Luận văn thạc sĩ: Nghiên cứu tính chất enzyme acetylcholinesterase từ hồng cầu bò

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu hus tinh sạch và nghiên cứu tính chất của enzyme acetylcholinesterase từ hồng cầu bò 14, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân, đề xuất giải pháp

• Tác giả: Đào Thị Hƣơng Giang
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Văn Hoàng
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Tinh Sạch Và Nghiên Cứu Tính Chất Của Enzyme Acetylcholinesterase Từ Hồng Cầu Bò
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sỹ khoa học
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CÁM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Lịch sử phát hiện và vai trò của enzyme acetylcholinesterase
• 1.2. Phân loại enzyme acetylcholinesterase
• 1.3. Phân bố và chức năng của enzyme acetylcholinesterase
• 1.4. Cấu tạo của enzyme acetylcholinesterase
• 1.5. Tổng quan về các phương pháp tinh sạch enzyme acetylcholinesterase
• 1.6. Tình hình nghiên cứu tinh sạch enzyme acetylcholinesterase trên thế giới
• 1.7. Tình hình nghiên cứu tinh sạch enzyme acetylcholinesterase ở Việt Nam
• 1.8. Một số nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ, pH đến hoạt độ của enzyme acetylcholinesterase
• 1.9. Ứng dụng của enzyme acetylcholinesterase
• 1.10. Một số nghiên cứu nhân dòng và biểu hiện gen acetylcholinesterase
• 1.11. Đặc điểm gen mã hóa enzyme acetylcholinesterase
• 1.12. Một số nghiên cứu nhân dòng và biểu hiện gen acetylcholinesterase
• 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Phương pháp định lượng protein thu được
• 2.2.2. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme acetylcholinesterase
• 2.2.3. Phương pháp tinh sạch enzyme acetylcholinesterase
• 2.2.4. Đánh giá độ sạch của chế phẩm thu được bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide có SDS (SDS-PAGE) của Laemmli (1970)
• 2.2.5. Phương pháp đông khô
• 2.2.6. Nghiên cứu một số tính chất của enzyme acetylcholinesterase
• 2.2.7. Phương pháp tách chiết mRNA tổng số
• 2.2.8. Phương pháp tổng hợp cDNA
• 2.2.9. Phương pháp PCR
• 2.2.10. Điện di trên gel agarose
• 2.2.11. Phương pháp nhân dòng vào vector pGEMT
• 2.2.12. Biến nạp vector chứa đoạn gen chèn vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5α
• 2.2.13. Phương pháp giải trình tự
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Khảo sát hoạt độ của acetylcholinesterase ở một số sinh vật
• 3.2. Tinh sạch enzyme acetylcholinesterase từ hồng cầu bò
• 3.2.1. Tinh sạch bằng sắc ký trao đổi ion DEAE-sepharose
• 3.2.2. Tinh sạch enzyme Acetylcholinesterase qua cột Sephadex TM G-75
• 3.2.3. Kiểm tra độ sạch của chế phẩm acetylcholinesterase từ hồng cầu bò bằng SDS – page
• 3.2.4. Đông khô chế phẩm enzyme acetylcholinesterase
• 3.2.5. Nghiên cứu một số tính chất enzyme acetylcholinesterase từ hồng cầu bò
• 3.2.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ của enzyme acetylcholinesterase
• 3.2.7. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của enzyme acetylcholinesterase
• 3.2.8. Nhân dòng và giải trình tự gen mã hóa AChE từ hồng cầu bò
• 3.2.8.1. Tách chiết RNA tổng số từ máu bò và tổng hợp cDNA
• 3.2.8.2. Nhân bản gen mã hóa AChE từ hồng cầu bò
• 3.2.8.3. Nhân dòng gen mã hóa AChE từ hồng cầu bò vào vector pGEM T
• 3.2.8.4. Giải trình tự của gen mã hóa AChE từ hồng cầu bò
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về enzyme acetylcholinesterase từ hồng cầu bò

Enzyme acetylcholinesterase (AChE) là một enzyme quan trọng trong hệ thần kinh động vật, có vai trò chính trong việc phân hủy acetylcholine, một chất dẫn truyền thần kinh. Nghiên cứu về enzyme này từ hồng cầu bò không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cấu trúc và chức năng của AChE mà còn mở ra hướng đi mới trong việc ứng dụng enzyme này trong y học và nông nghiệp.

1.1. Lịch sử phát hiện enzyme acetylcholinesterase

Enzyme AChE được phát hiện lần đầu vào năm 1914 bởi Dale, người đã chỉ ra rằng enzyme này có khả năng thủy phân acetylcholine trong máu. Nhiều nghiên cứu sau đó đã xác nhận sự hiện diện của AChE trong nhiều mô khác nhau của động vật, cho thấy vai trò quan trọng của nó trong việc điều hòa dẫn truyền thần kinh.

1.2. Vai trò của enzyme acetylcholinesterase trong cơ thể

AChE có vai trò quan trọng trong việc duy trì sự cân bằng của acetylcholine trong hệ thần kinh. Enzyme này giúp ngăn chặn sự tích tụ của acetylcholine, từ đó điều chỉnh hoạt động của các nơron và đảm bảo tín hiệu thần kinh được truyền đạt một cách hiệu quả.

II. Thách thức trong nghiên cứu enzyme acetylcholinesterase

Mặc dù enzyme AChE đã được nghiên cứu rộng rãi, nhưng vẫn còn nhiều thách thức trong việc tinh sạch và xác định tính chất của enzyme này từ hồng cầu bò. Các phương pháp hiện tại thường gặp khó khăn trong việc đạt được hiệu suất cao và độ tinh khiết cần thiết.

2.1. Vấn đề trong quy trình tinh sạch enzyme

Quy trình tinh sạch enzyme AChE từ hồng cầu bò thường gặp khó khăn do sự hiện diện của các protein khác trong mẫu. Điều này dẫn đến việc cần thiết phải phát triển các phương pháp tinh sạch hiệu quả hơn để đạt được độ tinh khiết cao cho enzyme.

2.2. Khó khăn trong việc xác định tính chất enzyme

Việc xác định các tính chất của AChE như hoạt tính, độ ổn định và cấu trúc phân tử cũng gặp nhiều thách thức. Các yếu tố như pH, nhiệt độ và sự hiện diện của các chất ức chế có thể ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme, làm cho việc nghiên cứu trở nên phức tạp.

III. Phương pháp tinh sạch enzyme acetylcholinesterase hiệu quả

Để tinh sạch enzyme AChE từ hồng cầu bò, nhiều phương pháp đã được áp dụng, bao gồm sắc ký trao đổi ion và sắc ký gel. Những phương pháp này giúp tách biệt enzyme khỏi các tạp chất khác, từ đó nâng cao độ tinh khiết và hoạt tính của enzyme.

3.1. Sắc ký trao đổi ion DEAE sepharose

Phương pháp sắc ký trao đổi ion DEAE-sepharose là một trong những kỹ thuật hiệu quả nhất để tinh sạch AChE. Kỹ thuật này dựa trên sự tương tác giữa enzyme và các nhóm ion trên cột sắc ký, giúp tách biệt enzyme khỏi các protein không mong muốn.

3.2. Sắc ký gel Sephadex G 75

Sắc ký gel Sephadex G-75 được sử dụng để loại bỏ các phân tử lớn hơn enzyme AChE, từ đó nâng cao độ tinh khiết của sản phẩm cuối cùng. Phương pháp này giúp đảm bảo rằng enzyme thu được có hoạt tính cao và ít tạp chất.

IV. Nghiên cứu tính chất enzyme acetylcholinesterase từ hồng cầu bò

Nghiên cứu tính chất của enzyme AChE từ hồng cầu bò cho thấy enzyme này có hoạt tính cao và ổn định trong một khoảng pH và nhiệt độ nhất định. Những thông tin này rất quan trọng cho việc ứng dụng enzyme trong các lĩnh vực khác nhau.

4.1. Ảnh hưởng của pH đến hoạt động của enzyme

Nghiên cứu cho thấy hoạt động của AChE thay đổi theo pH. Enzyme này có hoạt tính tối ưu trong khoảng pH 7.0-8.0, cho thấy rằng môi trường pH có ảnh hưởng lớn đến khả năng thủy phân acetylcholine của enzyme.

4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động của enzyme

Hoạt động của AChE cũng bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ. Nghiên cứu cho thấy enzyme này có thể duy trì hoạt tính tốt nhất ở nhiệt độ từ 25°C đến 37°C, trong khi nhiệt độ cao hơn có thể dẫn đến sự giảm hoạt tính của enzyme.

V. Ứng dụng thực tiễn của enzyme acetylcholinesterase

Enzyme AChE có nhiều ứng dụng trong y học và nông nghiệp. Việc phát hiện nhanh các chất độc hóa học và thuốc trừ sâu là một trong những ứng dụng quan trọng nhất của enzyme này.

5.1. Ứng dụng trong phát hiện chất độc hóa học

AChE được sử dụng như một công cụ để phát hiện nhanh các chất độc hóa học phospho hữu cơ. Việc xác định độ giảm hoạt độ của enzyme có thể giúp phát hiện sự hiện diện của các chất độc này trong môi trường.

5.2. Ứng dụng trong nông nghiệp

Enzyme AChE cũng được ứng dụng trong nông nghiệp để phát hiện các thuốc trừ sâu. Việc sử dụng enzyme này giúp đảm bảo an toàn cho thực phẩm và môi trường, đồng thời nâng cao hiệu quả trong sản xuất nông nghiệp.

VI. Kết luận và tương lai của nghiên cứu enzyme acetylcholinesterase

Nghiên cứu enzyme AChE từ hồng cầu bò đã mở ra nhiều hướng đi mới trong việc ứng dụng enzyme này trong y học và nông nghiệp. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho cộng đồng.

6.1. Tương lai của nghiên cứu enzyme AChE

Với sự phát triển của công nghệ sinh học, nghiên cứu về enzyme AChE sẽ tiếp tục được mở rộng. Các phương pháp mới trong tinh sạch và xác định tính chất enzyme sẽ giúp nâng cao hiệu quả và ứng dụng của enzyme này.

6.2. Giá trị ứng dụng của enzyme AChE trong đời sống

Enzyme AChE không chỉ có giá trị trong nghiên cứu mà còn có ứng dụng thực tiễn cao trong việc phát hiện chất độc và bảo vệ sức khỏe con người. Việc khai thác và ứng dụng enzyme này sẽ góp phần nâng cao chất lượng cuộc sống.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Enzyme acetylcholinesterase (AChE, EC 3.1.1.7) giữ vai trò sống còn trong việc dẫn truyền xung động thần kinh nhờ khả năng thủy phân chất dẫn truyền thần kinh acetylcholine với tốc độ lên đến 25.000 phân tử mỗi giây. Tại Việt Nam và nhiều quốc gia nông nghiệp, tình trạng lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật thuộc nhóm phospho hữu cơ và carbamate gây ra hàng ngàn vụ ngộ độc thực phẩm mỗi năm, đe dọa trực tiếp đến sức khỏe cộng đồng và an ninh môi trường. Do cấu trúc không gian của các hợp chất phospho hữu cơ có khả năng liên kết đặc hiệu và bất hoạt trung tâm hoạt động của AChE, việc ứng dụng enzyme này để sản xuất các bộ kit kiểm tra nhanh dư lượng độc chất là một hướng đi mang tính thực tiễn cao trong dân sự lẫn an ninh quốc phòng.

Nghiên cứu "Tinh sạch và nghiên cứu tính chất của enzyme acetylcholinesterase từ hồng cầu bò" của học viên Đào Thị Hương Giang (chuyên ngành Sinh học thực nghiệm, mã số 60420114, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội) tập trung giải quyết bài toán thiếu hụt nguồn nguyên liệu enzyme ổn định trong nước. Đề tài được tài trợ kinh phí theo Hợp đồng số 290/2014/HĐKHCN cấp Viện Khoa học và Công nghệ Quân sự. Mục tiêu cụ thể là khảo sát hàm lượng AChE trong máu một số loài động vật, thiết lập quy trình tinh sạch 2 bước tối ưu cho hồng cầu bò, đánh giá các đặc tính lý hóa (pH, nhiệt độ) và bước đầu dòng hóa gen mã hóa BoAChE.

Kết quả thu được tạo tiền đề cho việc tự chủ chế tạo các bộ thuốc thử phát hiện nhanh chất độc thần kinh và dư lượng thuốc trừ sâu với hoạt độ riêng đạt 124 U/mg protein, giúp giảm giá thành sản xuất so với các chế phẩm nhập ngoại từ 30% đến 50%.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng lý thuyết động học enzyme và cơ chế ức chế cạnh tranh bất thuận nghịch của các hợp chất phospho hữu cơ. Trong phân loại enzyme học, AChE thuộc phân lớp carboxyl ester hydrolase (EC 3.1.1.7) – thường được gọi là "cholinesterase thật", phân biệt với butyrylcholinesterase (BuChE, EC 3.1.1.8) là "cholinesterase giả". Cấu trúc bậc 4 của AChE mang trung tâm hoạt động gồm hai vùng chức năng cốt lõi: vùng anion tích điện âm (COO-) có chức năng định vị đầu cation của acetylcholine, và vùng esterase chứa bộ ba xúc tác Ser203 - Glu334 - His447 thực hiện phản ứng cắt liên kết ester.

Cơ chế xúc tác diễn ra qua trạng thái trung gian acetyl-enzyme trước khi giải phóng choline và acid acetic. Khi có mặt các chất độc phospho hữu cơ (như Sarin, Soman, Paraoxon), nguyên tử phospho liên kết cộng hóa trị bền vững với nhóm hydroxyl của gốc Ser203, làm biến tính vĩnh viễn trung tâm xúc tác. Mức độ suy giảm hoạt tính của enzyme tỷ lệ thuận với nồng độ chất ức chế, hình thành nguyên lý cốt lõi cho các cảm biến sinh học.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu và chọn mẫu: Nghiên cứu thực hiện thu thập mẫu máu tươi từ 4 loài sinh vật phổ biến (bò, lợn, ngan, gà) tại các cơ sở cung cấp thực phẩm tập trung ở Hà Nội. Phương pháp chọn mẫu chủ đích được áp dụng nhằm so sánh hoạt độ enzyme giữa động vật đẳng nhiệt và động vật biến nhiệt, từ đó lựa chọn nguồn sinh khối có hoạt tính AChE cao nhất và nguồn cung dồi dào nhất. Dung tích mẫu thử nghiệm được chuẩn hóa từ 50 ml đến 400 ml cho mỗi mẻ chiết xuất.

Phương pháp phân tích và tinh sạch:

• Định lượng protein: Kết hợp đo quang phổ hấp thụ tử ngoại ở bước sóng A280 nm (với tỷ số A260/A280 < 0,6) và phương pháp so màu Folin - Lowry ở bước sóng 750 nm bằng đường chuẩn Bovine Serum Albumin (BSA).
• Đo hoạt độ enzyme: Sử dụng phương pháp đo quang phổ với chất sinh màu 5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) (DTNB), chất chỉ thị Guinea green B ở bước sóng 620 nm và bộ kit tiêu chuẩn Biovision ở bước sóng 570 nm.
• Tinh sạch và kiểm tra độ sạch: Tách màng hồng cầu bằng lysozyme và ly tâm lạnh 12.000 vòng/phút ở 4°C. Dịch chiết thô được đưa qua sắc ký trao đổi ion DEAE-Sepharose (rửa giải gradient NaCl 20 - 1000 mM trong đệm phosphate 20 mM, pH 8,0) và sắc ký lọc gel Sephadex G-75 (cột kích thước 1 x 80 cm). Độ sạch được kiểm tra bằng điện di gel polyacrylamide có SDS (SDS-PAGE 12%) theo Laemmli (1970). Chế phẩm sau đó được đông khô ở nhiệt độ -40°C và áp suất 0,1 mbar trong 24 giờ.
• Sinh học phân tử: Tách chiết RNA tổng số bằng kit Qiagen, tổng hợp cDNA bằng M-MLV Reverse Transcriptase, thực hiện PCR 35 chu kỳ với cặp mồi đặc hiệu AChE Fw/Rv, nhân dòng vào vector pGEM-T, biến nạp vào Escherichia coli chủng DH5α và giải trình tự trên hệ thống tự động CEQ-8000 Beckman Coulter.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Khảo sát sàng lọc sinh học: Trong 4 nguồn máu khảo sát, hoạt độ AChE ở hồng cầu bò đạt giá trị cao nhất là 0,024 U/mg nguyên liệu tươi, vượt trội hơn đáng kể so với mẫu máu lợn, gà và ngan (đều đạt dưới 0,015 U/mg).

Hiệu quả tinh sạch qua hệ thống sắc ký 2 bước:

• Giai đoạn sắc ký trao đổi ion DEAE-Sepharose: Dịch thô ban đầu có tổng lượng protein 292 mg và hoạt độ tổng số 2686,4 U (hoạt độ riêng 9,2 U/mg). Sau khi qua cột DEAE-Sepharose, quá trình rửa giải ở nồng độ muối NaCl 160 - 210 mM đã loại bỏ thành công 96,4% lượng protein tạp. Thu được 10,5 mg protein với hoạt độ riêng đạt 64,6 U/mg, tương đương độ sạch tăng 7,02 lần và hiệu suất thu hồi đạt 25,2%.
• Giai đoạn sắc ký lọc gel Sephadex G-75: Phân đoạn thu nhận tiếp tục loại bỏ thêm 70,3% protein không mong muốn còn lại. Kết quả thu được 3,12 mg protein enzyme tinh sạch với tổng hoạt độ 387 U. Hoạt độ riêng đạt đỉnh ở mức 124 U/mg protein, nâng độ sạch tổng thể lên gấp 13,47 lần so với dịch chiết thô ban đầu, hiệu suất thu hồi cuối cùng đạt 14,4%.

Đặc tính lý hóa và cấu trúc phân tử:

• Khảo sát ảnh hưởng môi trường cho thấy AChE từ hồng cầu bò hoạt động tối ưu trong dải nhiệt độ 35°C - 40°C và giảm mạnh khi nhiệt độ vượt quá 55°C. Khoảng pH tối ưu của enzyme nằm trong vùng kiềm nhẹ từ 7,5 đến 8,0.
• Điện di SDS-PAGE cho thấy một băng protein đơn nhất, chứng minh độ đồng nhất cao của chế phẩm. Phân tích giải trình tự đoạn gen nhân dòng trong vector pGEM-T khẳng định độ tương đồng tuyệt đối với trình tự mã hóa AChE ở bò đã công bố trên GenBank (mã số NM_001076220.1), đồng thời bảo tồn nguyên vẹn các vị trí acid amin thuộc bộ ba xúc tác và túi liên kết cơ chất.

Thảo luận kết quả

Sự phân bố dữ liệu trong quá trình tinh sạch được thể hiện rõ nét qua các sắc ký đồ:

• Trên sắc ký đồ DEAE-Sepharose, hàm lượng protein biểu hiện qua 3 đỉnh phân đoạn kế tiếp nhau từ phân đoạn 40 đến 50, trong khi đỉnh hoạt độ AChE xuất hiện sớm và tách biệt hoàn toàn tại phân đoạn 22 đến 30. Hiện tượng này khẳng định lực liên kết tĩnh điện của AChE với giá thể DEAE yếu hơn phần lớn các protein huyết sắc tố khác ở pH 8,0, tạo điều kiện tách chiết chọn lọc dễ dàng.
• Trên sắc ký đồ lọc gel Sephadex G-75, đỉnh hoạt độ enzyme xuất hiện trùng khớp chính xác với đỉnh protein thứ nhất (phân đoạn 39 đến 42, tương ứng 8 ml thể tích rửa giải), phản ánh khối lượng phân tử lớn của phức hợp AChE tự nhiên so với các mảnh peptide tạp.

Khi đặt cạnh các công trình công bố trong nước, chế phẩm AChE từ hồng cầu bò trong nghiên cứu này đạt hoạt độ riêng 124 U/mg, cao gấp gần 68 lần so với chế phẩm AChE tinh sạch từ ốc bươu vàng (1,83 U/mg) và vượt trội so với AChE từ não thỏ (5 U/mg). Mặc dù hoạt độ riêng này thấp hơn BuChE tinh sạch từ huyết thanh ngựa (150 U/mg), nhưng AChE từ hồng cầu bò lại có ưu thế tuyệt đối về độ đặc hiệu đối với acetylcholine và độ nhạy cao với các chất ức chế nhóm phospho hữu cơ. Quy trình tinh sạch 2 bước đơn giản, không cần sử dụng các chất gắn ái lực đắt tiền (như edrophonium hay procainamide), hoàn toàn phù hợp với điều kiện trang thiết bị của các phòng thí nghiệm tại Việt Nam.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Chuẩn hóa quy trình công nghệ và mở rộng quy mô sản xuất (Scale-up):

   • Đơn vị thực hiện: Viện Công nghệ mới và Viện Khoa học - Công nghệ Quân sự.
   • Mục tiêu: Nâng quy mô chiết xuất từ 500 ml lên 5 - 10 lít máu bò mỗi mẻ trong vòng 12 đến 18 tháng tới.
   • Giải pháp: Tự động hóa hệ thống sắc ký FPLC và tối ưu hóa quy trình phá màng hồng cầu bằng áp lực cơ học kết hợp enzyme nhằm nâng hiệu suất thu hồi protein từ 14,4% lên trên 25%.

2. Nghiên cứu công nghệ cố định enzyme (Enzyme Immobilization):

   • Đơn vị thực hiện: Bộ môn Hóa sinh – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên kết hợp các viện nghiên cứu chuyên ngành.
   • Mục tiêu: Kéo dài thời gian bảo quản chế phẩm AChE dạng bột đông khô từ 6 tháng lên trên 18 tháng ở nhiệt độ phòng.
   • Giải pháp: Nghiên cứu gắn enzyme AChE lên các chất mang nano như hạt nano từ tính Fe3O4, màng chitosan hoặc ống nano carbon trong lộ trình 24 tháng.

3. Thương mại hóa bộ kít thử nhanh dư lượng thuốc bảo vệ thực vật:

   • Đơn vị thực hiện: Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn phối hợp với các doanh nghiệp sản xuất sinh phẩm y tế.
   • Mục tiêu: Đưa ra thị trường bộ test kit phát hiện nhanh phospho hữu cơ và carbamate với giới hạn phát hiện đạt dưới 0,01 ppm trong vòng 2 năm.
   • Giải pháp: Tích hợp chế phẩm AChE đông khô vào que thử sinh học định tính và bán định lượng phục vụ kiểm tra an toàn thực phẩm tại chợ đầu mối và vùng sản xuất nông sản.

4. Phát triển hệ thống biểu hiện tái tổ hợp quy mô lớn:

   • Đơn vị thực hiện: Các phòng thí nghiệm trọng điểm về Công nghệ Gen.
   • Mục tiêu: Chuyển gen mã hóa BoAChE từ vector pGEM-T sang các hệ thống biểu hiện hiệu năng cao như nấm men Pichia pastoris hoặc tế bào côn trùng Baculovirus trong vòng 36 tháng, giúp chủ động 100% nguồn enzyme mà không phụ thuộc vào nguồn máu lò mổ.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Giảng viên, nghiên cứu viên và học viên ngành Hóa sinh - Công nghệ sinh học:

   • Lợi ích: Tiếp cận quy trình thực nghiệm chi tiết về kỹ thuật sắc ký trao đổi ion, lọc gel, điện di SDS-PAGE và các phương pháp sinh học phân tử chuẩn mực (RT-PCR, nhân dòng gen).
   • Use case: Sử dụng làm tài liệu tham khảo cho các đề tài nghiên cứu tách chiết protein và thiết kế bài giảng thực hành chuyên ngành Sinh học thực nghiệm.

2. Chuyên gia R&D tại các doanh nghiệp sản xuất kit chẩn đoán và cảm biến sinh học:

   • Lợi ích: Nắm bắt các thông số kỹ thuật tối ưu (nhiệt độ 35°C - 40°C, pH 7,5 - 8,0, nồng độ đệm) để ổn định hoạt tính enzyme trong sản phẩm thương mại.
   • Use case: Phát triển que thử nhanh, cảm biến điện hóa phân tích dư lượng độc chất trong nông sản và mẫu nước môi trường.

3. Cán bộ nghiên cứu thuộc lực lượng an ninh hóa sinh và phòng hóa quân sự:

   • Lợi ích: Khai thác thông tin về cơ chế tương tác giữa AChE với các tác nhân thần kinh chiến tranh họ G (Sarin, Soman, Tabun) và họ V (VX).
   • Use case: Cải tiến và chế tạo các bộ trang bị trinh sát hóa học như kit KIT-B, KIT-BM thay thế hàng nhập khẩu.

4. Cán bộ quản lý an toàn thực phẩm và kiểm định môi trường:

   • Lợi ích: Hiểu rõ nguyên lý khoa học đằng sau các xét nghiệm enzyme ức chế để đánh giá độ chính xác và sai số của các phương pháp thử nghiệm nhanh tại hiện trường.
   • Use case: Xây dựng quy trình chuẩn (SOP) trong thanh tra, giám sát dư lượng thuốc bảo vệ thực vật tại cơ sở sản xuất.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao hồng cầu bò lại được chọn làm nguyên liệu chiết xuất AChE thay vì các mô khác?

Máu bò là phế phẩm dồi dào, giá thành thấp tại các lò mổ tập trung. Kết quả khảo sát thực nghiệm chứng minh hoạt độ AChE trong hồng cầu bò đạt 0,024 U/mg nguyên liệu tươi, cao hơn nhiều so với lợn hay gia cầm, đồng thời dạng enzyme liên kết màng hồng cầu có độ bền cấu trúc cao hơn AChE dạng tự do trong huyết thanh.

2. Cơ chế nào giúp enzyme AChE phát hiện được thuốc trừ sâu phospho hữu cơ?

Thuốc trừ sâu phospho hữu cơ có cấu hình không gian tương đồng cơ chất acetylcholine. Chúng tấn công nhóm -OH của gốc Ser203 tại trung tâm hoạt động của AChE, tạo liên kết phosphoryl hóa bền vững khiến enzyme mất khả năng xúc tác. Tỷ lệ phần trăm hoạt độ enzyme bị suy giảm phản ánh trực tiếp nồng độ chất độc có trong mẫu thử.

3. Vì sao nghiên cứu sử dụng kết hợp cả sắc ký trao đổi ion DEAE và lọc gel Sephadex G-75?

Sắc ký DEAE-Sepharose đóng vai trò phân tách sơ bộ dựa trên điện tích bề mặt, giúp loại bỏ nhanh 96,4% protein tạp và tăng độ sạch lên 7,02 lần. Tiếp đó, cột Sephadex G-75 thực hiện tinh sạch sâu dựa trên kích thước phân tử, loại bỏ tiếp 70,3% tạp chất còn lại để thu được chế phẩm enzyme đồng nhất có hoạt độ riêng 124 U/mg.

4. Việc đông khô chế phẩm enzyme ở điều kiện -40°C và 0,1 mbar mang lại lợi ích gì?

Đông khô ở nhiệt độ sâu -40°C và áp suất chân không 0,1 mbar trong 24 giờ giúp loại bỏ hoàn toàn phân tử nước mà không làm đứt gãy liên kết peptide hay biến tính cấu trúc bậc 4 của protein. Sản phẩm dạng bột xốp bảo toàn được hoạt tính xúc tác và thuận tiện cho việc lưu trữ, đóng gói thành kit thử.

5. Khoảng nhiệt độ 35°C - 40°C và pH 7,5 - 8,0 tối ưu có ý nghĩa thế nào khi ứng dụng thực tế?

Khoảng tối ưu này hoàn toàn tương thích với điều kiện sinh lý tự nhiên và môi trường khí hậu nhiệt đới tại Việt Nam. Khi thiết kế que thử nhanh hoặc bộ kit hiện trường, người sử dụng chỉ cần duy trì dung dịch đệm phosphate trung tính nhẹ mà không cần trang bị các thiết bị ổn nhiệt hay điều chỉnh pH phức tạp.

Kết luận

• Luận văn đã xây dựng thành công quy trình 2 bước chiết xuất và tinh sạch enzyme acetylcholinesterase từ nguồn hồng cầu bò sẵn có tại Việt Nam.
• Chế phẩm AChE tinh sạch thu được có hoạt độ riêng đạt 124 U/mg protein, độ sạch tăng 13,47 lần và hiệu suất thu hồi đạt 14,4%.
• Đã xác định chính xác các điều kiện hoạt động tối ưu của enzyme tại dải nhiệt độ 35°C - 40°C và môi trường pH kiềm nhẹ 7,5 - 8,0.
• Nhân dòng và giải trình tự thành công đoạn gen mã hóa BoAChE vào vector pGEM-T, mở ra tiềm năng sản xuất enzyme tái tổ hợp quy mô công nghiệp.
• Kết quả nghiên cứu tạo nền tảng vững chắc để phát triển các bộ sinh phẩm, que thử nhanh phục vụ công tác an toàn vệ sinh thực phẩm và an ninh phòng hóa.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Enzyme acetylcholinesterase (EC 3.7) là một enzyme đóng vai trò quan trọng trong truyền tín hiệu thần kinh của hệ thần kinh động vật. Trung tâm hoạt động của AChE có các nhóm chức và cấu trúc không gian phù hợp với các hợp chất phospho hữu cơ nên các chất này dễ dàng kết hợp với AChE với vai trò là chất ức chế cạnh tranh. Khi đó enzyme sẽ bị ức chế do sự tạo thành phức chất trung gian giữa enzyme – chất ức chế khá bền, vì vậy enzyme sẽ bị mất hoạt tính rất nhanh. Dựa trên tính chất của chất ức chế, thông qua việc xác định độ giảm hoạt độ AChE có thể nghiên cứu sử dụng AChE làm phƣơng tiện phân tích, phát hiện nhanh các chất độc hóa học phospho hữu cơ [48, 68].

Trong đời sống, AChE đƣợc ứng dụng để sản xuất ra các phƣơng tiện phát hiện nhanh thuốc trừ sâu bảo vệ thực vật họ phospho hữu cơ tồn dƣ trong môi trƣờng, nông sản, rau quả. Ngoài những ứng dụng trong đời sống sinh hoạt thì việc nghiên cứu khai thác và ứng dụng AChE để chẩn đoán phát hiện phospho hữu cơ cũng đƣợc ứng dụng rộng rãi vào mục đích an ninh quốc phòng [68]. Ở Việt Nam cũng đã có một số công trình nghiên cứu về tính chất của AChE cũng nhƣ các nghiên cứu xây dựng quy trình tinh sạch enzyme này. Tuy nhiên, việc tách chiết AChE bằng các quy trình khác nhau đều có những hạn chế nhất định về hiệu suất, hoạt độ, kinh phí và đặc biệt là các điều kiện tiến hành thực nghiệm trong phòng thí nghiệm còn gặp nhiều khó khăn trong việc tinh sạch.

Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Tinh sạch và nghiên cứu tính chất enzyme acetylcholinesterase từ hồng cầu bò” nhằm xây dựng một quy trình tinh sạch AChE hiệu quả từ nguồn nguyên liệu rẻ tiền và phổ biến. Khóa 2013 – 2015 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Lịch sử phát hiện và vai trò của enzyme acetylcholinesterase Vào năm 1914, Dale phát hiện trong máu có loại enzyme làm xúc tác cho sự thủy phân acetylcholine (ACh) – một chất dẫn truyền xung thần kinh trong các mô thần kinh [24].

Sau đó nhiều nghiên cứu chứng tỏ sự phổ biến rộng rãi của enzyme này trong các mô khác nhau của động vật và đƣợc gọi là cholinesterase (ChE). Nhóm enzyme này bao gồm acetylcholinesterase (AChE) và butyrylcholinesterase (BuChE) có khả năng thủy phân các cơ chất acetylcholine và butyrylcholine để cùng tạo ra choline [68]. Chức năng chính của ChE là thủy phân nhanh ACh tiết ra, dẫn truyền xung thần kinh. Qua nghiên cứu ngƣời ta phát hiện ra rằng sự thủy phân ACh nhờ enzyme còn đƣợc thực hiện ở các cơ quan khác nhƣ trong mô của cơ, trong gan, trong tuyến tụy [68]…Ý nghĩa sinh lý của ChE trong các mô này đến nay vẫn chƣa xác định đƣợc một cách rõ ràng.

Một số tác giả cho rằng ChE của hồng cầu đóng vai trò quan trọng trong sự thấm của màng tế bào. Có tác giả lại cho rằng ChE của máu và các mô khác đóng vai trò nhƣ một loại enzyme “thay thế” trong trƣờng hợp ACh tiết ra đáng kể vào máu thì kích thích lại hệ thống thần kinh [48]. AChE giữ vai trò quan trọng đặc biệt trong hoạt động thần kinh, đó là thủy phân ACh - vật liệu truyền tín hiệu thần kinh của hệ thần kinh ngoại biên và hệ thần kinh trung ƣơng ở nhiều cơ thể trong đó có cơ thể ngƣời. ACh đƣợc tổng hợp chủ yếu trong các nơron từ choline và acetyl - CoA do enzyme choline acetyltransferase xúc tác cho quá trình này.

Khóa 2013 – 2015 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.