ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh tim mạch (Cardiovascular Disease, CVD) là bệnh có đến hơn 18,5 triệu ca tử vong mỗi năm, là một trong những bệnh có số người mắc phải và tử vong cao nhất trên thế giới (WHO, 2019; Global Burdern of Disease (GBD), 2019). Ở Việt Nam, ước lượng có đến 240.161 ca tử vong do mắc bệnh tim mạch với số ca tử vong do đột quỵ là cao nhất là 135.999, chiếm 56,6% số ca tử vong do bệnh tim mạch (GBD, 2019). Bệnh cao lipid trong máu là bệnh được xác định bởi nồng độ lipid trong máu bất thường, chủ yếu là các chỉ số cholesterol tổng, triglyceride, làm thay đổi các mức độ cholesterol tổng, LDL-C, triglyceride và mức độ lipoprotein tỷ trọng thấp (High Density Lipoprotein, HDL), vì vậy bệnh cao lipid trong máu là một trong những nguy cơ chính gây ra các bệnh tim mạch trên toàn thế giới (Bezerra et al., 2023; Pirillo et al. Một số báo cáo cho rằng gene ANGPTL3 có liên quan đến bệnh cao lipid máu, bởi gene này ức chế hoạt động của Lipase lipoprotein và Endothelial lipase làm giảm nồng độ LDL trong cơ thể.
Gene Angiopioetin-like 3 (ANGPTL3) dài 8794 bp, với 6 intron và 7 exon, gene nằm ở vị trí nhiễm sắc thể số 1p31.3 (Jiang et al., 2019; Mohamed et al., 2022; Tikka et al., 2016; Luo et al. Gene ANGPTL3 mã hóa cho protein ANGPTL3 tham gia vào quá trình ức chế LPL, làm tăng các mức độ LDL, triglyveride và VLDL. Trên thế giới có nhiều nghiên cứu nhằm xác định tính chất đột biến trên gene ANGPTL3. Nghiên cứu của Stizel và các cộng sự (2017), đã thực hiện phân tích các đột biến mất chức năng của gene ANGPTL3, các đột biến mất chức năng trong nghiên cứu bao gồm các đột biến vô nghĩa, đột biến dịch khung, và đột biến điểm được xác định trong 21.980 người mắc CAD và 158.
Kết quả cho thấy những người mang biến thể dị hợp của gene ANGPTL3 cho thấy giảm 17% mức độ triglyceride và 12% mức độ LDL-C trong cơ thể. Do đó việc xác định một số yếu tố nguy cơ liên quan đến bệnh cao lipid trong máu trên bệnh nhân Việt Nam, cụ thể là xem xét các đột biến điểm trên gene SVTH: Hồ Bảo An 1 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ANGPTL3 mang lại ý nghĩa khoa học,thiết thực đối với việc tiên lượng, chẩn đoán và điều trị bệnh cao lipid trong máu. Do đó, nhằm nắm bắt tình hình, chúng tôi thực hiện chuyên đề Khóa luận tốt nghiệp: “PHÂN TÍCH TỔNG HỢP VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐỘT BIẾN NỔI TRỘI TRÊN GENE ANGPTL3 ĐỐI VỚI BỆNH CAO LIPID TRONG MÁU”. Mục tiêu: Sử dụng phương pháp PCR kết hợp giải trình tự để phân tích đột biến trên gene ANGPTL3 được thu thập ở một số mẫu máu ở bệnh nhân cao lipid trong máu ở Việt Nam.
Khảo sát mức độ xuất hiện biến thể trên gene ANGPLT3 ở người bệnh cao cholesterol trong máu trên thế giới cùng với đặc điểm trình tự một số exon của gene ANGPTL3 trên người bệnh cao cholesterol Việt Nam. Đồng thời, xây dựng dữ liệu về trình tự tham chiếu, bộ mồi phù hợp với các quy trình phân tích, phát hiện biến thể gây nên bệnh cao cholesterol trong máu. Nội dung nghiên cứu: Thu thập dữ liệu về cơ sở phân tử của bệnh cao lipid trong máu, tập trung vào tính chất đột biến trên các exon thuộc gene ANGPTL3 liên quan đến bệnh cao lipid trong máu trên thế giới và Việt Nam. Khảo sát in silico bộ mồi của quy trình PCR kết hợp giải trình tự nhằm xác định tính chất đột biến điểm ở gene ANGPTL3.
Thực hiện quy trình PCR kết hợp giải trình tự nhằm xác định đột biến điểm nổi trội ở Việt Nam, cụ thể là các mẫu bệnh phẩm máu có chỉ số cao cholesterol được thu nhận tại Việt Nam. SVTH: Hồ Bảo An 2 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP I. TỔNG QUAN SVTH: Hồ Bảo An 3 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 1. Tổng quan về cholesterol 1.
Cấu trúc của cholesterol Cholesterol hiện diện trong các tế bào nhân thực (Eukaryote) và một số nhóm loài thuộc nhân sơ (Prokaryote), cholesterol là một hợp chất chứa 27 carbon với ba vùng cấu tạo chính bao gồm một đầu ưa nước, một đầu kỵ nước (giúp cho cholesterol không bị trộn lẫn vào nước) và vùng trung tâm chứa bốn vòng hydrocarbon giúp cho cholesterol có độ cứng (Schade et al., 2020; Craig et al. Vùng trung tâm của cholesterol là vùng mang chức năng chính của tất cả các steroid hormone, nhờ những cấu tạo đó mà cholesterol được đóng gói chung với apoprotein để được mang đi khắp cơ thể thông qua các mạch máu, bên cạnh đó, cơ thể con người có thể tổng hợp cholesterol tự do và cũng có thể thu nạp cholesterol từ hấp thụ chất dinh dưỡng (Hình I.1) (Craig et al. Cấu trúc của cholesterol (Peng et al. Vai trò của cholesterol Trong tế bào động vật có vú và con người, cholesterol được tổng hợp chủ yếu thông qua con đường tiền chất acetate hoặc hấp thu các nguồn thực phẩm hoặc ở gan (Russell et al.
Cholesterol là một phân tử sinh học đem lại nhiều chức năng cần thiết cho con người, từ sinh sản đến vận chuyển chất dinh dưỡng đến những quá trình hoạt động của tế bào, cholesterol có ở khắp mọi nơi trong cơ thể giới động vật (Craig et al. Cholesterol là một hợp chất có vai trò quan trọng trong màng tế SVTH: Hồ Bảo An 4 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP bào, là thành phần chính trong việc đảm bảo tính vẹn toàn và tính lỏng của màng tế bào và là tiền chất để tổng hợp các hormone steroid được sản xuất bởi tuyến thượng thận, các acid mật và vitamin D (Craig et al., 2018; Cerqueira et al., 2016; Russell et al. Sự điều hòa cân bằng nội mô cholesterol trong cơ thể được thực hiện thông qua 3 con đường chính: (1) điều hòa hoạt động sản xuất thụ thể lipoprotein tỷ trọng thấp, (2) hoạt hóa và điều hòa enzyme khử HMG – CoA và những enzyme khác trong con đường sinh tổng hợp cholesterol, (3) điều hòa sự tổng hợp 7α - hydroxylase trong acid mật (Russell et al. Sự bất thường về lượng cholesterol trong cơ thể là yếu tố tác động xấu đến sức khỏe con người, đặc biệt có liên quan đến các bệnh lý tim mạch.
(Cerqueira et al. Cấu trúc của lipoprotein Do cấu trúc kỵ nước của cholesterol do đó nó không thể tan tốt trong mạch máu, vì vậy cholesterol được đóng gói trong lipoprotein có chứa phospholipid và apolipoprotein (Apo) (Wang et al. Lipoprotein là một đại phức hợp giữa lipid và protein (Genest et al,. Cấu trúc chung của lipoprotein là hình cầu, chúng chứa nhiều thành phần khác nhau với lõi trung tâm được cấu tạo bởi lõi lipid, nơi chứa các cholesterol ester và trygliceride, lipoprotein có lớp ưa nước bên ngoài bao gồm apolipoprotein, phospholipid và các cholesterol tự do (Hình I.2-A) (Huff et al.
Nhờ những cấu trúc đặc trưng này mà lipoprotetin có thể dễ dàng di chuyển khắp cơ thể thông qua máu và đến các tế bào (Huff et al., 2022; Craig et al. Phân loại của lipoprotein Dựa vào kích thước của các apolipoprotein, kích thước phân tử và mật độ lipid nên chúng đóng một vai trò quan trọng trọng việc phân loại lipoprotein thành năm loại chính: chylomicron, lipoprotein mật độ rất thấp (Very Low-density Lipoprotein, VLDL), lipoprotein mật độ trung bình (Intermediate-density Lipoprotein, IDL), lipoprotein mật độ thấp (Low-density Lipoprotein, LDL), và lipoprotein mật độ cao (High-density Lipoprotein, HDL) (Hình I.2) (Lent-Schochet et al., 2022; Tulenko et al., 2002; Ginsberg et al. Trong đó, HDL còn được xem như là một “cholesterol tốt” có thể đảo ngược quá trình vận chuyển cholesterol, LDL SVTH: Hồ Bảo An 5 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP được xem như “cholesterol xấu” có thể thúc đẩy gây ra các bệnh tim mạch (Lent- Schochet et al., 2022; Tulenko et al. Cấu trúc cảu các lipoprtoein được mô tả chi tiết như sau: Hình I.
Cấu trúc của lipoprotein (A) và phân loại các lipoprotein (B) − Chylomicron được tổng hợp từ ruột non, có kích thước lớn (đường kính 100 – 1000 nm, tỷ trọng > 0,95 g/ml), và giàu triglyceride, nhưng chỉ chứa lượng nhỏ protein trong phân tử, có chức năng vận chuyển các triglyceride từ ruột đến các mô trong cơ thể (Durrington et al. − VLDL (đường kính 40 – 50 nm, tỷ trọng > 1,006 g/ml) là các phân tử lipoprotein được tổng hợp từ gan, nhỏ hơn chylomicron. VLDL cũng trải qua các trình tự chuyển hóa tương tự chylomicron, chúng loại bỏ trygliceride khỏi lõi trung tâm và sản phẩm cuối cùng của chúng là LDL (Charlton‐Menys et al., 2008; Durrington et al., 2007; Genest et al,. − IDL (đường kính 25 – 30 nm, tỷ trọng 1,006 – 1,019 g/ml) là những lipoprotein VLDL còn sót lại sau khi chúng cạn kiệt triglyceride, vì vậy phải thu nạp thêm cholesterol và hình thành nên IDL, các IDL bị khử lipid bởi các hepatic lipase (HL) để hình thành các LDL (Genest et al.
− LDL (đường kính 20 – 25 nm, tỷ trọng 1019 – 1063 g/ml) rất giàu cholesterol và có kích thước vừa đủ để có thể thâm nhập vào trong nội mô mạch máu, và có thể SVTH: Hồ Bảo An 6 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP xâm nhập vào trong các mô do đó chúng có thể tương tác với mọi tế bào trong cơ thể, chức năng chính của LDL là vận chuyển cholesterol để đưa cholesterol vào trong tế bào (Genest et al,. − Tương tự như LDL, HDL có khả năng khả năng xâm nhập vào trong nội mô mạch máu nhưng có kích thước nhỏ hơn (đường kính 6 – 10 nm, tỷ trọng 1063 – 1210 g/ml). HDL được xem xét về khả năng thu thập những cholesterol thặng dư từ quá trình vận chuyển từ các mô ngoại vi xuyên qua các dịch ngoài bào để đưa cholesterol trở về lại gan và để phá hủy cholesterol bởi túi mật, chuyển đổi thành muối mật hoặc chuyển đổi để “tái sản xuất” trở lại cho các lipoprotein (Durrington et al. Các đặc điểm phân biệt lipoprotein Kích thước Lipid (%) Lipoprotein Mật độ (g/ml) (nm) TG PL CH Chylomicron <0,93 100 – 500 80 – 95 3–9 2–7 VLDL 0,93 – 1,006 30 – 80 55 - 80 10 – 20 5 – 15 IDL 1,006 – 1,019 25 – 50 20 – 50 15 – 25 20 – 40 LDL 1,019 – 1,063 18 – 28 5 – 15 20 – 25 40 – 50 HDL 1,063 – 1,210 5 - 15 5 – 10 20 – 30 15 – 25 Chú thích: VLDL: lipoprotein tỷ trọng rất thấp; LDL: lipoprotein tỷ trọng thấp; IDL: lopprotein tỷ trọng trung bình; HDL: lipoprotein tỷ trọng cao; TG: triglyceride, PL: phospholipid, CH: cholesterol.
Tài liệu tham khảo: Lent-Schochet et al., 2022; Tulenko et al., 2002; Ginsberg et al.