Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Ngành công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển kinh tế nhưng là ngành tiêu tốn nhiều tài nguyên, sử dụng nhiều vốn và có nguy cơ tác động tiêu cực đến môi trường. Theo quy hoạch phát triển ngành giấy được trích dẫn trong văn bản, Việt Nam đặt mục tiêu sản xuất 600.000 tấn bột giấy vào năm 2010 và 1.000 tấn vào năm 2020 (gia tăng sản xuất từ 2 đến 3 lần). Sự gia tăng công suất này đặt ra thách thức lớn về ô nhiễm môi trường nếu không có các giải pháp công nghệ thân thiện đi kèm nhằm cắt giảm lượng hóa chất sử dụng trong các công đoạn xử lý bột thô.

Mặt khác, sản xuất giấy là ngành tiêu tốn năng lượng cao, trong đó chi phí năng lượng nghiền chiếm khoảng 15% đến 18% tổng năng lượng cần thiết của quá trình sản xuất và chiếm từ 18% đến 25% giá thành sản phẩm. Nghiền là quá trình xử lý cơ học nhằm làm xơ sợi phân tơ, chổi hóa và tăng cường khả năng liên kết giữa các xơ sợi. Tuy nhiên, việc nghiền thuần túy bằng cơ học thường làm đứt gãy xơ sợi, tạo ra nhiều xơ sợi mịn, làm giảm độ bền của giấy và giảm tính thoát nước của huyền phù bột giấy.

Việc ứng dụng các chế phẩm sinh học, cụ thể là các enzyme thủy phân như cellulase (đặc biệt là endoglucanase/CMCase) và xylanase để tiền xử lý bột giấy trước khi nghiền, là hướng đi kỹ thuật có khả năng hỗ trợ làm mềm, bóc tách và chổi hóa xơ sợi. Quá trình tiền xử lý bằng enzyme giúp giảm từ 6% đến 30% năng lượng nghiền, cải thiện khả năng thoát nước trên lưới xeo, giảm tiêu hao hơi nóng ở giai đoạn sấy và nâng cao tính chất cơ lý của sản phẩm giấy. Mặc dù nấm sợi là nguồn sản xuất xylanase và cellulase truyền thống, enzyme từ nấm thường có pH tối ưu trong vùng acid (dưới 5,5) và kém bền nhiệt, đòi hỏi phải điều chỉnh pH và hạ nhiệt độ huyền phù bột giấy, làm tăng chi phí sản xuất. Ngược lại, xạ khuẩn và vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme bền nhiệt, hoạt động tốt ở pH trung tính hoặc kiềm, phù hợp với điều kiện vận hành thực tế của các nhà máy sản xuất giấy.

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Cấn Thị Dung (ngành Công nghệ sinh học, Trường Đại học Mở Hà Nội, năm 2021) được thực hiện nhằm giải quyết vấn đề trên, với đề tài: "Nghiên cứu thu nhận enzyme xylanase và CMCase từ xạ khuẩn ứng dụng trong trợ nghiền bột giấy".

Mục tiêu nghiên cứu của khóa luận là nghiên cứu thu nhận enzyme xylanase/CMCase từ chủng xạ khuẩn và bước đầu đánh giá khả năng ứng dụng của enzyme thu nhận từ chủng xạ khuẩn tiềm năng trong trợ nghiền bột giấy.

Nhiệm vụ nghiên cứu được xác định gồm 4 nội dung cụ thể:

  1. Nghiên cứu các đặc điểm sinh học và định danh chủng tuyển chọn.
  2. Nghiên cứu một số điều kiện (môi trường, nhiệt độ, pH, thời gian) thích hợp sinh tổng hợp xylanase và CMCase của chủng xạ khuẩn tuyển chọn.
  3. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme xylanase/CMCase (khảo sát các phương pháp tách chiết sơ bộ và thu hồi enzyme).
  4. Bước đầu đánh giá tiềm năng ứng dụng của enzyme thu nhận trong trợ nghiền bột giấy.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Chủng xạ khuẩn mang ký hiệu CXVC1-28 thuộc bộ sưu tập giống của Phòng Vi sinh vật đất – Viện Công nghệ sinh học (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam), được phân lập từ mẫu vỏ cây thu thập tại Tổng công ty Giấy Bãi Bằng.
  • Phạm vi không gian và thời gian: Nghiên cứu thực nghiệm được thực hiện tại Phòng Vi sinh vật đất – Viện Công nghệ sinh học và Khoa Công nghệ sinh học – Trường Đại học Mở Hà Nội, hoàn thành vào tháng 5 năm 2021. Khóa luận được hỗ trợ kinh phí từ đề tài: "Nghiên cứu công nghệ chế tạo chế phẩm enzyme trong nghiền từ vi khuẩn-xạ khuẩn chịu nhiệt và ứng dụng trên dây chuyền sản xuất giấy Tissue", mã số ĐT.19/CNSHCB thuộc Đề án phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực công nghiệp chế biến năm 2020 của Bộ Công thương.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Cơ sở lý thuyết

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng lý thuyết vi sinh vật học công nghiệp, hóa sinh học enzyme và công nghệ sản xuất bột giấy:

  • Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn: Xạ khuẩn thuộc giới Prokaryote, nhóm vi khuẩn Gram dương hiếu khí có cấu trúc dạng sợi phân nhánh, ADN có hàm lượng G+C cao (chiếm 57% đến 75%). Xạ khuẩn hình thành hai loại hệ sợi gồm khuẩn ty cơ chất (làm nhiệm vụ dinh dưỡng) và khuẩn ty khí sinh (sinh ra chuỗi bào tử trần theo dạng cắt khúc hoặc kết đoạn). Hình thái cuống sinh bào tử (dạng thẳng RF, móc câu RA, hay xoắn lò xo S) và bề mặt bào tử (trơn Sm, gai Sp, mụn cóc Wa) là các tiêu chí cơ bản để phân loại xạ khuẩn theo tiêu chuẩn của Dự án Xạ khuẩn Quốc tế (International Streptomyces Project - ISP).
  • Bản chất và cơ chế tác dụng của hệ enzyme thủy phân:
    • Enzyme xylanase: Xylan là polysaccharide chủ yếu cấu tạo nên hemicellulose ở thực vật (chiếm 15-30% chất khô ở cây hạt kín và 7-15% ở cây hạt trần). Xylanase thủy phân liên kết $\beta$-1,4-xylanosidic bên trong mạch xylan, giải phóng các xylo-oligosaccharide (xylobiose, xylotriose), hỗ trợ loại bỏ các liên kết phức tạp giữa hemicellulose và lignin.
    • Enzyme CMCase (Carboxymethyl cellulase / Endoglucanase): Là thành phần thuộc hệ cellulase, có khả năng cắt ngẫu nhiên các liên kết $\beta$-1,4-glucosid tại các vùng vô định hình của cellulose, giải phóng cellodextrin, cellobiose và glucose. Trong trợ nghiền, endoglucanase tác động thủy phân có chọn lọc các xơ sợi mịn và bộc lộ các nhóm hydroxyl (-OH) trên bề mặt sợi cellulose mà không làm suy giảm nghiêm trọng độ bền của mạch cellulose kết tinh.
  • Cơ chế trợ nghiền bằng enzyme: Tác động của xylanase và CMCase lên huyền phù bột giấy làm biến đổi cấu trúc thành tế bào xơ sợi, tạo điều kiện thuận lợi cho nước thẩm thấu vào cấu trúc xơ sợi, thúc đẩy sự trương nở và làm xơ sợi dễ bị chổi hóa khi đi qua các đĩa nghiền cơ học. Điều này cho phép đạt được độ nghiền (°SR) mong muốn với số vòng nghiền hoặc thời gian nghiền thấp hơn.

Phương pháp nghiên cứu

Khóa luận sử dụng các phương pháp thực nghiệm vi sinh vật học, sinh học phân tử và hóa sinh học tiêu chuẩn:

  • Phương pháp nuôi cấy và phân tích hình thái: Khảo sát khả năng sinh trưởng, đặc điểm khuẩn ty khí sinh, khuẩn ty cơ chất và sự hình thành sắc tố trên 8 môi trường tiêu chuẩn ISP (ISP1 đến ISP8). Quan sát hình thái cuống sinh bào tử dưới kính hiển vi quang học Olympus CHD và cấu trúc bề mặt bào tử dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM Model JSM-5000 tại Viện Khoa học Vật liệu). Khảo sát khả năng đồng hóa các nguồn carbon (D-glucose, L-arabinose, sucrose, D-xylose, D-mannitol, D-fructose, lactose, D-raffinose) trên môi trường cơ sở ISP9.
  • Phương pháp sinh học phân tử định danh loài: Tách chiết DNA tổng số theo phương pháp của Sambrook và cộng sự. Khuếch đại đoạn gen mã hóa 16S rDNA bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi phổ biến 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') và 1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'). Điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 1,0%, tinh sạch bằng bộ kit PureLink™ DNA Purification (Invitrogen) và giải trình tự tự động trên hệ thống ABI PRISM® 3100-Avant Genetic Analyzer. So sánh độ tương đồng trình tự với cơ sở dữ liệu GenBank (NCBI).
  • Phương pháp xác định hoạt tính enzyme: Sử dụng thuốc thử axit 3,5-dinitrosalicylic (DNSA) để định lượng hàm lượng đường khử tạo thành sau phản ứng thủy phân cơ chất ở 50°C trong 30 phút, đo mật độ quang học (OD) tại bước sóng 540 nm:
    • Hoạt tính CMCase: Xác định dựa trên khả năng thủy phân cơ chất carboxymethyl cellulose (CMC) 1%, đường khử chuẩn là Glucose. Một đơn vị hoạt tính (U) là lượng enzyme giải phóng 1 $\mu$mol đường khử tương đương glucose trong một phút ở điều kiện thí nghiệm.
    • Hoạt tính xylanase: Xác định dựa trên khả năng thủy phân cơ chất xylan 1%, đường khử chuẩn là Xylose. Một đơn vị hoạt tính (U) là lượng enzyme giải phóng 1 $\mu$mol đường khử tương đương xylose trong một phút ở điều kiện thí nghiệm.
  • Phương pháp tối ưu hóa điều kiện lên men: Nuôi cấy chủng xạ khuẩn trên môi trường lên men lỏng Noura lắc 200 vòng/phút, khảo sát các yếu tố đơn lẻ gồm: loại cơ chất cảm ứng (lõi ngô, CMC, bột gỗ, bã mía, cám mì - Wheat bran với tỷ lệ 2%), nhiệt độ nuôi cấy (nhiệt độ phòng, 25°C, 37°C, 45°C, 50°C), pH môi trường (pH 5 đến 9 hoặc 10) và thời gian lên men (theo dõi chu kỳ từ 24 đến 168 giờ, định kỳ lấy mẫu 24 giờ/lần).
  • Phương pháp thu hồi và tách chiết sơ bộ enzyme: Sử dụng phương pháp kết tủa protein bằng dung môi hữu cơ (acetone lạnh với các tỷ lệ thể tích acetone : dịch enzyme là 1:1, 2:1, 3:1, 4:1) và phương pháp kết tủa bằng muối trung tính (amoni sunfat với độ bão hòa từ 40% đến 90%). Kết tủa được hòa tan lại trong đệm phosphate pH 6,0 để xác định khối lượng protein thu hồi (g/L) và hiệu suất thu hồi hoạt tính enzyme (%).
  • Phương pháp thử nghiệm trợ nghiền bột giấy: Xử lý bột giấy từ gỗ mềm tẩy trắng (BSKP) và bột giấy từ gỗ cứng tẩy trắng (BHKP) với chế phẩm enzyme thu được sau tủa acetone. Thông số xử lý: nồng độ bột giấy 4%, pH tự nhiên của bột giấy là 7,6, nhiệt độ 50°C, thời gian 45 phút, liều lượng enzyme 0,216 U/30 g bột giấy khô. Tiến hành nghiền 7.500 vòng trên máy nghiền thí nghiệm PFI, đo độ nghiền theo thang đo Schopper-Riegler (°SR) và quan sát hình thái vi cấu trúc xơ sợi bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM).

Nguồn dữ liệu

Dữ liệu của nghiên cứu hoàn toàn là dữ liệu sơ cấp thu nhận từ các đợt thí nghiệm lặp lại tại phòng thí nghiệm: số liệu đo mật độ quang học OD540, số liệu đường chuẩn glucose và xylose ($R^2 \ge 0,99$), số liệu giải trình tự 16S rDNA đăng ký trên ngân hàng GenBank với mã số MW133052, số liệu hiệu suất thu hồi protein, số liệu độ nghiền (°SR) và ảnh chụp SEM cấu trúc xơ sợi trước và sau khi xử lý enzyme.

Nội dung chính theo từng chương

Phần I: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng kết cơ sở lý thuyết và các nghiên cứu trong nước, quốc tế liên quan đến đề tài:

  • Trình bày đặc điểm hình thái, cấu trúc tế bào, đặc tính sinh dưỡng và hệ enzyme ngoại bào của xạ khuẩn. Nhấn mạnh xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp cellulase (dạng endoglucanase) và xylanase bền nhiệt, hoạt động ở dải pH từ trung tính đến kiềm (pH 6 đến 10), chu kỳ sinh trưởng ngắn hơn nấm sợi và dễ nuôi cấy thích ứng.
  • Phân tích cấu trúc phân tử của xylan và cellulose cùng cơ chế tác dụng của các enzyme thủy phân tương ứng. Xylanase cắt đứt liên kết $\beta$-1,4-xylanosidic tạo ra các chuỗi xylo-oligosaccharide ngắn. Endoglucanase (CMCase) cắt ngẫu nhiên mạch cellulose bên trong vùng vô định hình, đóng vai trò khởi đầu quá trình thủy phân cellulose polymer mà không gây tổn hại cấu trúc kết tinh.
  • Tổng hợp các công trình ứng dụng enzyme trong trợ nghiền bột giấy: từ các phát minh đầu tiên của Bolaski (1952), Yerkes (1968), Noe (1986) đến các nghiên cứu quy mô phòng thí nghiệm và nhà máy. Các tài liệu công bố chứng minh tiền xử lý bột giấy bằng enzyme xylanase và cellulase giúp giảm năng lượng nghiền từ 6% đến 30% (thậm chí 18% đến 45% ở một số thử nghiệm hỗn hợp), tiết kiệm 25 kWh/tấn bột giấy, giảm 20% lượng hơi tiêu thụ cho sấy giấy, hạn chế tắc nghẽn dây chuyền và tăng sản lượng máy xeo thêm 12%.
  • Tổng kết các yếu tố công nghệ ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp xylanase và CMCase từ vi sinh vật như nguồn dinh dưỡng carbon, nguồn nitơ, pH ban đầu của môi trường, nhiệt độ lên men và việc bổ sung chất trợ hoạt động bề mặt (như Tween-80 ở nồng độ 0,4% đến 0,6%).

Phần II: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết các nguyên vật liệu, hóa chất, chủng vi sinh vật và các quy trình thực nghiệm được triển khai:

  • Nêu rõ xuất xứ của chủng xạ khuẩn CXVC1-28 (thuộc phòng Vi sinh vật đất, phân lập từ vỏ cây tại Tổng công ty Giấy Bãi Bằng).
  • Liệt kê thành phần định lượng của 14 loại môi trường nuôi cấy và phân lập: Czapek, Bennet, Gause I, Gause II, AH4, Casein thủy phân (SCA), Noura, và 8 môi trường chuẩn ISP (ISP1 đến ISP8).
  • Mô tả chi tiết quy trình dựng đường chuẩn đường khử glucose và xylose với thuốc thử DNSA theo dải nồng độ từ 0 đến 1,0 mg/mL, thiết lập công thức toán học tính toán hoạt tính enzyme (U/L và U/mL).
  • Trình bày quy trình kỹ thuật khuếch đại gen 16S rDNA bằng cặp mồi 27F/1492R, chu trình nhiệt PCR, kiểm tra trên gel agarose 1% và quy trình giải trình tự gen.
  • Thiết lập quy trình khảo sát tối ưu hóa các thông số lên men (loại cơ chất 2%, nhiệt độ 25-50°C, pH 5-10, thời gian 24-168 giờ) và quy trình thử nghiệm trợ nghiền trên máy PFI (7.500 vòng) đối với hai mẫu bột giấy BSKP và BHKP.

Phần III: Kết quả và thảo luận

Chương này trình bày toàn bộ số liệu thực nghiệm thu được và các phân tích học thuật tương ứng:

1. Đặc điểm sinh học và định danh chủng tuyển chọn

  • Đặc điểm nuôi cấy: Chủng CXVC1-28 sinh trưởng tốt trên các môi trường ISP1, ISP2, ISP3, ISP4 và ISP7; sinh trưởng yếu trên ISP5, ISP6, ISP8. Khuẩn lạc đạt kích thước đường kính 2 đến 4 mm trên môi trường Bennet. Khuẩn ty khí sinh (KTKS) có dạng vôi bột, màu xám trắng đến xám nâu đậm (được xếp vào nhóm xám - Gray). Khuẩn ty cơ chất (KTCC) có màu nâu nhạt đến vàng nâu. Chủng không sinh sắc tố tan và không sinh sắc tố melanin trên các môi trường ISP1, ISP6, ISP7.
  • Đặc tính sinh lý: Chủng sinh trưởng trong dải nhiệt độ từ 20°C đến 55°C, phát triển tối ưu trong khoảng 30°C đến 45°C (chủng chịu nhiệt). Chủng sinh trưởng được ở dải pH rộng từ 5 đến 11, phát triển tốt nhất ở pH 5 đến 9.
  • Hình thái cơ quan sinh sản: Dưới kính hiển vi quang học và kính hiển vi điện tử quét (SEM), cuống sinh bào tử có dạng xoắn lò xo (Spirales - S). Mỗi chuỗi dài gồm 25 đến 30 bào tử dạng hình bầu dục.
  • Khả năng đồng hóa carbon: Đồng hóa tốt D-glucose, L-arabinose, D-xylose, D-fructose và lactose (trong đó L-arabinose, D-xylose và lactose cho sinh trưởng mạnh nhất); không có khả năng đồng hóa sucrose, D-mannitol và D-raffinose.
  • Khả năng sinh enzyme ngoại bào: Chủng tạo vòng phân hủy lớn trên đĩa thạch bổ sung xylan và CMC khi thử với thuốc thử Lugol; phân hủy yếu tinh bột tan; hoàn toàn không phân hủy cellulose kết tinh (chứng tỏ chủng không tiết enzyme cellulase hoàn chỉnh mà chỉ tiết endoglucanase/CMCase).
  • Định danh phân tử: Đoạn gen 16S rDNA sau giải trình tự có độ tương đồng 99% với các chủng Streptomyces mexicanus CH-M-1035 (NR_114647.1), S. mexicanus TSII-18 (JN993717.1) và S. thermodiastaticus JCM 4840 (NR_112048.1). Kết hợp các đặc điểm hình thái và sinh hóa, chủng được định danh là Streptomyces mexicanus CXVC1-28 và đã đăng ký trên GenBank với mã số MW133052.

2. Nghiên cứu điều kiện thích hợp sinh tổng hợp xylanase và CMCase

  • Môi trường và cơ chất: Môi trường lỏng Noura bổ sung 2% cơ chất cho hoạt độ cao nhất. Trong các cơ chất khảo sát, cơ chất lõi ngô 2% kích thích đồng thời cả hai enzyme với hoạt độ xylanase đạt 7,53 U/mL và CMCase đạt 4,96 U/mL (với cơ chất CMC 2%, CMCase đạt 5,85 U/mL nhưng xylanase thấp hơn). Do đó, lõi ngô được chọn làm nguồn cơ chất cảm ứng thích hợp.
  • Nhiệt độ lên men: Nhiệt độ 45°C cho hoạt tính sinh tổng hợp cao nhất (xylanase đạt 13,75 ± 0,26 U/mL; CMCase đạt 3,57 ± 0,29 U/mL). Khi nuôi cấy ở nhiệt độ phòng (25°C), 37°C hoặc 50°C, hoạt độ của cả hai enzyme đều thấp hơn rõ rệt.
  • pH môi trường: Môi trường có pH ban đầu bằng 6 là tối ưu nhất cho sự sinh tổng hợp của cả hai enzyme (xylanase đạt 22,59 ± 0,80 U/mL; CMCase đạt 5,33 ± 0,14 U/mL). Ở pH 7 đến 9, hoạt độ xylanase giảm mạnh (ở pH 9 chỉ còn 0,128 U/mL) và CMCase hoàn toàn không được tổng hợp ở pH 8 và 9.
  • Động học theo thời gian nuôi cấy: Sinh tổng hợp xylanase tăng dần từ 48 giờ và đạt đỉnh cực đại tại 96 giờ với hoạt độ 26,65 ± 3,11 U/mL, sau đó giảm dần. Ngược lại, CMCase chỉ bắt đầu xuất hiện rõ sau 48-72 giờ, duy trì ở mức thấp (khoảng 1,37 đến 1,48 U/mL) từ 72 đến 120 giờ, sau đó tăng vọt ở giai đoạn 144 đến 168 giờ, đạt đỉnh cực đại 7,63 U/mL tại 168 giờ.

3. Tách chiết sơ bộ enzyme

  • Kết tủa bằng acetone lạnh: Khi tăng tỷ lệ acetone : dịch enzyme từ 1:1 lên 4:1, lượng protein tủa tăng từ 1,5 g/L lên 25,5 g/L. Ở tỷ lệ 4:1, hiệu suất thu hồi xylanase đạt 75,04% và CMCase đạt 78,93%.
  • Kết tủa bằng amoni sunfat: Nồng độ muối 80% cho hiệu suất thu hồi xylanase cao nhất (89,23%) nhưng hoạt tính CMCase bị mất hoàn toàn (0%). Ngược lại, nồng độ muối 50% thu hồi CMCase tốt nhất (59,89%) nhưng hiệu suất xylanase chỉ đạt 24,43%.
  • Tác giả chọn phương pháp kết tủa bằng acetone lạnh tỷ lệ 4:1 để thu hồi đồng thời cả hai enzyme và tránh lượng muối tồn dư gây ảnh hưởng xấu đến quy trình xeo giấy.

4. Thử nghiệm trợ nghiền bột giấy

Thử nghiệm xử lý bột giấy với chế phẩm enzyme sau tủa acetone (liều lượng 0,216 U/30 g bột giấy, pH 7,6, 50°C, 45 phút) và nghiền 7.500 vòng trên máy PFI cho kết quả:

  • Mẫu bột giấy gỗ mềm tẩy trắng (BSKP): Độ nghiền tăng từ 32°SR (mẫu đối chứng không enzyme) lên 37°SR (mẫu có enzyme), tăng 5°SR.
  • Mẫu bột giấy gỗ cứng tẩy trắng (BHKP): Độ nghiền tăng từ 35°SR (đối chứng) lên 36°SR (mẫu có enzyme), tăng 1°SR.
  • Hình ảnh chụp kính hiển vi điện tử quét (SEM) chứng minh xơ sợi bột giấy được xử lý enzyme có mức độ phân tơ và chổi hóa bề mặt vượt trội so với đối chứng, thành tế bào sợi bị bóc tách nhẹ, bộc lộ nhiều liên kết -OH giúp giảm năng lượng cơ học cần thiết khi nghiền.

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính

Khóa luận đã định lượng cụ thể các chỉ tiêu vi sinh, hóa sinh và công nghệ thông qua các bảng số liệu thực nghiệm:

Bảng 1: Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH môi trường đến khả năng sinh tổng hợp enzyme của chủng CXVC1-28

Yếu tố khảo sát Mức khảo sát Hoạt tính Xylanase (U/mL) Hoạt tính CMCase (U/mL)
Nhiệt độ (°C) 25 2,19 ± 0,30 0,23 ± 0,07
37 9,16 ± 0,29 3,24 ± 0,37
45 (tối ưu) 13,75 ± 0,26 3,57 ± 0,29
50 1,29 ± 0,04 2,03 ± 0,16
Độ pH môi trường 5 15,24 ± 1,60 4,24 ± 0,43
6 (tối ưu) 22,59 ± 0,80 5,33 ± 0,14
7 7,12 ± 1,18 3,55 ± 0,02
8 3,88 ± 0,42 0
9 0,128 ± 0,01 0

Bảng 2: So sánh hiệu quả thu hồi enzyme giữa các phương pháp kết tủa

Phương pháp kết tủa Tỷ lệ / Nồng độ Protein tủa (g/L) Hiệu suất thu hồi Xylanase (%) Hiệu suất thu hồi CMCase (%)
Acetone lạnh 1:1 1,5 13,67 13,51
2:1 9,5 43,85 34,22
3:1 19,7 60,55 43,85
4:1 (lựa chọn) 25,5 75,04 78,93
Amoni sunfat 40% 7,6 26,91 43,58
50% 11,7 24,43 59,89
60% 15,9 21,34 2,94
70% 14,1 72,56 0
80% 24,7 89,23 0
90% 32,4 70,24 0

Bảng 3: Khảo sát sơ bộ hiệu quả trợ nghiền bột giấy sau 7.500 vòng nghiền trên máy PFI

Loại bột giấy thử nghiệm Độ nghiền mẫu đối chứng (°SR) Độ nghiền mẫu xử lý enzyme (°SR) Chênh lệch độ nghiền (°SR)
BSKP (Gỗ mềm tẩy trắng) 32 37 +5
BHKP (Gỗ cứng tẩy trắng) 35 36 +1

Giải pháp và kiến nghị kỹ thuật của tác giả

  • Tận dụng phế phụ phẩm nông nghiệp: Khuyến nghị sử dụng phụ phẩm lõi ngô 2% làm cơ chất cảm ứng rẻ tiền thay thế cho các cơ chất tinh khiết đắt tiền (như xylan hay CMC thương phẩm) trong quy mô lên men công nghiệp, giúp hạ giá thành sản xuất enzyme.
  • Lựa chọn phương án công nghệ thu hồi: Khuyến nghị sử dụng phương pháp tủa acetone lạnh ở tỷ lệ 4:1 để thu hồi đồng thời cả xylanase và CMCase với hiệu suất cao (trên 75%), loại bỏ nhược điểm lẫn muối vô cơ của phương pháp tủa bằng amoni sunfat.
  • Khuyến nghị ứng dụng thực tế: Ứng dụng chế phẩm enzyme phối hợp này ưu tiên cho dòng bột giấy gỗ mềm (BSKP) do cấu trúc xơ sợi dài của gỗ mềm phản ứng nhạy hơn với enzyme, giúp tăng độ nghiền rõ rệt (tăng 5°SR) so với bột gỗ cứng.

Đóng góp của đề tài

  • Tuyển chọn và định danh chính xác bằng sinh học phân tử một chủng xạ khuẩn chịu nhiệt bản địa Streptomyces mexicanus CXVC1-28 có hoạt tính sinh tổng hợp xylanase và endoglucanase/CMCase cao, bổ sung dữ liệu phân loại học vào ngân hàng GenBank quốc tế (mã số MW133052).
  • Xác định được quy luật động học tách biệt về thời gian sinh tổng hợp giữa hai loại enzyme: xylanase đạt đỉnh sớm ở 96 giờ, trong khi CMCase đạt đỉnh muộn ở 168 giờ, cung cấp cơ sở thông số vận hành quan trọng cho việc điều khiển quá trình lên men thu hồi từng loại enzyme hoặc thu hồi hỗn hợp.
  • Cung cấp dẫn chứng thực nghiệm về tính khả thi của việc sử dụng dịch enzyme thô từ xạ khuẩn để hỗ trợ quá trình chổi hóa xơ sợi, làm tăng độ nghiền bột giấy mà không cần qua các bước tinh sạch phức tạp.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

  • Quy mô nghiên cứu hoàn toàn dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm (bình tam giác nuôi lắc 250 mL và máy nghiền thí nghiệm PFI với mẻ nghiền 30 g bột giấy), chưa thực hiện ở quy mô thiết bị lên men bán công nghiệp (fermentor) hay dây chuyền sản xuất thực tế.
  • Khóa luận mới tiến hành tách chiết sơ bộ bằng dung môi và muối trung tính, chưa tinh sạch triệt để để xác định khối lượng phân tử, cấu trúc protein cũng như các hằng số động học enzym học ($K_m, V_{max}$).
  • Thử nghiệm trợ nghiền mới chỉ đánh giá sơ bộ qua chỉ tiêu độ nghiền (°SR) và ảnh SEM định tính; văn bản chưa cung cấp số liệu đo lường trực tiếp về lượng điện năng (kWh) tiết kiệm được trên máy nghiền hoặc các chỉ tiêu cơ lý hoàn chỉnh của tờ giấy xeo thành phẩm (độ bền kéo, độ bền xé, độ bục, độ nhẵn).

Hướng nghiên cứu tiếp

  • Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy trên hệ thống nồi lên men (fermentor) tự động kiểm soát pH, oxy hòa tan và nhiệt độ để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp enzyme ở quy mô lớn hơn.
  • Nghiên cứu tỷ lệ phối trộn tối ưu giữa xylanase thu hồi tại thời điểm 96 giờ và CMCase thu hồi tại thời điểm 168 giờ để tạo ra chế phẩm enzyme trợ nghiền có tỷ lệ hoạt lực cân đối nhất.
  • Đưa chế phẩm enzyme vào thử nghiệm trên dây chuyền sản xuất giấy Tissue công nghiệp theo đúng định hướng của đề tài Bộ Công thương (Mã số ĐT.19/CNSHCB), đánh giá toàn diện mức tiêu hao năng lượng nghiền, lượng hơi sấy và các đặc tính cơ lý của giấy Tissue thương phẩm.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo hữu ích cho các nhóm đối tượng:

  • Sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu chuyên ngành Công nghệ sinh học, Vi sinh vật học ứng dụng: Cung cấp quy trình bài bản từ phân lập, mô tả hình thái theo hệ thống tiêu chuẩn ISP, định danh phân tử 16S rDNA cho đến phương pháp định lượng hoạt tính enzyme bằng thuốc thử DNSA.
  • Kỹ sư công nghệ và cán bộ kỹ thuật ngành Công nghệ Hóa học, Công nghệ Giấy và Bột giấy: Cung cấp thông số kỹ thuật thực nghiệm về điều kiện tiền xử lý bột giấy (nồng độ bột 4%, pH 7,6, nhiệt độ 50°C, thời gian 45 phút, liều lượng enzyme) và cơ chế tác động lên xơ sợi BSKP, BHKP.
  • Các nghiên cứu về tận dụng phụ phẩm nông nghiệp: Cung cấp dữ liệu thực nghiệm về việc tái sử dụng lõi ngô làm cơ chất cảm ứng lên men sinh học, phục vụ định hướng phát triển kinh tế tuần hoàn và công nghệ sản xuất sạch hơn.

Câu hỏi thường gặp

Chủng xạ khuẩn nghiên cứu có nguồn gốc từ đâu và được định danh là loài gì?

Chủng mang ký hiệu CXVC1-28, được phân lập từ mẫu vỏ cây thu thập tại Tổng công ty Giấy Bãi Bằng, thuộc bộ sưu tập giống của Phòng Vi sinh vật đất – Viện Công nghệ sinh học. Qua phân tích trình tự gen 16S rDNA kết hợp với đặc điểm hình thái và sinh lý học, chủng được định danh là Streptomyces mexicanus CXVC1-28, có mã số đăng ký trên ngân hàng GenBank là MW133052.

Các điều kiện môi trường tối ưu để chủng S. mexicanus CXVC1-28 sinh tổng hợp xylanase và CMCase là gì?

Điều kiện tối ưu được xác định gồm: môi trường lên men Noura bổ sung 2% cơ chất lõi ngô; nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là 45°C; pH ban đầu của môi trường là 6. Hoạt độ xylanase đạt cực đại tại thời điểm 96 giờ (26,65 ± 3,11 U/mL), trong khi hoạt độ CMCase đạt cực đại tại thời điểm 168 giờ (7,63 U/mL).

Vì sao tác giả chọn phương pháp kết tủa bằng acetone lạnh thay vì muối amoni sunfat để thu hồi enzyme?

Mặc dù kết tủa bằng muối amoni sunfat ở nồng độ 80% cho hiệu suất thu hồi xylanase cao hơn (89,23%), nhưng nồng độ này làm mất hoàn toàn hoạt tính của CMCase (0%). Hơn nữa, việc sử dụng amoni sunfat để lại hàm lượng muối dư cao trong chế phẩm, có thể ảnh hưởng tiêu cực đến quy trình sản xuất giấy. Phương pháp tủa bằng acetone lạnh ở tỷ lệ 4:1 cho phép thu hồi đồng thời cả hai enzyme với hiệu suất cao (xylanase đạt 75,04% và CMCase đạt 78,93%), tạo ra khối lượng protein tủa 25,5 g/L mà không để lại tồn dư muối vô cơ.

Khả năng trợ nghiền của chế phẩm enzyme thể hiện như thế nào trên các loại bột giấy khác nhau?

Khi xử lý bột giấy ở điều kiện pH 7,6, nhiệt độ 50°C, thời gian 45 phút và nghiền 7.500 vòng trên máy PFI, chế phẩm enzyme làm tăng độ nghiền của bột gỗ mềm tẩy trắng (BSKP) từ 32°SR lên 37°SR (tăng 5°SR). Đối với bột gỗ cứng tẩy trắng (BHKP), độ nghiền chỉ tăng nhẹ từ 35°SR lên 36°SR (tăng 1°SR). Ảnh chụp SEM cho thấy xơ sợi BSKP được phân tơ và chổi hóa rõ rệt, bộc lộ các nhóm -OH giúp tăng liên kết giữa các xơ sợi.

Chủng S. mexicanus CXVC1-28 có khả năng phân hủy cellulose tự nhiên hay không?

Chủng CXVC1-28 chỉ có khả năng phân hủy CMC (sinh endoglucanase/CMCase) và xylan (sinh xylanase), hoàn toàn không tạo vòng phân hủy trên môi trường chứa cellulose kết tinh tự nhiên. Đặc tính này là một ưu điểm kỹ thuật trong ngành giấy, vì enzyme chỉ cắt chọn lọc các vùng vô định hình và xơ sợi mịn mà không phá hủy cấu trúc khung sợi cellulose, giúp giữ vững độ bền cơ lý của sản phẩm giấy.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Cấn Thị Dung đã phân lập, tuyển chọn và định danh thành công chủng xạ khuẩn chịu nhiệt Streptomyces mexicanus CXVC1-28 (GenBank: MW133052) từ vỏ cây tại vùng nguyên liệu giấy Bãi Bằng. Tác giả đã xác định được các thông số môi trường tối ưu (môi trường Noura bổ sung 2% lõi ngô, 45°C, pH 6) và quy luật động học sinh tổng hợp xylanase (đạt đỉnh tại 96 giờ) và CMCase (đạt đỉnh tại 168 giờ), đồng thời lựa chọn phương pháp tủa acetone tỷ lệ 4:1 để thu hồi chế phẩm enzyme đạt hiệu suất trên 75%. Thử nghiệm thực tế trên máy nghiền PFI đã chứng minh chế phẩm enzyme thu nhận có khả năng làm tăng độ nghiền của bột giấy gỗ mềm BSKP thêm 5°SR và cải thiện rõ rệt mức độ chổi hóa xơ sợi, tạo cơ sở thực nghiệm vững chắc cho việc ứng dụng công nghệ enzyme trong tiết kiệm năng lượng nghiền ở ngành sản xuất giấy.