Nghiên cứu phát hiện và định lượng đột biến hội chứng động kinh giật cơ MERRF ở người Việt Nam

• Tác giả: Bùi Thị Khánh
• Người hướng dẫn: GS. Phan Tuấn Nghĩa
• Trường học: Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên cứu phát hiện và định lượng một số đột biến của hội chứng động kinh, giật cơ với sợi cơ không đều - MERRF ở người Việt Nam
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hà Nội

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. CẤU TRÚC VÀ CHỨC NĂNG CỦA TY THỂ NGƯỜI
• 1.1.1. Cấu trúc của ty thể
• 1.1.2. Cấu tạo màng ty thể
• 1.1.3. Chức năng của ty thể
• 1.1.3.1. Ty thể hoạt động như một nhà máy năng lượng của tế bào
• 1.2. ĐỘT BIẾN GEN TY THỂ VÀ CÁC BỆNH LIÊN QUAN
• 1.2.1. Các loại đột biến gen ty thể
• 1.2.2. Đột biến điểm
• 1.2.3. Đột biến cấu trúc mtDNA
• 1.2.4. Các bệnh do đột biến gen ty thể
• 1.2.5. Hội chứng gây ra bởi các đột biến điểm phổ biến trên gen mã hóa tRNA
• 1.2.6. Các hội chứng liên quan đến các đột biến điểm phổ biến trên gen mã hóa protein
• 1.2.7. Các bệnh liên quan đến các đột biến trên gen mã hóa rRNA
• 1.2.8. Bệnh gây nên bởi các đột biến khác trên mtDNA
• 1.3. HỘI CHỨNG ĐỘNG KINH, GIẬT CƠ VỚI SỢI CƠ KHÔNG ĐỀU (MERRF)
• 1.3.1. Các đột biến của hội chứng MERRF
• 1.3.2. Những tác động của hội chứng MERRF trên người bệnh
• 1.3.3. Các phương pháp phát hiện đột biến MERRF
• 1.3.3.1. Phát hiện đột biến thuộc hội chứng MERRF bằng PCR kết hợp với RFLP
• 1.3.3.2. Phân tích đột biến thuộc hội chứng MERRF bằng xác định trình tự gen
• 1.3.3.3. Kỹ thuật đa dạng cấu hình sợi đơn SSCP (single-stranded conformational polymorphism)
• 1.3.3.4. Định lượng đột biến gen ty thể bằng phương pháp real-time PCR
• 1.3.3.5. Phát hiện đột biến DNA ty thể bằng hệ thống cảm biến sinh học
• 2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Mẫu bệnh phẩm
• 2.2. Các hóa chất, nguyên liệu khác
• 2.3. Máy móc và trang thiết bị
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4.1. Tách chiết DNA tổng số
• 2.4.2. Kiểm tra và định lượng DNA tách chiết
• 2.4.3. Nhân bản đoạn gen ty thể bằng kỹ thuật PCR
• 2.4.4. Kỹ thuật PCR kết hợp với kỹ thuật đa hình chiều dài các đoạn phân cắt giới hạn (PCR-RFLP)
• 2.4.5. Điện di trên gel agarose
• 2.4.6. Điện di trên gel polyacrylamide
• 2.4.7. Kỹ thuật real-time PCR sử dụng mẫu dò huỳnh quang dạng khóa cầu axit nucleic (LNA-locked nucleic acid)
• 2.4.8. Giải trình tự đoạn gen chứa đột biến
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Thu thập mẫu mẫu bệnh nhân và tách chiết DNA tổng số
• 3.1.1. Một số đặc điểm của mẫu phân tích
• 3.1.2. Tách chiết DNA tổng số của các mẫu
• 3.2. Sàng lọc các đột biến gen thuộc hội chứng MERRF ở người Việt Nam bằng phương pháp PCR-RFLP
• 3.2.1. Sàng lọc đột biến 8344G
• 3.2.2. Nhân bản đoạn gen từ 8155 - 8366 bằng PCR
• 3.2.3. Phân tích sự có mặt của đột biến A8344G bằng PCR-RFLP
• 3.2.4. Sàng lọc đột biến T8356C
• 3.2.5. Nhân bản đoạn gen từ 8166 - 8358 bằng PCR
• 3.2.6. Phân tích sự có mặt của đột biến T8356C bằng PCR-RFLP
• 3.2.7. Sàng lọc đột biến G8363
• 3.2.8. Nhân bản đoạn gen từ 8342 - 8582
• 3.2.9. Phân tích sự có mặt của đột biến G8363A bằng PCR-RFLP
• 3.3. Xây dựng đường chuẩn để định lượng đột biến 8344G bằng kỹ thuật real-time PCR
• 3.3.1. Thiết kế mẫu dò huỳnh quang Taqman LNA
• 3.3.2. Đánh giá tính đặc hiệu của mẫu dò đột biến A8344G
• 3.3.3. Xây dựng đường chuẩn và đánh giá độ tin cậy của phương pháp real-time PCR để định lượng đột biến 8344G
• 3.3.4. Định lượng số bản sao của plasmid mang đoạn gen đột biến và không đột biến A8344G
• 3.3.5. Kết quả xây dựng đường chuẩn đột biến A8344G. Thử nghiệm khả năng phát hiện và định lượng đột biến 8344G
• 3.4. Sàng lọc đột biến gen thuộc hội chứng MERRF bằng phương pháp giải trình tự trực tiếp
• 3.4.1. Phân tích trình tự vùng gen mang đột biến MERRF 8155-9292 trên hệ gen ty thể
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Tổng quan về nghiên cứu đột biến hội chứng MERRF ở người Việt Nam

Hội chứng MERRF (Myoclonic Epilepsy with Ragged-Red Fibers) là một bệnh di truyền hiếm gặp, gây ra bởi các đột biến trong DNA ty thể. Nghiên cứu này nhằm mục đích phát hiện và định lượng các đột biến liên quan đến hội chứng MERRF ở người Việt Nam. Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu trên thế giới, nhưng tại Việt Nam, việc nghiên cứu về hội chứng này vẫn còn hạn chế. Điều này dẫn đến việc nhiều bệnh nhân chưa được chẩn đoán và điều trị kịp thời.

1.1. Định nghĩa và triệu chứng của hội chứng MERRF

Hội chứng MERRF được đặc trưng bởi các triệu chứng như động kinh, giật cơ, và sự xuất hiện của các sợi cơ không đều. Triệu chứng thường khởi phát ở trẻ em và có thể dẫn đến các vấn đề nghiêm trọng như suy nhược và mất trí nhớ.

1.2. Tầm quan trọng của nghiên cứu đột biến MERRF

Nghiên cứu về đột biến MERRF không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế bệnh lý mà còn hỗ trợ trong việc chẩn đoán và điều trị cho bệnh nhân. Việc phát hiện sớm các đột biến có thể cải thiện chất lượng cuộc sống cho người bệnh.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu hội chứng MERRF

Mặc dù có nhiều nghiên cứu về hội chứng MERRF, nhưng việc chẩn đoán và điều trị vẫn gặp nhiều khó khăn. Các triệu chứng của bệnh thường không rõ ràng và dễ nhầm lẫn với các bệnh lý khác. Hơn nữa, việc thiếu các phương pháp chẩn đoán chính xác cũng là một thách thức lớn.

2.1. Khó khăn trong việc chẩn đoán hội chứng MERRF

Chẩn đoán hội chứng MERRF thường dựa vào các triệu chứng lâm sàng, nhưng do tính phức tạp của bệnh, nhiều bệnh nhân không được phát hiện kịp thời. Việc thiếu các xét nghiệm di truyền cũng làm tăng độ khó trong chẩn đoán.

2.2. Thiếu hụt thông tin về đột biến MERRF ở người Việt Nam

Tại Việt Nam, thông tin về các đột biến MERRF còn rất hạn chế. Điều này dẫn đến việc nhiều bệnh nhân không được tiếp cận với các phương pháp điều trị hiện đại và hiệu quả.

III. Phương pháp nghiên cứu đột biến hội chứng MERRF hiệu quả

Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp hiện đại để phát hiện và định lượng các đột biến trong DNA ty thể. Các phương pháp như PCR, RFLP và real-time PCR được áp dụng để đảm bảo độ chính xác và tin cậy trong kết quả.

3.1. Phương pháp PCR trong phát hiện đột biến MERRF

Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) cho phép nhân bản các đoạn DNA mang đột biến, từ đó giúp phát hiện sự hiện diện của các đột biến trong mẫu bệnh phẩm.

3.2. Kỹ thuật RFLP trong phân tích đột biến

Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) được sử dụng để phân tích các đoạn DNA đã được nhân bản, giúp xác định các đột biến cụ thể trong gen ty thể.

3.3. Định lượng đột biến bằng real time PCR

Phương pháp real-time PCR cho phép định lượng chính xác số lượng bản sao của các đoạn DNA mang đột biến, từ đó cung cấp thông tin quan trọng về mức độ nghiêm trọng của bệnh.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy có sự hiện diện của nhiều đột biến trong hội chứng MERRF ở người Việt Nam. Những phát hiện này không chỉ giúp nâng cao hiểu biết về bệnh mà còn mở ra hướng đi mới trong việc chẩn đoán và điều trị.

4.1. Phát hiện các đột biến phổ biến trong MERRF

Nghiên cứu đã phát hiện một số đột biến phổ biến trong gen MT-TK, góp phần làm rõ hơn về cơ chế bệnh lý của hội chứng MERRF ở người Việt Nam.

4.2. Ứng dụng kết quả nghiên cứu vào thực tiễn

Kết quả nghiên cứu có thể được ứng dụng trong việc phát triển các phương pháp chẩn đoán và điều trị hiệu quả hơn cho bệnh nhân MERRF, từ đó cải thiện chất lượng cuộc sống cho họ.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu MERRF

Nghiên cứu về hội chứng MERRF ở người Việt Nam mở ra nhiều cơ hội mới trong việc hiểu biết và điều trị bệnh. Cần tiếp tục nghiên cứu để phát hiện thêm nhiều đột biến và cải thiện các phương pháp chẩn đoán.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu tiếp theo

Nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc phát hiện thêm các đột biến mới và hiểu rõ hơn về cơ chế bệnh lý của hội chứng MERRF.

5.2. Hướng đi mới trong điều trị hội chứng MERRF

Cần phát triển các phương pháp điều trị mới dựa trên các phát hiện từ nghiên cứu, nhằm nâng cao hiệu quả điều trị cho bệnh nhân MERRF.