MỞ ĐẦU Enzyme acetylcholinesterase (EC 3.7) là một enzyme đóng vai trò quan trọng trong truyền tín hiệu thần kinh của hệ thần kinh động vật. Trung tâm hoạt động của AChE có các nhóm chức và cấu trúc không gian phù hợp với các hợp chất phospho hữu cơ nên các chất này dễ dàng kết hợp với AChE với vai trò là chất ức chế cạnh tranh. Khi đó enzyme sẽ bị ức chế do sự tạo thành phức chất trung gian giữa enzyme – chất ức chế khá bền, vì vậy enzyme sẽ bị mất hoạt tính rất nhanh. Dựa trên tính chất của chất ức chế, thông qua việc xác định độ giảm hoạt độ AChE có thể nghiên cứu sử dụng AChE làm phƣơng tiện phân tích, phát hiện nhanh các chất độc hóa học phospho hữu cơ [48, 68].
Trong đời sống, AChE đƣợc ứng dụng để sản xuất ra các phƣơng tiện phát hiện nhanh thuốc trừ sâu bảo vệ thực vật họ phospho hữu cơ tồn dƣ trong môi trƣờng, nông sản, rau quả. Ngoài những ứng dụng trong đời sống sinh hoạt thì việc nghiên cứu khai thác và ứng dụng AChE để chẩn đoán phát hiện phospho hữu cơ cũng đƣợc ứng dụng rộng rãi vào mục đích an ninh quốc phòng [68]. Ở Việt Nam cũng đã có một số công trình nghiên cứu về tính chất của AChE cũng nhƣ các nghiên cứu xây dựng quy trình tinh sạch enzyme này. Tuy nhiên, việc tách chiết AChE bằng các quy trình khác nhau đều có những hạn chế nhất định về hiệu suất, hoạt độ, kinh phí và đặc biệt là các điều kiện tiến hành thực nghiệm trong phòng thí nghiệm còn gặp nhiều khó khăn trong việc tinh sạch.
Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Tinh sạch và nghiên cứu tính chất enzyme acetylcholinesterase từ hồng cầu bò” nhằm xây dựng một quy trình tinh sạch AChE hiệu quả từ nguồn nguyên liệu rẻ tiền và phổ biến. Khóa 2013 – 2015 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Lịch sử phát hiện và vai trò của enzyme acetylcholinesterase Vào năm 1914, Dale phát hiện trong máu có loại enzyme làm xúc tác cho sự thủy phân acetylcholine (ACh) – một chất dẫn truyền xung thần kinh trong các mô thần kinh [24].
Sau đó nhiều nghiên cứu chứng tỏ sự phổ biến rộng rãi của enzyme này trong các mô khác nhau của động vật và đƣợc gọi là cholinesterase (ChE). Nhóm enzyme này bao gồm acetylcholinesterase (AChE) và butyrylcholinesterase (BuChE) có khả năng thủy phân các cơ chất acetylcholine và butyrylcholine để cùng tạo ra choline [68]. Chức năng chính của ChE là thủy phân nhanh ACh tiết ra, dẫn truyền xung thần kinh. Qua nghiên cứu ngƣời ta phát hiện ra rằng sự thủy phân ACh nhờ enzyme còn đƣợc thực hiện ở các cơ quan khác nhƣ trong mô của cơ, trong gan, trong tuyến tụy [68]…Ý nghĩa sinh lý của ChE trong các mô này đến nay vẫn chƣa xác định đƣợc một cách rõ ràng.
Một số tác giả cho rằng ChE của hồng cầu đóng vai trò quan trọng trong sự thấm của màng tế bào. Có tác giả lại cho rằng ChE của máu và các mô khác đóng vai trò nhƣ một loại enzyme “thay thế” trong trƣờng hợp ACh tiết ra đáng kể vào máu thì kích thích lại hệ thống thần kinh [48]. AChE giữ vai trò quan trọng đặc biệt trong hoạt động thần kinh, đó là thủy phân ACh - vật liệu truyền tín hiệu thần kinh của hệ thần kinh ngoại biên và hệ thần kinh trung ƣơng ở nhiều cơ thể trong đó có cơ thể ngƣời. ACh đƣợc tổng hợp chủ yếu trong các nơron từ choline và acetyl - CoA do enzyme choline acetyltransferase xúc tác cho quá trình này.
Khóa 2013 – 2015 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang Hình 1. Khớp thần kinh – cấu trúc truyền xung thần kinh [67] ACh làm nhiệm vụ dẫn truyền xung thần kinh từ màng trƣớc synap của tế bào truyền xung (nơron truyền) vào màng sau synap của một tế bào ở trạng thái tĩnh (nơron nhận xung) (Hình 1. ACh nằm trong các túi ở axon, chờ khi nhận đƣợc các xung thần kinh thì chuyển vào vùng đệm của khớp để truyền cho bộ phận nhận nằm ngay trên mặt của dendrite làm nhiệm vụ gửi những thông điệp chuyển mệnh lệnh hoạt động cho các cơ bắp. Tác dụng truyền đạt của ACh chỉ phát huy hiệu lực trong thời gian ngắn, khoảng 10-3s, bởi màng tế bào phải nhanh chóng hồi phục để tiếp nhận xung mới.
Khi ACh hoàn thành, enzyme AChE đã nằm sẵn trong vùng đệm của khớp chịu trách nhiệm làm mất tác dụng của ACh và nhanh chóng tách chúng ra khỏi hệ thống thần kinh bằng cách phá vỡ để giải phóng choline và acetate [66]. AChE Acetylcholine Choline + Acetate + Nếu AChE bị ức chế, thì vật liệu truyền tín hiệu thần kinh ACh không bị phá vỡ, khi đó ACh không bị phá vỡ thì chúng liên tục truyền tín hiệu làm cho cơ bắp không thể nghỉ, co thắt liên tục dẫn đến liệt và các vấn đề sinh lý bất lợi khác. Ngƣợc lại, nếu AChE có hoạt tính quá mạnh thì luôn luôn phá vỡ các acetylcholine trƣớc khi hoàn thành nhiệm vụ. Do đó, các tín hiệu thần kinh không kịp truyền đi từ Khóa 2013 – 2015 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang axon làm cho dendrite não bộ không nhận đƣợc tín hiệu và không ghi nhận đƣợc thông tin, gây nên bệnh lãng quên „Alzeimer hay mất trí nhớ‟ [58, 69, 74, 79].
Phân loại enzyme acetylcholinesterase Trong hệ thống phân loại, AChE đƣợc xếp vào nhóm các enzyme xúc tác phản ứng thủy phân este carboxyl (EC 3.1 Carboxyl este hydrolases) thuộc lớp enzyme thủy phân Hydrolase. AChE có ký hiệu phân loại là EC 3. Phản ứng đặc hiệu của AChE là thủy phân ACh tạo thành choline và acetate với tốc độ 25.000 phân tử acetylcholine trong 1 giây Acetylcholine + H2O choline + acetate Enzyme này có tên phân loại là acetylcholine acetylhydrolase và còn có các tên gọi khác nhau nhƣ: Choline esterase I, cholinesterase, acetylthiocholinesterase, acetylcholine hydrolase. Trong nghiên cứu ChE của các mô khác nhau, ngƣời ta phát hiện thấy còn một enzyme nữa, có thể thủy phân cơ chất khác acetylcholine (thủy phân acylcholine) nhƣng cũng cho sản phẩm là choline.
Để phân biệt, ngƣời ta gọi enzyme thủy phân acetylcholine là “Cholinesterase thật”. Enzyme thứ 2 thủy phân acylcholine đƣợc gọi là „Cholinesterase giả‟ [72] với phản ứng đặc hiệu : Acylcholine + H2O choline + carboxylate „Cholinesterase giả‟ thƣờng đƣợc gọi là Butyrylcholinesterase (BuChE) với ký hiệu EC 3. Ngoài tên phân loại là acetylcholine acylhydrolase, enzyme này còn có các tên khác nhƣ : anticholinesterase, benzoycholinesterase, non-specific cholinesterase, propionylcholinesterase. „Cholinesterase thật‟ có trong hồng cầu và mô não, thủy phân acetylcholin và acetyl-β-metylcholin một cách dễ dàng nhƣng không thủy phân đƣợc benzoycholine.
Trong khi đó „cholinesterase giả‟ tìm thấy trong gan, ruột, tim và máu có hoạt tính rất thấp hoặc không có hoạt tính đối với acetyl-β-metylcholin nhƣng thủy phân benzoycholin và acetylcholin một cách rất dễ dàng. Khóa 2013 – 2015 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang AChE – „Cholinesterase thật‟ và BuChE –„cholinesterase giả‟ liên quan chặt chẽ đến độc tính của thuốc trừ sâu phospho hữu cơ do các hợp chất phospho hữu cơ có cấu trúc không gian phù hợp với cấu trúc trung tâm hoạt động của AChE. Đây là một trong các điều kiện để chúng cạnh tranh với cơ chất và kết hợp với trung tâm hoạt động của enzyme, do đó làm mất hoạt tính của enzyme. Dựa vào tính chất này, các nhà khoa học đã nghiên cứu, sản xuất ra nhiều hợp chất phospho hữu cơ dùng làm chất độc thần kinh sử dụng trong chiến tranh, làm thuốc trừ sâu BVTV.
Phân bố và chức năng của enzyme acetylcholinesterase ChE có mặt rộng rãi ở hầu hết các loài động vật [27]. Sự hiện diện của chúng phổ biến ở các loài côn trùng và các loài động vật không xƣơng sống khác có các tác nhân kháng ChE. Sự tƣơng đồng trong cấu trúc phân tử của ChE ở các loài động vật không xƣơng sống đã đƣợc nghiên cứu ở nhiều loài động vật nhƣ giun tròn [23], mực [75] và lƣỡng cƣ [61]. AChE điều hòa ức chế sự dẫn truyền xung thần kinh.
Chúng đƣợc tìm thấy ở các khớp thần kinh, cơ thần kinh, cầu nối cơ-gân, trong dịch não tủy và hệ thống thần kinh trung ƣơng (CNS) tổ chức tế bào thần kinh, sợi trục thần kinh, cơ vân và cơ trơn [68]. Ngoài ra, đã có nghiên cứu phát hiện thấy AChE có trong nƣớc bọt [37]. AChE cũng có mặt trong hồng cầu của động vật có vú, tiểu cầu, tế bào lympho tuy nhiên hoạt tính rất thấp [39, 60, 82]. Hoạt tính của AChE trong máu của ngƣời bị hạn chế bởi những yếu tố hình thành nó, phần lớn là các tế bào hồng cầu [80].
AChE huyết tƣơng của các loài có xƣơng sống khác và một số loài động vật có vú cũng đƣợc tìm thấy, tuy nhiên rất khó xác định đƣợc hoạt tính [13-15]. Ví dụ AChE đƣợc tìm thấy trong huyết tƣơng của các loài động vật gặm nhấm nhƣ chuột nhƣng hoạt tính thấp hơn nhiều so với BuChE [77]. Hoạt tính AChE cũng đƣợc tìm thấy trong huyết thanh của phôi động vật có vú và các loài chim. Hoạt tính này giảm xuống ở động vật trƣởng thành sau khi sinh.
Hoạt tính AChE trong huyết thanh của thai bê đƣợc xác định là cao, đủ để Khóa 2013 – 2015 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang dùng làm nguồn tinh sạch enzyme [26]. Ngƣợc lại, trong máu bò trƣởng thành có lƣợng AChE hồng cầu tƣơng đối cao và rất thấp trong huyết tƣơng [82]. Ở các loài khác có nhiều loại ChE khác nhau, đầu tiên đƣợc phát hiện bởi các cơ chất và chất ức chế đặc hiệu và gần đây là dựa trên sự phân tích DNA [18]. Chức năng sinh lý của ChE hồng cầu và huyết thanh vẫn chƣa đƣợc nghiên cứu kỹ.
Có khả năng là các ChE trong máu đã phát triển để bảo vệ cơ thể khỏi những tác nhân kháng ChE tự nhiên. Một số độc tố thực vật có thể ức chế hoạt động của ChE bao gồm những glycoalkaloids họ cà, các steroid có mặt tự nhiên trong khoai tây và một số thực vật khác [46] và territrems của nấm [21]. Một số chất kháng ChE khác có trong tự nhiên nhƣ fasciculin từ nọc độc của rắn [50], chaconine và solancine từ các loại củ, cây cà dƣợc [57], và huperzine từ rêu [59]. Việc nghiên cứu ảnh hƣởng của các chất kháng ChE đến hoạt động của enzyme giúp xác định vai trò của ACh và AChE trong hệ thống thần kinh.