hóa lý (khối lượng phân tử trung bình, hàm lượng sulfate, tỷ lệ sulfate/đường, kích thước chuỗi polymer $R_{gc}$) với hoạt tính gây độc tế bào ung thư (in vitro trên dòng Hep-G2, RD), khả năng ức chế khối u trên thạch mềm và hoạt tính chống đông tụ máu (APTT).

Kiến nghị và đề xuất

• Khai thác hợp lý và bền vững nguồn tài nguyên rong nâu tại dải ven biển miền Trung (đặc biệt là tỉnh Khánh Hòa) phục vụ nghiên cứu và phát triển sản phẩm dược phẩm, thực phẩm chức năng.
• Ứng dụng các quy trình phân đoạn và khử sulfate kết hợp kỹ thuật phổ NMR/MS/SAXS đã thiết lập vào việc nghiên cứu chuẩn hóa cấu trúc các polysaccharide sulfat hóa từ các nguồn sinh vật biển khác.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

• Phạm vi thu thập mẫu tập trung chủ yếu tại các vùng sinh thái ven biển tỉnh Khánh Hòa (Vịnh Vân Phong, Ninh Hòa, Vịnh Nha Trang, Cam Ranh), chưa bao quát toàn bộ các vùng biển khác trên cả nước.
• Các thử nghiệm hoạt tính sinh học (gây độc tế bào, ức chế cụm tế bào ung thư trên thạch mềm, thử nghiệm chống đông máu APTT) mới được thực hiện ở quy mô in vitro, chưa tiến hành thử nghiệm dược lý trên mô hình động vật sống (in vivo).

Hướng nghiên cứu tiếp theo

• Mở rộng khảo sát hoạt tính chống đông máu, chống huyết khối và ức chế khối u của các phân đoạn fucoidan tinh khiết trên các mô hình động vật thực nghiệm (in vivo).
• Nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động ở mức độ biểu hiện gen và truyền tín hiệu nội bào (con đường apoptosis, NF-$\kappa$B, caspase) của các phân đoạn fucoidan chọn lọc.
• Thử nghiệm nâng cấp quy trình công nghệ chiết tách và tinh chế fucoidan ở quy mô pilot nhằm ứng dụng trong sản xuất nguyên liệu cho ngành công nghiệp thực phẩm chức năng và dược phẩm.

---

Giá trị tham khảo

Đối tượng thụ hưởng và ứng dụng

1. Nghiên cứu sinh và học viên cao học: Cung cấp tài liệu tham khảo có giá trị cao về phương pháp luận phân lập, tinh chế và giải mã cấu trúc polysaccharide thiên nhiên có cấu trúc phân nhánh phức tạp.
2. Giảng viên và nhà khoa học chuyên ngành: Là nguồn dữ liệu thực nghiệm tham khảo cho các nghiên cứu thuộc lĩnh vực Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Hóa sinh học biển, Dược lý học thực nghiệm và Hóa lý polymer.
3. Các cơ sở nghiên cứu và doanh nghiệp dược liệu: Cung cấp cơ sở khoa học và dữ liệu thành phần hóa học để định hướng khai thác, chế biến sâu các sản phẩm bảo vệ sức khỏe, thực phẩm chức năng và nguyên liệu dược từ nguồn rong nâu biển Việt Nam.

Các phần nội dung đáng tham khảo

• Quy trình phân tích liên kết glycoside bằng phương pháp methyl hóa kết hợp GC-MS và kỹ thuật khử sulfate (desulfation) để làm sáng tỏ phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2D NMR.
• Kỹ thuật phân tích các ion phân mảnh oligosaccharide sulfate hóa trên phổ khối ESI-MS/MS ở chế độ ion âm.
• Phương pháp xử lý dữ liệu tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS) để nghiên cứu kích thước và hình thái phân tử polymer sinh học trong dung dịch.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Phổ khối ESI-MS/MS của các phân đoạn fucoidan từ Sargassum aquifolium và Turbinaria decurrens phát hiện những mảnh ion đặc trưng nào?

Trên phổ ESI-MS/MS ở chế độ ion âm, các phân đoạn fucoidan phân lập từ hai loài rong nâu này cho thấy các đỉnh ion phân mảnh âm đặc trưng gồm:

• Ion $[FucSO_3]^-$ có giá trị $m/z\ 243$ (gốc fucose gắn một nhóm sulfate).
• Ion $[Fuc_2SO_3]^-$ có giá trị $m/z\ 389$ (disaccharide gồm hai gốc fucose gắn một nhóm sulfate).
• Ion $[FucGalSO_3]^-$ có giá trị $m/z\ 405$ (disaccharide dị thể gồm một gốc fucose và một gốc galactose gắn một nhóm sulfate).

2. Thông số bán kính hồi chuyển mặt cắt ngang ($R_{gc}$) của các mẫu fucoidan được xác định bằng phương pháp nào và trong điều kiện môi trường nào?

Thông số $R_{gc}$ được xác định bằng phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS) thông qua việc xây dựng đồ thị Guinier của mặt cắt ngang từ các kết quả đo mẫu thực nghiệm trong môi trường nước và dung dịch muối NaCl 0,5M.

3. Khác biệt cơ bản về mô hình cấu trúc fucoidan của loài Fucus vesiculosus giữa công bố của Percival & Ross (1950) và Patankar cùng cộng sự (1993) là gì?

• Công bố của Percival và Ross (1950) cho rằng fucoidan từ Fucus vesiculosus có khung mạch chính là liên kết $\alpha$-(1→2), phân nhánh tại $\alpha$-(1→3) và nhóm sulfate nằm ở vị trí C-4 của vòng fucopyranose.
• Công bố của Patankar và cộng sự (1993) đã chứng minh lại mạch chính của phân tử thực chất là liên kết $\alpha$-(1→3) thay vì $\alpha$-(1→2), trong khi nhóm sulfate vẫn chủ yếu nằm ở vị trí C-4.

4. Những dòng tế bào ung thư người nào được sử dụng để đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trong luận án?

Luận án sử dụng 03 dòng tế bào ung thư ở người để thử nghiệm hoạt tính sinh học in vitro, bao gồm:

• Dòng tế bào ung thư biểu mô gan người: Hep-G2 (Human hepatocellular carcinoma).
• Dòng tế bào ung thư mô liên kết người: RD (Human Rhabdomyosarcoma).
• Dòng tế bào ung thư biểu mô phổi người: LU-1 (Human lung adenocarcinoma).

5. Những yếu tố cấu trúc nào của fucoidan có ảnh hưởng quyết định đến hoạt tính chống đông tụ máu theo các nghiên cứu được tổng hợp trong luận án?

Hoạt tính chống đông tụ máu của fucoidan phụ thuộc vào:

• Hàm lượng nhóm sulfate và tỷ lệ sulfate/đường (hàm lượng sulfate càng cao thì hoạt tính chống đông tụ càng mạnh).
• Vị trí gắn của nhóm sulfate trên khung đường (nhóm sulfate ở vị trí C-2 hoặc C-2, C-3 thể hiện hoạt tính rõ rệt, trong khi nhóm sulfate ở C-4 hầu như không thể hiện hoạt tính này).
• Độ dài và tính linh động của mạch polymer để tạo phức liên kết với thrombin qua trung gian antithrombin hoặc heparin cofactor II.

---

Kết luận

Luận án Tiến sĩ Hóa học của nghiên cứu sinh Bùi Văn Nguyên đã phân lập, tinh chế và xác định có hệ thống đặc điểm cấu trúc phân tử cùng hoạt tính sinh học của fucoidan từ các loài rong nâu tại vùng biển Khánh Hòa, Việt Nam. Công trình đã làm sáng tỏ cấu trúc liên kết glycoside và vị trí sulfate hóa của fucoidan từ Sargassum aquifolium và Turbinaria decurrens bằng chuỗi phương pháp quang phổ hiện đại (NMR 2D, ESI-MS/MS, GC-MS), đồng thời ứng dụng kỹ thuật tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS) để xác định hình thái không gian phân tử trong dung dịch. Các kết quả thực nghiệm khẳng định hoạt tính gây độc tế bào ung thư gan (Hep-G2), ức chế khối u trên thạch mềm và hoạt tính chống đông tụ máu (APTT) có mối liên hệ mật thiết với hàm lượng sulfate, tỷ lệ sulfate/đường và kích thước phân tử của fucoidan. Luận án đóng góp nguồn dữ liệu khoa học tin cậy cho công tác điều tra tài nguyên hợp chất thiên nhiên biển và tạo nền tảng cho các nghiên cứu ứng dụng fucoidan trong y dược học tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Việt Nam được quốc tế công nhận là một trong những quốc gia có tính đa dạng sinh học cao nhất thế giới, với nhiều kiểu rừng, đầm lầy, sông suối, biển,… Nằm ở trung tâm Đông Nam Á, Việt Nam có tổng chiều dài bờ biển khoảng 3260 km làm ranh giới phía tây của biển Đông, với diện tích mặt nước rộng hơn 1.000 km2 là một trong những biển quan trọng nhất của thế giới, có nguồn rong biển đa dạng và phong phú. Trên thế giới có khoảng 6.000 loài rong biển đã được xác định và chia làm 03 ngành rong chính dựa trên sắc tố của chúng là rong lục (Chlorophytes), rong nâu (Pheophytes) và rong đỏ (Rhodophytes). Rong biển có vai trò quan trọng trong nguồn lợi sinh vật biển, càng ngày càng được con người khai thác, nuôi trồng và sử dụng rộng rãi trong các lĩnh vực thực phẩm , công nghiệp. Theo các kết quả nghiên cứu thì hiện nay Việt Nam đã phát hiện gần 1000 loài rong biển, trong đó có khoảng 143 loài rong nâu (Phaeophyta) là nhóm rong có kích thước cá thể rất lớn và dài cùng với sinh lượng lớn.

Do vậy, rong nâu được coi là nguồn nguyên liệu vô cùng quý giá của hiện tại và trong tương lai cho nông nghiệp, công nghiệp sản xuất dược liệu, thực phẩm chức năng và mỹ phẩm. Trong các ngành công nghiệp sản xuất dược liệu, rong nâu được sử dụng làm nguồn nguyên liệu chính để chiết tách các hợp chất có hoạt tính sinh học như polysaccharide bao gồm fucoidan, laminaran, alginate và hợp chất khác như phlorotannin, mannitol,… với khả năng ứng dụng hết sức rộng lớn [1,2,3,4,5,6]. Trong số các polysaccharide từ rong nâu, fucoidan là hợp chất được đặc biệt quan tâm nghiên cứu do có nhiều hoạt tính sinh học quý như chống đông tụ máu, kháng khuẩn, chống virus kể cả HIV, chống ung thư, chống nghẽn tĩnh mạch, điều biến miễn dịch, giảm lipid máu, chống oxy hóa, hạ cholesteron, các đặc tính chống bổ thể, chống lại các bệnh về gan, về đường tiết niệu, tác dụng bảo vệ dạ dày và khả năng điều trị trong phẫu thuật,… [6]. Fucoidan là sulfated polysaccharide có nguồn gốc từ rong nâu, có cấu trúc hóa học phức tạp bởi tính đa dạng của các liên kết glycoside cũng như nhiều gốc đường đơn khác nhau liên kết với nhau và khả năng phân nhánh với các vị trí nhóm sulfate cũng như các nhánh khác được sắp xếp không theo quy luật trên mạch polymer.

Thành phần cấu tạo nên fucoidan thường là 2 bao gồm chủ yếu fucose và sulfate cùng một số các gốc đường khác như galactose, glucose, manose, xylose., đôi khi còn có uronic acid [6,7]. Nhờ vào sự đa dạng cấu trúc hóa học và sở hữu nhiều hoạt tính sinh học thú vị, sulfated polysaccharide (fucoidan) đã được nghiên cứu mạnh và sâu. Việc giải thích làm sáng rõ chính xác cấu trúc hóa học của fucoidan là hết sức phức tạp, fucoidan được tách ra từ rong nâu thường là hỗn hợp của nhiều cấu trúc sulfated polysaccharide khác nhau. Fucoidan thông thường là có cấu trúc phân nhánh và chứa nhiều monosaccharide khác nhau cũng như có nhóm sulfate và axtate [7,8].

Fucoidan từ rong nâu thuộc chi Sargassum, Hormophysa và Turbinaria có cấu trúc hóa học phức tạp [9,10] nhưng lại rất hấp dẫn về hoạt tính cũng như ứng dụng của chúng và sẵn có trong tự nhiên. Mặc dù có rất nhiều công trình nghiên cứu nhằm xác định cấu trúc tinh vi của fucoidan đã được công bố, nhưng chỉ có một vài kết quả nghiên cứu phát hiện được tính quy luật trong cấu trúc của fucoidan [10,11,12] như liên kết giữa các gốc đường, sự phân nhánh, vị trí các gốc sulfate, các phân tử đường đơn khác… Cho tới nay, phần lớn các công trình nghiên cứu về hoạt tính sinh học được tiến hành trên các sản phẩm fucoidan thô. Vì vậy, mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan thực tế cho đến nay vẫn chưa được sáng tỏ [12,13,14]. Để giúp cho việc nghiên cứu cơ chế tác dụng của fucoidan lên các tế bào sinh vật và tiến tới sử dụng fucoidan để bào chế dược liệu thì việc xác định chính xác cấu trúc hóa học của fucoidan là điều quyết định đầu tiên và đang thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học trên thế giới.

Chính vì vậy tôi chọn tên đề tài luận án là “Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan từ một số loài rong nâu Việt Nam”. Mục tiêu nghiên cứu của luận án là: Nghiên cứu phân lập, xác định các đặc điểm cấu trúc và thử nghiệm hoạt tính sinh học của các fucoidan từ một số loài rong nâu sinh trưởng ở vùng biển Việt Nam phục vụ cho việc điều tra tài nguyên hợp chất thiên nhiên biển của Việt Nam và làm rõ bản chất hóa học của các đối tượng nghiên cứu. Để đạt được mục tiêu trên của luận án, các nội dung nghiên cứu của luận án bao gồm: 3 Nghiên cứu sàng lọc một số loài rong nâu để chọn ra các đối tượng nghiên cứu sâu về cấu trúc cũng như hoạt tính sinh học của các fucoidan Nghiên cứu sâu về cấu trúc cũng như hoạt tính sinh học của các fucoidan chiết xuất từ một số loài rong nâu chọn lọc. Khảo sát mối quan hệ giữa các đặc điểm cấu trúc và hoạt tính sinh học của một số fucoidan chọn lọc.

Tổng quan về rong nâu 1. Giới thiệu về rong biển Rong biển hay còn được gọi là tảo kích thước lớn, rong biển là thực vật bậc thấp sống tự dưỡng bằng cách quang hợp, hình thái dạng tản. Rong biển sinh trưởng phát triển nhanh, có vòng đời sinh trưởng không quá 1 năm, tốc độ tăng trọng nhanh và tạo ra sinh khối lớn [1,4]. Tổng số loài rong biển trên thế giới được báo cáo chủ yếu thuộc 3 ngành chính, có 900 loài thuộc ngành rong lục (Chlorophyta), 1500 loài thuộc ngành rong nâu (Phaeophyta) và 4000 loài thuộc ngành rong đỏ (Rhodophyta) và hiện nay đã có nhiều công trình nghiên cứu phát hiện loài mới bổ sung vào tổng số loài rong biển phân bố trên toàn thế giới.

Tổng số loài rong biển ở Việt Nam ước tính khoảng 1.000 loài, trong đó có khoảng 639 loài: 151 loài thuộc ngành rong lục (Chlorophyta), 143 loài thuộc ngành rong nâu (Phaeophyta), 269 loài thuộc ngành rong đỏ (Rhodophyta) và 76 loài thuộc ngành rong lam (Cyanophyta) [1]. Trong tất cả các loài này, 310 loài phân bố ở vùng ven biển các tỉnh phía Bắc và 484 hiện diện ở các tỉnh phía Nam, 156 loài phân bố ở cả hai vùng [15]. Đại dương cung cấp cho trái đất khoảng 200 tỷ tấn rong biển hàng năm. Các nhà khoa học cho rằng trên 90% cacbon trên trái đất được tổng hợp nhờ quang hợp, trong đó 20% có nguồn ngốc từ rong biển.

Việc sử dụng các sản phẩm từ rong biển đã trải qua thời kì lịch sử rất lâu dài. Các dấu vết khảo cổ học cho thấy, người Nhật đã dùng rong biển từ hơn 10. Trong nền văn hoá Trung Quốc cổ đại, rong biển được coi là đặc sản dùng trong các món ăn của triều đình và chỉ hoàng tộc hay khách của hoàng thân, quốc thích mới được thưởng thức. Dù rong biển được coi là món ăn đặc trưng của châu Á, nhưng trên thực tế các quốc gia có bờ biển trên thế giới như Scotland, Ireland, Newzealand, quần đảo nam Thái Bình Dương và các nước Nam Mỹ ven biển cũng đã sử dụng rong biển từ rất lâu.

Rong biển cũng được sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác, chúng là nguồn nguyên liệu tự nhiên cho công nghiệp thực phẩm (Cải biển Ulva lactuca, bột rong biển, chất tạo gel E400, E401 Alginate–Agar E406, E407, Carrageenan.), mỹ phẩm (chất tạo kết cấu và hoạt hóa), công nghiệp (Phycocolloids, hydrocolloids tạo độ sánh, gel hoặc chất ổn định), 5 thức ăn gia súc, nông nghiệp. Qua các tài liệu tham khảo trong lịch sử và trong thời gian sử dụng lâu dài, không có nguy cơ gây hại sức khỏe nào được đề cập đến. Vì vậy, ngày nay rong biển được xếp vào loại thực phẩm chức năng ngày càng được sử dụng rộng rãi trên thế giới. Hiện nay, Nhật Bản, Trung Quốc và Hàn Quốc là những nước tiêu thụ rong biển thực phẩm lớn nhất và nhu cầu của họ là cơ sở của một nghề nuôi trồng thủy sản với sản lượng hằng năm trên toàn thế giới khoảng 6 triệu tấn rong tươi, trị giá lên đến 5 tỉ USD.

Các nước và lãnh thổ cung cấp rong biển thực phẩm chính là Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc và Đài Loan. Các nước cung cấp chính rong biển cho công nghiệp là Đan Mạch, Pháp, Na Uy, Tây Ban Nha, Mỹ và Nhật [16]. Rong biển có thành phần hóa học đa dạng, các hợp chất có trong rong biển đều là những hợp chất có giá trị dinh dưỡng và dược dụng cao. Hàm lượng của các chất có trong rong biển phụ thuộc vào loài rong, điều kiện sống, sinh trưởng và phát triển của rong.

Theo kết quả phân tích ở các loài rong đã được nghiên cứu, thành phần trong rong gồm có : nước chiếm 80 – 90 %, protein chiếm khoảng 5 – 20,5% trọng lượng khô, 17 loại axít amin, trong đó có mặt tất cả các amino acid thiết yếu, hàm lượng lipid trong rong chiếm từ 0,2 – 0,6%, các loại sắc tố : sắc tố màu nâu (fucoxanhthin), các sắc tố xanthophyll khác là violaxanthin, antheraxanthin, neoxanthin, diainoxanthin và diatoxanhthin, chất khoáng, các nguyên tố đa lượng ( K, Na, Mg, S, P,…) và đặc biệt là các nguyên tố vi lượng ( Sr, Fe, Cu, Zn, Mn, Mo,…). Thành phần hóa học quan trọng của rong nâu là các glucid, chúng được chia thành 2 nhóm : monosaccharide và polysaccharide. Nhóm monosaccharide gồm các đường đơn như : mannitol, fucose, galactose, manose, xylose,….trong đó quan trọng nhất là mannitol. Mannitol thuộc nhóm đường kép của rong nâu, được phát hiện đầu tiên vào năm 1884 và nghiên cứu sâu hơn vào năm 1913.

Các nghiên cứu cho thấy hàm lượng mannitol của rong biển ở vùng biển phía Nam cao hơn phía Bắc. Hàm lượng mannitol trong rong biển thường cao vào các tháng mùa hè và có xu hướng tăng dần theo thời gian sinh trưởng của rong. Quy trình chiết tách mannitol ở quy mô phòng thí nghiệm dựa trên nguyên tắc : làm lạnh dung dịch mannitol sau khi đã được chiết bằng cồn nóng để thu được các tinh thể mannitol. Mannitol được sử dụng nhiều trong dược phẩm, trong công nghiệp để làm nguyên 6 liệu tổng hợp một số hợp chất hữu cơ, làm thuốc nổ, diêm và trong công nghiệp thực phẩm đặc biệt là trong công nghiệp bánh kẹo để sản xuất các loại bánh gato có độ ngọt cao nhưng đảm bảo độ mềm và xốp của bánh [1,2,3,4,5,6].

Nhóm polysaccharides gồm có : fucoidan, laminaran, alginate, agar và carrageenan.