Luận văn: Nghiên cứu sự lưu hành Fowl Adenovirus (FAdV) ở gà tại Hà Nội

Luận văn nghiên cứu sự lưu hành của Fowl Adenovirus (FAdV) ở gà tại Hà Nội. Cung cấp dữ liệu dịch tễ học và giải pháp phòng chống dịch bệnh.

• Tác giả: Nguyễn Thị Hà Thu
• Người hướng dẫn: PGS. Huỳnh Thị Mỹ Lệ
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Thú y
• Đề tài: Nghiên cứu sự lưu hành của Fowl Adenovirus (FAdV) ở gà nuôi tại Hà Nội và vùng phụ cận
• Loại tài liệu: Luận văn
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• Lời cam đoan
• Lời cảm ơn
• Danh mục chữ viết tắt
• Danh mục bảng
• Danh mục hình
• Trích yếu luận văn
• Thesis abstract
• 1. MỞ ĐẦU
• 1.1. Tính cấp thiết của đề tài
• 1.2. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
• 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Giới thiệu chung về Fowl Adenovirus (adenovirus ở gia cầm)
• 2.1.1. Hình thái, cấu trúc
• 2.1.2. Cơ chế sinh bệnh
• 2.1.3. Đường truyền lây
• 2.1.4. Sức đề kháng
• 2.2. Hiểu biết về bệnh do FAdV gây ra ở gà
• 2.2.1. Adenovirus nhóm II
• 2.2.2. Adenovirus nhóm III: (virus gây hội chứng giảm đẻ ở gà)
• 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Đối tượng nghiên cứu
• 3.2. Nội dung nghiên cứu
• 3.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 3.4. Vật liệu nghiên cứu
• 3.5. Phương pháp nghiên cứu
• 3.5.1. Phương pháp lấy mẫu
• 3.5.2. Phương pháp tách và tinh sạch ADN tổng số
• 3.5.3. Phương pháp tối ưu phản ứng PCR phát hiện FAdV
• 3.5.4. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học phân tử
• 3.5.5. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học phân tử của FAdV serotype 4
• 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả xác định sự lưu hành FAdV ở đàn gà nuôi tại Hà Nội và vùng phụ cận
• 4.1.1. Kết quả tối ưu hóa phản ứng PCR
• 4.1.2. Tổng hợp tình hình thu thập mẫu phục vụ nghiên cứu
• 4.1.3. Kết quả PCR phát hiện FAdV trong mẫu bệnh phẩm
• 4.2. Kết quả giải trình tự gen hexon của FAdV
• 4.2.1. Kết quả phân tích trình tự nucleotide gen hexon của FAdV
• 4.2.2. Kết quả phân tích trình tự amino acid của protein hexon
• 4.3. Kết quả phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử của FAdV
• 4.3.1. Kết quả phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử của FAdV
• 4.3.2. Kết quả nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học phân tử của FAdV serotype 4
• 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Khám phá nghiên cứu Fowl Adenovirus FAdV ở gà tại Hà Nội

Ngành chăn nuôi gia cầm Việt Nam, đặc biệt là chăn nuôi gà, đang đối mặt với nhiều thách thức từ các dịch bệnh mới nổi. Trong số đó, Fowl Adenovirus (FAdV) là một tác nhân gây bệnh quan trọng nhưng chưa được quan tâm đúng mức. Đây là một loại virus có khả năng gây suy giảm miễn dịch, khiến gà dễ mắc các bệnh kế phát nguy hiểm. Một nghiên cứu Fowl Adenovirus (FAdV) ở gà tại Hà Nội đã được thực hiện nhằm cung cấp những dữ liệu khoa học đầu tiên về sự lưu hành và đặc điểm di truyền của virus này tại Việt Nam. FAdV thuộc họ Adenoviridae, là virus không có vỏ bọc, chứa nhân ADN sợi đôi, có sức đề kháng cao với nhiều yếu tố môi trường và chất sát trùng. Chúng được chia thành ba nhóm chính với các đặc điểm gây bệnh khác nhau. Nhóm I gồm 12 serotype, thường gây ra bệnh viêm gan thể bao hàm (IBH) và hội chứng xoang bao tim tích nước (HPS). Nhóm II gây bệnh viêm ruột xuất huyết ở gà tây và bệnh lách đá hoa. Nhóm III là nguyên nhân của hội chứng giảm đẻ (EDS). Việc thiếu thông tin về FAdV tại Việt Nam tạo ra một lỗ hổng lớn trong công tác chẩn đoán và phòng bệnh. Do đó, nghiên cứu này mang ý nghĩa tiên phong, xác định tỷ lệ lưu hành của virus tại Hà Nội và các vùng lân cận, đồng thời phân tích sâu về dịch tễ học phân tử của các chủng virus phát hiện được. Kết quả từ nghiên cứu không chỉ cảnh báo về sự hiện diện của Fowl Adenovirus (FAdV) mà còn là cơ sở vững chắc cho các chiến lược kiểm soát dịch bệnh trong tương lai, giúp bảo vệ ngành chăn nuôi gà khỏi những thiệt hại kinh tế nghiêm trọng. Phân tích này là một bước tiến quan trọng trong việc hiểu rõ hơn về mầm bệnh này tại khu vực.

1.1. Giới thiệu về virus FAdV và các nhóm huyết thanh học

Fowl Adenovirus (FAdV) thuộc giống Aviadenovirus, được phân loại thành 3 nhóm lớn. Nhóm I (adenovirus quy ước) được chia thành 5 loài (A-E) và 12 serotype. Các serotype này là nguyên nhân chính gây ra viêm gan thể bao hàm (IBH) và hội chứng xoang bao tim tích nước (HPS), đặc biệt ở gà thịt. Nhóm II bao gồm các virus gây bệnh nguy hiểm như viêm ruột xuất huyết ở gà tây (THEV) và bệnh lách đá hoa (MSDV). Nhóm III chỉ có một thành viên duy nhất là virus gây hội chứng giảm đẻ (EDSV), ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất của gà đẻ trứng. Sự đa dạng về huyết thanh học và độc lực của FAdV tạo ra một bức tranh dịch tễ phức tạp, đòi hỏi các phương pháp chẩn đoán chính xác để phân biệt và kiểm soát hiệu quả.

1.2. Tính cấp thiết của việc nghiên cứu FAdV tại Việt Nam

Trước nghiên cứu này, tại Việt Nam chưa có bất kỳ công bố chính thức nào về sự lưu hành của Fowl Adenovirus (FAdV) ở gà. Trong khi đó, ngành chăn nuôi đang phải đối mặt với tình hình dịch bệnh phức tạp, nơi các tác nhân gây suy giảm miễn dịch đóng vai trò then chốt làm trầm trọng thêm các bệnh nhiễm trùng khác. Việc xác định sự hiện diện và đặc điểm của FAdV ở gà tại Hà Nội là bước đi đầu tiên và cực kỳ cần thiết. Nó không chỉ cung cấp bằng chứng khoa học về một mầm bệnh tiềm ẩn mà còn là cơ sở để các nhà khoa học, bác sĩ thú y và người chăn nuôi xây dựng các biện pháp an toàn sinh học, chương trình vaccine và chiến lược phòng chống phù hợp với thực tiễn tại Việt Nam.

II. Nhận diện thách thức từ FAdV trong chăn nuôi gà tại Hà Nội

Sự lưu hành của Fowl Adenovirus (FAdV) đặt ra những thách thức đáng kể cho ngành chăn nuôi gà. Mặc dù nhiều chủng FAdV có thể tồn tại trong cơ thể gà khỏe mạnh mà không gây triệu chứng, chúng sẽ trở thành tác nhân gây bệnh nguy hiểm khi có sự xuất hiện của các yếu tố căng thẳng hoặc đồng nhiễm với các virus khác như virus Gumboro (IBDV) hay virus gây thiếu máu truyền nhiễm (CAV). Nghiên cứu cho thấy, FAdV là nguyên nhân trực tiếp của các bệnh lý gây thiệt hại kinh tế lớn, điển hình là bệnh viêm gan thể bao hàm (IBH) và hội chứng xoang bao tim tích nước (HPS), chủ yếu do serotype 4 và các serotype khác gây ra. Các bệnh này có tỷ lệ chết đột ngột cao, có thể lên đến 30-80% ở gà thịt từ 3-6 tuần tuổi. Một thách thức lớn khác là khả năng lây truyền đa dạng của virus. Fowl Adenovirus (FAdV) có thể lây truyền cả theo chiều dọc (từ mẹ sang con qua trứng) và chiều ngang (qua phân, dịch tiết, dụng cụ chăn nuôi). Sự tồn tại tiềm ẩn của virus trong đàn giống khiến việc kiểm soát trở nên vô cùng khó khăn. Hơn nữa, với sức đề kháng cao, virus có thể tồn tại lâu trong môi trường, làm tăng nguy cơ bùng phát dịch. Việc chẩn đoán FAdV cũng gặp trở ngại do các triệu chứng lâm sàng thường không đặc hiệu và dễ nhầm lẫn với các bệnh khác. Điều này đòi hỏi phải áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại để xác nhận chính xác. Những thách thức từ nghiên cứu Fowl Adenovirus (FAdV) ở gà tại Hà Nội nhấn mạnh sự cần thiết của việc giám sát dịch tễ liên tục và áp dụng các biện pháp an toàn sinh học nghiêm ngặt.

2.1. Các bệnh lý nguy hiểm do FAdV gây ra ở gà

Fowl Adenovirus (FAdV) có liên quan đến nhiều tình trạng bệnh lý ở gà. Phổ biến nhất là viêm gan thể bao hàm (IBH), đặc trưng bởi gan sưng to, xuất huyết, bở và nhạt màu. Bệnh tích vi thể cho thấy các thể vùi ưa acid trong nhân tế bào gan. Một bệnh khác là hội chứng xoang bao tim tích nước (HPS), hay bệnh Angara, với biểu hiện dịch lỏng màu hổ phách tích tụ trong xoang bao tim, gan và thận sưng to. Ngoài ra, FAdV còn có thể gây xói mòn mề, viêm khớp và các vấn đề về đường hô hấp. Tác động cộng hợp của virus là gây suy giảm miễn dịch, mở đường cho các mầm bệnh kế phát như E.coli, làm tăng tỷ lệ chết và giảm năng suất chăn nuôi.

2.2. Nguy cơ lây truyền và khả năng tồn tại của virus

FAdV có hai con đường lây truyền chính. Lây truyền dọc qua trứng là nguồn lây nhiễm quan trọng nhất, khiến gà con nở ra đã mang mầm bệnh và bắt đầu thải virus sau vài tuần tuổi. Lây truyền ngang xảy ra qua tiếp xúc trực tiếp hoặc gián tiếp với phân, dịch tiết đường hô hấp, dụng cụ chăn nuôi, và con người. Virus có sức đề kháng rất cao, không bị ảnh hưởng bởi ether, chloroform và có thể tồn tại ở pH từ 3 đến 9. Đặc tính này giúp virus tồn tại lâu trong môi trường chuồng trại, ngay cả sau khi đã vệ sinh, khử trùng, gây khó khăn cho việc cắt đứt chu trình lây nhiễm trong các trang trại chăn nuôi gà tại Hà Nội.

III. Phương pháp PCR xác định sự lưu hành Fowl Adenovirus FAdV

Để xác định chính xác sự lưu hành của Fowl Adenovirus (FAdV), các phương pháp chẩn đoán sinh học phân tử đóng vai trò then chốt. Trong khuôn khổ nghiên cứu Fowl Adenovirus (FAdV) ở gà tại Hà Nội, kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase (PCR) đã được lựa chọn làm công cụ chính. Phương pháp này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, cho phép phát hiện trực tiếp vật liệu di truyền (ADN) của virus trong mẫu bệnh phẩm, ngay cả khi hàm lượng virus thấp. Quy trình bắt đầu bằng việc thu thập mẫu bệnh phẩm từ những con gà có biểu hiện lâm sàng như ủ rũ, tiêu chảy, khó thở. Các cơ quan đích như gan, lách, túi Fabricius được ưu tiên lấy mẫu. Sau đó, ADN tổng số được tách chiết và tinh sạch từ huyễn dịch mẫu bằng phương pháp sử dụng phenol-chloroform. Giai đoạn quan trọng tiếp theo là tối ưu hóa phản ứng PCR. Nghiên cứu đã tiến hành tinh chỉnh các điều kiện phản ứng, bao gồm nhiệt độ bắt mồi và nồng độ mồi, để đảm bảo phản ứng chỉ khuếch đại đoạn gen mục tiêu của FAdV và loại bỏ các sản phẩm không đặc hiệu. Cặp mồi đặc hiệu (FAVHL/FAVHR) nhắm vào gen hexon, một vùng gen bảo thủ nhưng cũng đủ biến đổi để phân loại virus, đã được sử dụng. Kết quả tối ưu cho thấy nhiệt độ bắt mồi phù hợp là 58,5°C và nồng độ mồi là 0,5 µM. Việc áp dụng thành công phương pháp PCR đã cho phép xác định nhanh chóng và chính xác tỷ lệ gà dương tính với Fowl Adenovirus (FAdV), cung cấp dữ liệu nền tảng cho các phân tích dịch tễ sâu hơn.

3.1. Quy trình lấy mẫu và tách chiết ADN tổng số từ gà

Mẫu bệnh phẩm được thu thập ngẫu nhiên từ 14 trại chăn nuôi tại Hà Nội và vùng lân cận, tập trung vào gà có triệu chứng bệnh. Các cơ quan gồm gan, lách, ruột, tuyến ức, túi Fabricius được đồng nhất và bảo quản ở -20°C. Quá trình tách chiết ADN tổng số được thực hiện qua ba bước chính: (1) Ly giải mẫu bằng dung dịch sucrose/proteinase K ở 56°C. (2) Tách pha ADN bằng hỗn hợp phenol-chloroform-isoamyl để loại bỏ protein và các tạp chất khác. (3) Tủa ADN bằng isopropyl alcohol và rửa lại bằng cồn để thu được ADN tinh sạch, sẵn sàng cho phản ứng PCR.

3.2. Tối ưu hóa phản ứng PCR để phát hiện gen FAdV

Để đảm bảo độ chính xác của phản ứng PCR, việc tối ưu hóa là bước không thể thiếu. Nghiên cứu đã thử nghiệm một dải nhiệt độ bắt mồi từ 45,0°C đến 65,5°C. Kết quả cho thấy ở nhiệt độ 58,5°C, vạch sản phẩm đặc hiệu (kích thước 731bp) sáng rõ nhất và không có vạch sản phẩm phụ. Đồng thời, nồng độ của cặp mồi xuôi và ngược cũng được điều chỉnh. Sự kết hợp nồng độ 0,5 µM cho mỗi loại mồi đã mang lại hiệu suất khuếch đại cao nhất. Những điều kiện tối ưu này sau đó được áp dụng nhất quán cho tất cả các mẫu phân tích trong nghiên cứu FAdV.

IV. Phân tích kết quả tỷ lệ nhiễm FAdV ở đàn gà tại Hà Nội

Kết quả từ nghiên cứu Fowl Adenovirus (FAdV) ở gà tại Hà Nội đã xác nhận sự hiện diện và lưu hành của virus này trong các đàn gà tại địa bàn. Tổng cộng 124 mẫu bệnh phẩm từ 14 trại đã được kiểm tra bằng phản ứng PCR. Kết quả cho thấy có 26 mẫu dương tính, tương ứng với tỷ lệ nhiễm chung là 20,97%. Đáng chú ý, virus được phát hiện ở 8 trên 14 trại được khảo sát, chiếm tỷ lệ 57,14% số trại có sự lưu hành của FAdV. Điều này cho thấy mầm bệnh đã phân bố tương đối rộng rãi trong khu vực. Khi phân tích theo lứa tuổi, kết quả chỉ ra rằng gà ở nhóm tuổi từ 3 đến 5 tuần có tỷ lệ nhiễm cao nhất. Cụ thể, 6/7 trại trong nhóm tuổi này có gà dương tính (chiếm 85,71% số đàn) và tỷ lệ mẫu dương tính ở cá thể là 30,56%. Đây là giai đoạn gà thịt dễ bị tổn thương nhất, trùng khớp với các báo cáo trên thế giới về bệnh viêm gan thể bao hàm (IBH) và hội chứng xoang bao tim tích nước (HPS). Gà ở các lứa tuổi khác (<3 tuần và >6 tuần) có tỷ lệ nhiễm thấp hơn đáng kể. Các con gà có kết quả dương tính với Fowl Adenovirus (FAdV) khi mổ khám thường biểu hiện các bệnh tích điển hình như gan và lách sưng to, xuất huyết. Những phát hiện này không chỉ cung cấp bằng chứng đầu tiên về tỷ lệ nhiễm FAdV ở gà tại Hà Nội mà còn là một lời cảnh báo quan trọng đối với ngành chăn nuôi về một tác nhân gây bệnh tiềm tàng nhưng nguy hiểm.

4.1. Tỷ lệ dương tính FAdV theo trại và lứa tuổi gà

Phân tích trên 124 mẫu cho thấy tỷ lệ dương tính chung với FAdV là 20,97%. Sự phân bố không đồng đều giữa các trại, với một số trại có tỷ lệ nhiễm lên tới 40%. Yếu tố lứa tuổi có ảnh hưởng rõ rệt: gà từ 3-5 tuần tuổi có tỷ lệ nhiễm cao nhất (30,56%), trong khi gà dưới 3 tuần tuổi là 25,00% và gà trên 6 tuần tuổi chỉ là 4,54%. Dữ liệu này gợi ý rằng miễn dịch thụ động từ mẹ có thể bảo vệ gà con trong những tuần đầu, và nguy cơ mắc bệnh cao nhất khi lượng kháng thể này suy giảm, thường vào khoảng 3-5 tuần tuổi.

4.2. Các bệnh tích điển hình trên gà dương tính với FAdV

Mặc dù triệu chứng lâm sàng có thể không rõ ràng, các bệnh tích đại thể ở gà dương tính với Fowl Adenovirus (FAdV) lại khá đặc trưng. Các quan sát trong nghiên cứu ghi nhận tình trạng gan sưng to, dễ nát, có thể có màu vàng hoặc xuất huyết điểm, thành vệt. Lách cũng thường bị sưng to và xuất huyết. Những bệnh tích này tương đồng với mô tả của bệnh viêm gan thể bao hàm (IBH). Ở một số trường hợp, có thể quan sát thấy hiện tượng xoang bao tim tích dịch, là dấu hiệu của HPS. Việc nhận biết các bệnh tích này là rất quan trọng cho công tác chẩn đoán sơ bộ tại trại.

V. Giải mã đặc điểm di truyền FAdV qua phân tích gen hexon

Để hiểu sâu hơn về các chủng Fowl Adenovirus (FAdV) đang lưu hành, nghiên cứu đã tiến hành giải trình tự và phân tích gen hexon. Đây là gen mã hóa cho protein cấu trúc chính của vỏ capsid virus và chứa các vùng quyết định tính kháng nguyên, giúp phân loại genotype và serotype. Trong số các mẫu dương tính, 7 chủng FAdV đã được giải trình tự thành công. Kết quả phân tích trình tự nucleotide cho thấy sự đa dạng di truyền rất cao giữa các chủng virus này. Mức độ tương đồng về trình tự nucleotide dao động rộng, từ thấp nhất là 57,1% đến cao nhất là 99,6%. Cụ thể, có tới 51,8% vị trí nucleotide trên đoạn gen phân tích có sự thay đổi. Sự đa dạng này cho thấy có nhiều genotype FAdV khác nhau đang cùng lưu hành trong khu vực Hà Nội và vùng phụ cận. Phân tích cây phát sinh chủng loại đã xếp 7 chủng virus này vào 3 giống di truyền khác nhau: FAdV-C, FAdV-D và FAdV-E. Đáng chú ý, không có chủng nào thuộc giống FAdV-A hoặc FAdV-B. Trong đó, chủng F5 thuộc giống FAdV-C và có quan hệ di truyền gần gũi với các chủng serotype 4 - một serotype nổi tiếng gây bệnh HPS và IBH trên toàn thế giới. Việc phân tích dịch tễ học phân tử từ gen hexon đã cung cấp một cái nhìn chi tiết về bản đồ di truyền của Fowl Adenovirus (FAdV) tại Việt Nam, là cơ sở khoa học quan trọng cho việc phát triển vaccine và các nghiên cứu sâu hơn.

5.1. Phân tích sự đa dạng trình tự nucleotide và amino acid

Phân tích đoạn gen hexon (612 bp) của 7 chủng FAdV cho thấy có 317 vị trí đa hình nucleotide. Sự đa dạng này cũng được phản ánh ở cấp độ protein, dù ở mức độ thấp hơn. Các thay đổi nucleotide chủ yếu xảy ra ở vị trí thứ ba của codon, thường là các đột biến đồng nghĩa (không làm thay đổi amino acid). Tuy nhiên, vẫn có 52 codon ghi nhận đột biến không đồng nghĩa, dẫn đến sự thay đổi amino acid. Điều này cho thấy áp lực tiến hóa đang tác động lên virus, có thể ảnh hưởng đến độc lực và tính kháng nguyên của chúng. Hai chủng F3 và F8 có mức tương đồng nucleotide cao nhất (99,6%), cho thấy chúng có thể cùng một nguồn gốc.

5.2. Xây dựng cây phát sinh chủng loại các chủng FAdV

Dựa trên trình tự gen hexon, cây phát sinh chủng loại đã được xây dựng để xác định mối quan hệ di truyền. Kết quả cho thấy các chủng FAdV phân lập ở gà tại Hà Nội thuộc về 3 nhóm di truyền khác nhau. Chủng F5 được xếp vào nhóm FAdV-C, cùng nhánh với serotype 4. Các chủng F3 và F8 thuộc nhóm FAdV-D (nhóm di truyền D2). Bốn chủng còn lại (F6, F7, F9, F11) thuộc nhóm FAdV-E (nhóm di truyền D1). Sự phân bố đa dạng này khẳng định rằng quần thể virus FAdV tại khu vực nghiên cứu rất phức tạp, có thể bắt nguồn từ nhiều nguồn du nhập khác nhau.

VI. Kết luận và kiến nghị từ nghiên cứu FAdV ở gà tại Hà Nội

Công trình nghiên cứu Fowl Adenovirus (FAdV) ở gà tại Hà Nội đã mang lại những kết luận khoa học quan trọng và có giá trị thực tiễn cao. Thứ nhất, nghiên cứu đã xác nhận lần đầu tiên sự lưu hành của Fowl Adenovirus (FAdV) tại Hà Nội và các vùng lân cận với tỷ lệ nhiễm là 20,97%, cho thấy đây là một mầm bệnh phổ biến. Thứ hai, gà ở lứa tuổi 3-5 tuần là đối tượng có nguy cơ nhiễm bệnh cao nhất, phù hợp với đặc điểm dịch tễ của các bệnh do FAdV gây ra trên thế giới. Thứ ba, các chủng FAdV lưu hành tại khu vực có tính đa dạng di truyền rất cao, thuộc ít nhất 3 giống (FAdV-C, D, E), trong đó có sự hiện diện của serotype 4, một serotype có độc lực cao. Phân tích dịch tễ học phân tử sâu hơn về chủng FAdV serotype 4 (chủng F5) cho thấy virus này có thể đã lưu hành ở miền Bắc Việt Nam từ khoảng năm 2005 và có nguồn gốc di truyền gần với các chủng ở Ấn Độ hơn là Trung Quốc. Từ những kết quả trên, một số kiến nghị được đưa ra. Cần nâng cao nhận thức cho người chăn nuôi và cán bộ thú y về sự nguy hiểm của FAdV. Các trang trại cần tăng cường biện pháp an toàn sinh học để hạn chế sự lây lan của virus. Đồng thời, cần có các nghiên cứu tiếp theo trên quy mô lớn hơn để đánh giá đầy đủ tình hình dịch tễ của FAdV trên cả nước và xác định vai trò của nó trong các hội chứng bệnh phức tạp. Việc nghiên cứu và phát triển vaccine phù hợp với các chủng virus đang lưu hành tại Việt Nam là một định hướng chiến lược và cấp thiết.

6.1. Nguồn gốc lưu hành của FAdV serotype 4 tại Việt Nam

Phân tích sâu về chủng FAdV-F5 (thuộc serotype 4) bằng cách so sánh với các trình tự trên ngân hàng gen quốc tế cho thấy một lịch sử tiến hóa và lan truyền thú vị. Mô hình phân tích cho thấy FAdV serotype 4 có thể đã xuất hiện ở miền Bắc Việt Nam từ rất sớm, vào khoảng năm 2005. Về mặt di truyền, chủng virus này gần gũi với nhánh virus lưu hành tại Ấn Độ hơn so với các nhánh phổ biến ở Trung Quốc. Phát hiện này gợi ý về một con đường lây truyền và du nhập virus phức tạp, có thể liên quan đến hoạt động thương mại gia cầm xuyên biên giới trong quá khứ.

6.2. Đề xuất giải pháp phòng chống và nghiên cứu sâu hơn

Dựa trên kết quả nghiên cứu, giải pháp trước mắt là cần kiểm soát chặt chẽ đàn giống để hạn chế lây truyền dọc. Các biện pháp an toàn sinh học như vệ sinh, sát trùng chuồng trại cần được thực hiện nghiêm ngặt, lựa chọn các chất sát trùng có khả năng tiêu diệt FAdV. Về lâu dài, cần tiến hành giám sát dịch tễ học thường xuyên để cập nhật sự biến đổi di truyền của virus. Việc phân lập và xác định độc lực của các chủng FAdV tại địa phương là cần thiết để lựa chọn chủng vaccine phù hợp. Phát triển các bộ kit chẩn đoán nhanh và chính xác cũng là một yêu cầu cấp thiết để hỗ trợ công tác phòng chống dịch bệnh hiệu quả hơn.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Ngành chăn nuôi gia cầm tại Việt Nam ghi nhận sự tăng trưởng ổn định với tổng đàn đạt 328,1 triệu con vào năm 2014 và tăng lên 341,5 triệu con vào năm 2016, tương ứng mức tăng 4,3% mỗi năm. Tốc độ phát triển đàn gia cầm giai đoạn gần đây duy trì mức tăng khoảng 3,2% đến 3,8% mỗi năm. Tuy nhiên, sự phát triển này đang đối mặt với nhiều thách thức lớn từ các mầm bệnh truyền nhiễm mới nổi và các hội chứng gây suy giảm miễn dịch như Gumboro, Marek, bệnh thiếu máu truyền nhiễm và Fowl Adenovirus. Trong đó, Fowl Adenovirus gây ra hội chứng viêm gan thể bao hàm và hội chứng xoang bao tim tích nước, dẫn đến tỷ lệ chết ở đàn gà thịt dao động từ 20% đến 80%, gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng cho người chăn nuôi.

Trước thời điểm thực hiện đề tài, tại Việt Nam chưa có bất kỳ công bố khoa học chính thức nào về sự lưu hành cũng như đặc điểm dịch tễ học phân tử của Fowl Adenovirus trên đàn gà. Nghiên cứu này được tiến hành nhằm xác định sự có mặt, tỷ lệ nhiễm của Fowl Adenovirus và giải mã các đặc trưng di truyền phân tử của các chủng virus lưu hành tại khu vực Hà Nội và vùng phụ cận.

Phạm vi nghiên cứu được triển khai trên 14 trang trại chăn nuôi gà thuộc địa bàn thành phố Hà Nội và các tỉnh lân cận trong thời gian từ tháng 12 năm 2015 đến tháng 5 năm 2017. Nghiên cứu mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn sâu sắc khi cung cấp bằng chứng dịch tễ học đầu tiên tại Việt Nam, ghi nhận tỷ lệ nhiễm virus trên mẫu bệnh phẩm đạt 20,97% (26/124 mẫu) và tỷ lệ trang trại dương tính lên tới 57,14% (8/14 trại). Đàn gà ở giai đoạn 3 đến 5 tuần tuổi có tỷ lệ nhiễm cao nhất, đạt 30,56% theo cá thể và 85,71% theo đàn. Đây là cơ sở khoa học nền tảng để xây dựng các giải pháp an toàn sinh học và định hướng sản xuất vaccine phòng bệnh đặc hiệu.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu áp dụng hệ thống phân loại chuẩn quốc tế về họ Adenoviridae, giống Aviadenovirus. Adenovirus ở gia cầm được chia làm 3 nhóm chính: Nhóm I gồm 5 loài (từ A đến E) và 12 serotype dựa trên phản ứng cắt men giới hạn và trung hòa chéo; Nhóm II gồm virus gây viêm ruột xuất huyết ở gà tây và bệnh lách đá hoa; Nhóm III gồm virus gây hội chứng giảm đẻ ở gà.

Về cấu trúc sinh học, Fowl Adenovirus là virus hình cầu không có vỏ bọc ngoài, đường kính từ 70 đến 90 nm, mang bộ gen ADN sợi đôi được bao bọc bởi 252 capsomer sắp xếp theo 12 mặt hình tam giác. Protein hexon là thành phần cấu trúc chính của vỏ capsid, quyết định tính kháng nguyên nhóm và kiểu gen của virus. Fowl Adenovirus có khả năng đề kháng cao với các dung môi hữu cơ như ether, chloroform, phenol 2%, cồn 50% và tồn tại được ở dải pH từ 3 đến 9 trong vòng 20 ngày ngoài môi trường xác động vật.

Cơ chế bệnh sinh của Fowl Adenovirus thể hiện qua hai con đường lây truyền chính: truyền dọc từ đàn bố mẹ sang trứng và truyền ngang qua phân, dịch bài tiết đường hô hấp. Khi xâm nhập vào cơ thể, virus nhân lên tại tế bào gan và biểu mô thận, tạo nên các thể bao hàm ái kiềm trong nhân tế bào. Độc lực của virus tăng mạnh khi có sự đồng nhiễm với các tác nhân gây ức chế miễn dịch như virus Gumboro hoặc virus thiếu máu truyền nhiễm ở gà.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu thu thập tổng số 124 mẫu bệnh phẩm từ 14 trang trại chăn nuôi gà tại Hà Nội và vùng phụ cận. Phương pháp chọn mẫu ngẫu nhiên có chủ đích được thực hiện trên những đàn gà có biểu hiện triệu chứng lâm sàng nghi mắc bệnh như ủ rũ, tiêu chảy, khó thở, giảm ăn và sưng gan lách. Mẫu bệnh phẩm thu thập gồm gan, lách, thận, ruột và túi Fabricius, phân bổ theo 3 nhóm tuổi: dưới 3 tuần tuổi (8 mẫu), từ 3 đến 5 tuần tuổi (72 mẫu) và từ 6 tuần tuổi trở lên (44 mẫu).

Lý do lựa chọn phương pháp phân tích: Do các xét nghiệm huyết thanh học truyền thống như ELISA hoặc phản ứng kết tủa khuếch tán trên thạch không phân biệt được kháng thể thụ động từ mẹ truyền với kháng thể do nhiễm trùng tự nhiên, kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp Polymerase Chain Reaction (PCR) được lựa chọn nhờ độ nhạy và độ đặc hiệu vượt trội. Cặp mồi đặc hiệu FAVHL và FAVHR khuếch đại phân đoạn gen hexon kích thước 731 cặp base được tối ưu hóa ở dải nhiệt độ bắt mồi từ 45,0°C đến 65,5°C và nồng độ mồi biến thiên từ 0,125 µM đến 0,500 µM.

Phân tích dịch tễ học phân tử sử dụng phần mềm MEGA6 với thuật toán Neighbor-Joining, mô hình Tajima-Nei và 1000 lần lặp bootstrap để xây dựng cây phát sinh chủng loại. Động thái tiến hóa không gian thời gian của serotype 4 được phân tích bằng phần mềm BEAST dựa trên 71 trình tự gen tham chiếu quốc tế có độ tương đồng tối thiểu 99%. Toàn bộ thực nghiệm được tiến hành tại Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam từ tháng 12 năm 2015 đến tháng 5 năm 2017.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Thứ nhất, nghiên cứu đã tối ưu hóa thành công điều kiện phản ứng PCR phát hiện Fowl Adenovirus với nhiệt độ bắt mồi tối ưu là 58,5°C và nồng độ mồi cuối cùng là 0,5 µM cho mỗi mồi, loại bỏ hoàn toàn các vạch sản phẩm không đặc hiệu kích thước 1100 bp, 500 bp và 300 bp.

Thứ hai, xác định sự lưu hành phổ biến của Fowl Adenovirus tại thực địa với 26/124 mẫu dương tính, đạt tỷ lệ 20,97%. Tỷ lệ trang trại nhiễm virus là 57,14% (8/14 trại kiểm tra), trong đó tỷ lệ mẫu dương tính tại các trại dao động từ 25,00% đến 40,00%.

Thứ ba, lứa tuổi từ 3 đến 5 tuần tuổi có tỷ lệ nhiễm cao nhất với 30,56% mẫu dương tính (22/72 mẫu) và 85,71% trang trại dương tính (6/7 trại). Nhóm gà dưới 3 tuần tuổi có tỷ lệ dương tính đạt 25,00% (2/8 mẫu), trong khi nhóm gà từ 6 tuần tuổi trở lên chỉ ghi nhận 4,54% (2/44 mẫu tại 1/6 trại).

Thứ tư, phân tích trình tự 612 nucleotide đoạn gen hexon của 7 chủng phân lập thành công cho thấy tính đa hình di truyền rất cao: 317/612 vị trí nucleotide biến đổi (51,80%), 271/612 vị trí đồng hình (44,28%) và 210 vị trí mang thông tin phân loại. Mức độ tương đồng nucleotide giữa 7 chủng biến thiên từ 57,1% (giữa chủng F3 và F5) đến 99,6% (giữa chủng F3 và F8).

Thứ năm, phân tích phả hệ xác định các chủng phân lập thuộc 3 loài: FAdV-C (chủng F5), FAdV-D (chủng F3, F8 thuộc nhóm di truyền D2) và FAdV-E (chủng F6, F7, F9, F11 thuộc nhóm di truyền D1). Đáng chú ý, chủng F5 thuộc serotype 4 - căn nguyên gây hội chứng tích nước bao tim nguy hiểm. Phân tích không gian thời gian chỉ ra serotype 4 đã xuất hiện tại miền Bắc Việt Nam sớm nhất vào khoảng năm 2005 và có mối quan hệ di truyền gần gũi với các nhánh virus tại Ấn Độ hơn là các chủng tại Trung Quốc.

Thảo luận kết quả

Tỷ lệ nhiễm virus tập trung cao nhất ở giai đoạn 3 đến 5 tuần tuổi được giải thích bởi cơ chế suy giảm miễn dịch tự nhiên. Sau 2 tuần tuổi đầu đời, hàm lượng kháng thể thụ động từ gà mẹ truyền qua lòng đỏ trứng suy giảm mạnh, trong khi hệ thống miễn dịch chủ động của gà con chưa hoàn thiện. Đây là giai đoạn virus tiềm ẩn tái kích hoạt và bài thải ồ ạt qua phân với lượng lớn nhất từ tuần thứ 4 đến tuần thứ 6, dẫn đến tốc độ lây lan nhanh chóng trong đàn nuôi nhốt mật độ cao.

Các tổn thương bệnh tích đại thể ghi nhận trên gà dương tính như gan sưng to, bở, hoại tử màu vàng và xoang bao tim tích nước hoàn toàn trùng khớp với các mô tả bệnh lý của hội chứng viêm gan thể bao hàm và hội chứng tích nước bao tim tại nhiều quốc gia trên thế giới như Ấn Độ, Pakistan, Mexico và Canada.

Về phương thức biểu diễn dữ liệu khoa học, mối tương quan giữa tỷ lệ nhiễm và lứa tuổi gà được minh họa rõ nét qua biểu đồ cột so sánh tỷ lệ dương tính 30,56% ở nhóm 3-5 tuần so với 4,54% ở nhóm trên 6 tuần tuổi. Bảng ma trận so sánh mức tương đồng nucleotide 7x7 giúp định lượng chính xác sự phân kỳ di truyền, kết hợp với sơ đồ cây phát sinh chủng loại Neighbor-Joining để trực quan hóa vị trí phân loại của các chủng virus Việt Nam trên bản đồ dịch tễ học phân tử toàn cầu.

Đề xuất và khuyến nghị

Thứ nhất, tăng cường thực hiện quy trình an toàn sinh học và sát trùng chuồng nuôi định kỳ bằng các hóa chất chuyên dụng có khả năng tiêu diệt virus trần. Chủ trang trại chăn nuôi gia cầm cần sử dụng dung dịch formaldehyde nồng độ 1‰ hoặc các hợp chất khử trùng thế hệ mới 2 lần mỗi tuần để xử lý chuồng trại, khay ấp và dụng cụ chăn nuôi, thay thế cho cồn hoặc xà phòng thông thường vốn không thể bất hoạt Fowl Adenovirus, hướng tới mục tiêu giảm thiểu trên 80% nguy cơ lây nhiễm ngang trong trang trại.

Thứ hai, triển khai chương trình giám sát dịch tễ học phân tử định kỳ hàng quý tại các vùng chăn nuôi gia cầm trọng điểm do Chi cục Chăn nuôi và Thú y phối hợp với các cơ sở đào tạo thực hiện. Ứng dụng quy trình PCR tối ưu hóa với cặp mồi FAVHL và FAVHR để sàng lọc sớm các chủng virus lưu hành, đặc biệt là serotype 4 và các phân nhóm di truyền D1, D2.

Thứ ba, nghiên cứu phát triển và sản xuất vaccine vô hoạt đa giá đồng chủng chứa kháng nguyên serotype 4 và các serotype thuộc loài FAdV-D, FAdV-E. Doanh nghiệp sản xuất dược phẩm thú y cần phối hợp với các nhà khoa học để hoàn thiện quy trình tiêm phòng cho đàn gà giống bố mẹ vào giai đoạn 14 đến 16 tuần tuổi, nhằm truyền kháng thể thụ động bảo hộ gà con trong suốt 5 tuần tuổi đầu đời.

Thứ tư, thiết lập hệ thống kiểm dịch và kiểm tra nghiêm ngặt chất lượng đàn giống thương phẩm tại các cơ sở ấp nở. Cơ quan quản lý thú y cần ban hành quy định xét nghiệm PCR bắt buộc đối với các đàn gà giống sinh sản trước giai đoạn khai thác trứng ấp, loại bỏ triệt để các đàn dương tính nhằm ngăn chặn hoàn toàn đường truyền lây dọc sang đàn gà con giống.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Bác sĩ thú y và kỹ sư chăn nuôi tại các trang trại gia cầm: Luận văn cung cấp kiến thức thực tế về triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đặc trưng và quy luật dịch tễ theo lứa tuổi của Fowl Adenovirus, hỗ trợ chẩn đoán phân biệt chính xác với bệnh Gumboro hoặc Marek để đưa ra phác đồ can thiệp kịp thời.

Nhà nghiên cứu, giảng viên và sinh viên ngành Thú y, Vi sinh vật học: Tài liệu là nguồn tham khảo phương pháp luận chuẩn xác về kỹ thuật tách chiết ADN, quy trình tối ưu hóa gradient PCR và ứng dụng các phần mềm tin sinh học như MEGA, BEAST trong phân tích dịch tễ học phân tử.

Cán bộ quản lý dịch tễ tại Cục Thú y và Chi cục Chăn nuôi Thú y các địa phương: Dữ liệu về tỷ lệ lưu hành 20,97% và nguồn gốc phát tán của serotype 4 là căn cứ khoa học quan trọng để xây dựng chính sách kiểm soát dịch bệnh và ban hành quy chuẩn kiểm dịch động vật cấp vùng.

Các doanh nghiệp sản xuất vaccine và thuốc thú y: Thông tin về sự đa dạng kiểu gen và các chủng lưu hành thực địa tại Việt Nam là cơ sở trực tiếp để định hướng lựa chọn chủng virus giống mục tiêu phục vụ nghiên cứu chế tạo bộ kit chẩn đoán nhanh và vaccine đặc hiệu.

Câu hỏi thường gặp

Fowl Adenovirus là gì và gây ra những tổn thương bệnh lý nào ở gà? Fowl Adenovirus là virus ADN chuỗi đôi thuộc giống Aviadenovirus, họ Adenoviridae. Khi xâm nhập vào cơ thể gia cầm, virus gây ra hội chứng viêm gan thể bao hàm và hội chứng xoang bao tim tích nước. Bệnh tích đại thể điển hình gồm gan sưng to, bở, xuất huyết màu vàng nhạt, thận sưng nhạt màu và xoang bao tim tích tụ lượng lớn dịch trong suốt.

Tại sao gà ở giai đoạn 3 đến 5 tuần tuổi lại có tỷ lệ nhiễm Fowl Adenovirus cao nhất? Gà ở lứa tuổi 3 đến 5 tuần tuổi có tỷ lệ dương tính lên tới 30,56% do kháng thể thụ động từ gà mẹ truyền qua lòng đỏ trứng đã suy giảm sau tuần thứ 2. Trong khi đó, hệ miễn dịch chủ động của gà con chưa hoàn thiện, tạo điều kiện cho virus tiềm ẩn tái hoạt động và lây lan nhanh chóng qua phân trong chuồng nuôi.

Kỹ thuật PCR khuếch đại gen hexon có ưu điểm gì so với xét nghiệm huyết thanh học? Xét nghiệm huyết thanh học như ELISA chỉ phát hiện kháng thể và dễ nhầm lẫn giữa kháng thể thụ động với kháng thể nhiễm trùng tự nhiên. Phản ứng PCR sử dụng cặp mồi FAVHL và FAVHR khuếch đại trực tiếp đoạn gen hexon 731 bp với độ nhạy cao, cho phép giải trình tự để phân loại chính xác serotype và kiểu gen của mầm bệnh.

Chủng Fowl Adenovirus serotype 4 tại miền Bắc Việt Nam có đặc điểm dịch tễ phân tử như thế nào? Chủng F5 phân lập được xác định thuộc serotype 4, có mức tương đồng nucleotide 99% với các chủng gây hội chứng tích nước bao tim trên thế giới. Phân tích phả hệ không gian thời gian chứng minh chủng này xuất hiện tại miền Bắc Việt Nam sớm nhất vào khoảng năm 2005 và có quan hệ di truyền gần gũi với các nhánh virus từ Ấn Độ.

Có thể tiêu diệt virus Fowl Adenovirus bằng cồn và các chất sát trùng thông thường không? Không thể tiêu diệt Fowl Adenovirus bằng cồn 50% hay các chất làm tan mỡ như ether và chloroform vì virus có cấu trúc hạt trần không màng bọc lipid và có sức đề kháng cao ở dải pH từ 3 đến 9. Khử trùng chuồng trại bắt buộc phải sử dụng dung dịch formaldehyde nồng độ 1‰ hoặc các chất sát trùng chuyên dụng có hoạt tính diệt virus không vỏ bọc.

Kết luận

• Xác định tỷ lệ lưu hành của Fowl Adenovirus trên đàn gà tại Hà Nội và vùng phụ cận đạt 20,97% trên mẫu bệnh phẩm và 57,14% trên tổng số trang trại điều tra.
• Chứng minh lứa tuổi 3 đến 5 tuần tuổi là giai đoạn mẫn cảm nhất với tỷ lệ nhiễm đạt 30,56% theo cá thể và 85,71% theo đàn.
• Làm sáng tỏ tính đa hình di truyền cao của đoạn gen hexon với 51,80% vị trí biến dị, đồng thời xác định sự hiện diện của 3 loài FAdV-C, FAdV-D và FAdV-E tại thực địa.
• Phát hiện chủng Fowl Adenovirus serotype 4 nguy hiểm lưu hành từ khoảng năm 2005 tại miền Bắc Việt Nam, có quan hệ di truyền gần gũi với các chủng tại Ấn Độ.
• Chuẩn hóa thành công quy trình kỹ thuật PCR ở nhiệt độ bắt mồi 58,5°C phục vụ chẩn đoán nhanh và giám sát dịch tễ học phân tử chính xác.

Luận văn là công trình nghiên cứu tiên phong tại Việt Nam làm sáng tỏ bức tranh dịch tễ học phân tử của Fowl Adenovirus, lấp đầy khoảng trống dữ liệu thú y về nhóm virus gây suy giảm miễn dịch trên gia cầm. Trong giai đoạn tiếp theo, các cơ quan chức năng cần mở rộng phạm vi điều tra dịch tễ học trên quy mô toàn quốc và tập trung phân lập chủng virus giống để sản xuất vaccine vô hoạt bảo hộ đàn gia cầm trước năm 2028. Người chăn nuôi và các chuyên gia thú y cần chủ động áp dụng nghiêm ngặt các biện pháp an toàn sinh học và xét nghiệm tầm soát định kỳ để giảm thiểu rủi ro dịch bệnh và nâng cao hiệu quả kinh tế bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ HÀ THU NGHIÊN CỨU SỰ LƯU HÀNH CỦA FOWL ADENOVIRUS (FAdV) Ở GÀ NUÔI TẠI HÀ NỘI VÀ VÙNG PHỤ CẬN Ngành: Thú y Mã số: 60.01 Người hướng dẫn khoa học: PGS. Huỳnh Thị Mỹ Lệ NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Hà Thu i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình.

Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc PGS. Huỳnh Thị Mỹ Lệ đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn vi sinh - truyền nhiễm, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo Đội Kiểm Dịch Động Vật Lưu Động – Chi Cục Thú Y Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện đề tài.

Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn. Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Hà Thu ii MỤC LỤC Lời cam đoan. ii Mục lục. iii Danh mục viết tắt .v Danh mục bảng.

vi Danh mục hình. vii Trích yếu luận văn. viii Thesis abstract. Tính cấp thiết của đề tài.

Mục tiêu nghiên cứu. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn. Tổng quan tài liệu. Giới thiệu chung về fowl adenovirus (adenovirus ở gia cầm).

Hình thái, cấu trúc. Cơ chế sinh bệnh. Đường truyền lây. Sức đề kháng.

Hiểu biết về bệnh do fadv gây ra ở gà. Adenovirus nhóm II. Adenovirus nhóm III: (virus gây hội chứng giảm đẻ ở gà). Vật liệu và phương pháp nghiên cứu.

Đối tượng nghiên cứu. Nội dung nghiên cứu. Địa điểm và thời gian nghiên cứu. Vật liệu nghiên cứu.

Phương pháp nghiên cứu. Phương pháp lấy mẫu. Phương pháp tách và tinh sạch ADN tổng số. Phương pháp tối ưu phản ứng PCR phát hiện FAdV.

Phương pháp nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học phân tử. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học phân tử của FAdV serotype 4. Kết quả và thảo luận. Kết quả xác định sự lưu hành fadv ở đàn gà nuôi tại hà nội và vùng phụ cận.

Kết quả tối ưu hóa phản ứng PCR. Tổng hợp tình hình thu thập mẫu phục vụ nghiên cứu. Kết quả PCR phát hiện FAdV trong mẫu bệnh phẩm. Kết quả giải trình tự gen hexon của fadv.

Kết quả phân tích trình tự nucleotide gen hexon của FAdV. Kết quả phân tích trình tự amino acid của protein hexon. Kết quả phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử của fadv. Kết quả phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử của FAdV.

Kết quả nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học phân tử của FAdV serotype 4. Kết luận và kiến nghị .43 Tài liệu tham khảo. 44 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt CAV Chicken Anemia Virus (Bệnh thiếu máu truyền nhiễm ở gà) CIAV Chicken infectious anemia Virus (Virus gây bệnh thiếu máu truyền nhiễm) EDSV Egg drop syndrome Virus (Hội chứng giảm đẻ ở gà) HHS Hydropericardium-hepatitis syndrome (Hội chứng viêm gan – viêm ngoại tâm mạc tích nước) HPS Hydropericardium syndrome (Hội chứng xoang bao tim tích nước) IBDV Infectious bursal disease Virus (Virus Gumboro) IBH Inclusion body Hepatitis (Viêm gan thể bao hàm) MDTC-RP19 Turkey lymphoblastoid B cell line, có nguồn gốc từ khối u trong bệnh Marek’s (Tế bào dòng) MSDV Marble spleen disease Virus (Virus gây bệnh lách đá hoa) THEV Turkey heamorrahgic enteritis Virus (Virus gây viêm ruột xuất huyết ở gà tây) v DANH MỤC BẢNG Bảng 3. Trình tự mồi đặc hiệu phát hiện và giải trình tự gen hexon của FAdV.

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ mồi. Trình tự hexon gen dùng trong nghiên cứu này. Tổng hợp tình hình thu thập mẫu gà theo lứa tuổi.

Kết quả PCR phát hiện FAdV theo trại được kiểm tra. Kết quả kiểm tra FAdV ở các lứa tuổi gà. Kết quả so sánh mức tương đồng nucleotide giữa 7 chủng FAdV .36 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2. Minh họa cấu trúc của Fowl adenovirus.

Gan xuất huyết, sưng to, bở, có màu vàng. Gan xuất huyết điểm. Đôi khi xuất hiện nốt hoại tử ở gan. Thận sưng to, nhạt màu, xuất huyết.

Xoang bao tim tích nước. Đôi khi quan sát được da có màu vàng, tụ máu hoặc xuất huyết thành vệt ở cơ. Gà chết đột ngột, phân có màu đen. Ruột non, đặc biệt là tá tràng có màu đỏ sẫm, mạch máu thường có dạng cành.

Ruột non bị xuất huyết, hoại tử. Lách sưng to, xuất huyết, dễ nát, có điểm hoại tử. Bệnh tiến triển, lách gà bị teo nhỏ, có màu trắng xám. Gan sưng to, dễ nát, xuất huyết tập trung thành từng đám.

Đôi khi gan bị hoại tử. Thận bị sưng to và xuất huyết. Mất màu vỏ trứng, trứng méo mó, kỳ hình. Tối ưu hóa nhiệt độ bắt mồi của phản ứng PCR.

Kết quả tối ưu nồng độ mồi của phản ứng PCR. Minh họa kết quả phản ứng PCR phát hiện FAdV. Gan gà sưng to, xuất huyết. Lách sưng to.

Kết quả giải trình tự phân đoạn gen hexon của 7 chủng FAdV phân lập. Trình tự gen hexon của 07 chủng FadV. Trình tự amino acid proteinhexon của 07 chủng FAdV. Đặc điểm thay đổi codon ở một số vùng ổn định của gen hexon.

Cây phát sinh chủng loại của FAdV. Kết quả BLAST tìm kiếm trình tự gen tương đồng 99% với chủng F5. Đặc điểm dịch tễ học phân tử theo không gian của các chủng FAdV4. 41 vii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Nguyễn Thị Hà Thu Tên luận văn: “Nghiên cứu sự lưu hành của Fowl Adenovirus (FAdV) ở gà nuôi tại Hà Nội và vùng phụ cận”.

Ngành: Thú y Mã số: 60.01 Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu - Xác định sự lưu hành của FAdV ở đàn gà thuộc địa bàn nghiên cứu. - Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học phân tử của FAdV. Nội dung nghiên cứu Trong khuôn khổ nghiên cứu của đề tài, chúng tôi thực hiện các nội dung sau: - Xác định sự lưu hành FAdV ở đàn gà nuôi tại Hà Nội và vùng phụ cận. - Giải trình tự gen mã hóa protein hexon của FadV.

- Phân tích một số đặc điểm dịch tễ học phân tử của FadV. Phương pháp nghiên cứu: - Phương pháp lấy mẫu. - Phương pháp tách và tinh sạch ADN tổng số. - Phương pháp tối ưu phản ứng PCR phát hiện FadV.

- Phương pháp phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử của FAdV serotype 4. Kết quả chính và kết luận: - Đã xác định được sự có mặt của FAdV lưu hành ở đàn gà tại các địa bàn nghiên cứu, với tỷ lệ dương tính là 20,97%. - Gà ở lứa tuổi từ 3- 5 tuần dương tính FAdV với tỷ lệ cao nhất theo đàn là 85,71% và theo cá thể là 30,56%. - Các chủng FAdV lưu hành ở Hà Nội và vùng phụ cận tương đối đa dạng về mặt di truyền.

- Chủng FAdV thuộc serotype 4 lưu hành ở miền Bắc Việt Nam sớm nhất vào khoảng năm 2005 và gần gũi về mặt di truyền với nhánh virus lưu hành ở Ấn Độ hơn các nhánh lưu hành ở Trung Quốc. viii THESIS ABSTRACT Name of Master student: Nguyen Thi Ha Thu Thesis title: “Research on the prevalence of Fowl Adenovirus (FAdV) chicken faems of Hanoi and neiyhborin proninces”. Major: Veterinary Medicine Code: 60.01 Name of Institute: Vietnam National University of Agriculture Research Objectives: - Determining the prevalence of FAdV of chicken in Hanoi and neiyhborin proninces. - Studing the molecular epidemiology of FAdV.

Research contents: Determining the prevalence of FAdV of the chicken in Hanoi and neiyhborin proninces. - Sequencing protein hexon gene of FAdV. - Analysis the hexon some of FAdV. Research methodology: - Sampling method.

- Method of total separation and purification of ADN. - PCR for identifying FadV. - Molecular phylogenetic analysis method of FAdV serotype 4. Results - The study identified of the presence of FAdV circulating in chickens in the studied region, with a positive percentage of 20.

- Chickens between 3-5 weeks of age were positive FAdV with the highest percentage 85. - FAdV strains in Hanoi and surrounding presented high genetic diversity. - Fowl adenovirus serotype 4 (FAdV-4) circulated in northern Vietnam in early 2005, and is genetically closer to the group of virus in India than those in China. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Năm 2014 tổng đàn gia cầm cả nước đạt 328,1 triệu con.

Ước tính tổng số gia cầm của cả nước năm 2016 đạt 341,5 triệu con, tăng 4,3% so với năm 2015; hiện nay tăng khoảng 3,2-3,8% so với cùng kỳ năm 2016. Ngành chăn nuôi gia cầm trong những năm gần đây không ngừng phát triển, tuy vậy còn gặp không ít khó khăn. Các trang trại chăn nuôi gia cầm với quy mô vừa và lớn mặc dù đã hình thành tại một số vùng sinh thái, song chiếm tỷ lệ chưa cao, thị trường tiêu thụ sản phẩm chăn nuôi gia cầm còn khó khăn, cơ sở hạ tầng và dịch vụ chăn nuôi nhìn chung còn thấp kém, hầu hết chưa đảm bảo quy trình kỹ thuật. Hiện nay ngành chăn nuôi gà đang phải đối mặt với tình hình dịch bệnh diễn biến rất phức tạp, trong đó có nhiều bệnh mới nổi, gây thiệt hại kinh tế.

Đồng thời nhiều tác nhân gây bệnh gây ức chế miễn dịch khiến cho sức đề kháng của gà giảm, rất dễ mắc các bệnh kế phát.