CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. XÁC ĐỊNH TÍNH AN TOÀN CỦA THUỐC Ở GIAI ĐOẠN TIỀN LÂM SÀNG 1. Xác định độc tính cấp 1. Mục tiêu Thuốc muốn được sử dụng phải an toàn và có hiệu lực.
Xét về tổng thể thì tính an toàn còn quan trọng hơn hiệu lực, vì một thuốc dù có hiệu lực đến đâu, nhưng nếu không an toàn thì cũng không được sử dụng. Trong nghiên cứu thuốc, vấn đề độc tính có tầm quan trọng hàng đầu. Để chứng minh thuốc có an toàn thì phải nghiên cứu độc tính. Thử độc tính tiền lâm sàng là một trong những nội dung quan trọng trong nghiên cứu phát triển dược phẩm.
Thông tin về độc tính của thuốc cần được cung cấp trước khi thực hiện các thử nghiệm trên người. Do vậy, hầu hết các chất được dùng làm thuốc trong điều trị dự phòng và chữa bệnh đều phải được thử nghiệm xác định độc tính. Tại Việt Nam, nghiên cứu về độc tính cũng như độ an toàn của thuốc được quy định trong hướng dẫn của Bộ y tế về đánh giá tính an toàn và tác dụng của thuốc. Theo quy định của Bộ y tế, thử nghiệm độc tính cấp và độc tính bán trường diễn là bắt buộc đối với tất cả các chế phẩm y học cổ truyền không phải bài thuốc cổ phương bào chế dạng truyền thống [4].
Năm 1927, JW Trevan đã cố gắng để tìm một cách để ước tính hiệu lực ngộ độc tương đối của các loại thuốc và các loại thuốc được sử dụng tại thời điểm đó. Ông đã phát triển thử nghiệm LD50 vì việc sử dụng cái chết như là một "mục tiêu" cho phép so sánh giữa các hóa chất độc phơi nhiễm cho cơ thể theo những cách rất khác nhau. Kể từ khi tác phẩm đầu tay của Trevan, các nhà khoa học khác đã phát triển phương pháp tiếp cận khác nhau để thử nghiệm LD50 trực tiếp hơn, nhanh hơn. LD là viết tắt của "Lethal Dose".
LD50 là liều lượng của hoá chất phơi nhiễm trong cùng một thời điểm, gây ra cái chết cho 50% (một nửa) của một nhóm động vật dùng thử nghiệm. LD50 là một cách thức đo lường khả năng ngộ độc ngắn hạn (độc tính cấp tính) của một hoá chất. 4 Độ độc cấp tính là khả năng của một hóa chất gây ra tác động xấu tương đối sớm nhất sau khi uống hoặc sau 4 giờ tiếp xúc liên tục với một hóa chất trong không khí. "Tương đối sớm" thường được định nghĩa như là một khoảng thời gian phút, giờ (lên đến 24) hoặc ngày (khoảng 2 tuần) nhưng hiếm khi dài hơn nên giá trị của LD50 là cần thiết và có ý nghĩa khoa học.
Thử độc tính cấp nhằm cung cấp thông tin cho việc xếp loại mức độ độc của thuốc; điều trị ngộ độc cấp; thiết lập mức liều cho những thử nghiệm độc tính tiếp theo [5]. Do vậy, các phép thử độc tính cấp cần xác định: - Liều an toàn; - Liều dung nạp tối đa; - Liều gây ra độc tính có thể quan sát được; - Liều thấp nhất có thể gây chết động vật thí nghiệm (nếu có); - Liều LD50 gần đúng (nếu có thể xác định được); Dưới đây là một số định nghĩa cụ thể: - Độc tính của thuốc: độc tính (toxicity) của thuốc là tính chất được biểu hiện bằng tác dụng không mong muốn, có hại cho cơ thể. Độc tính của thuốc có thể nhẹ như thay đổi hành vi, thay đổi vận động, buồn nôn, mẩn ngứa, có thể rất nặng, thậm chí gây chết. - Độc tính cấp của thuốc: độc tính cấp (acute toxicity) của thuốc là độc tính xảy ra sau khi dùng thuốc một lần hoặc vài ba lần trong ngày.
Nghiên cứu độc tính cấp của thuốc trên động vật thí nghiệm, mục đích chính là xác định liều chết trung bình (mean lethal dose) tức là liều làm chết 50% số con vật thí nghiệm trong những điều kiện nhất định và được ký hiệu là LD50 (lethal dose 50%). - Liều chết: là liều gây chết con vật dùng thuốc, ký hiệu là LD (lethal dose). Liều chết không áp dụng thử cho người mà chỉ thử trên các con vật thí nghiệm. - Liều chết tuyệt đối: liều chết tuyệt đối được viết tắt là ALD (absolute lethal dose), thường được ký hiệu là LD100.
Đó là liều nhỏ nhất gây chết 100% các con vật thí nghiệm. Tất nhiên nếu dùng liều cao hơn LD100 thì tất cả các con vật đều bị chết cả. - Liều chết trung bình: liều chết trung bình viết tắt là MLD (mean lethal dose) thường được ký hiệu là LD50. Đó là liều làm chết 50% số con vật thí nghiệm.
5 - Liều chết tối thiểu: Liều chết tối thiểu là liều khi thử trên một lô động vật thấy có một con chết. Do đó nếu thử 20 con có một con chết thì liều chết tối thiểu là liều gây chết 5% (LD5); chết 10% (LD10); còn nếu chỉ thử 4 con có một con chết thì liều chết tối thiểu là liều gây chết 25% (LD25). - Liều dưới liều chết: liều dưới liều chết (ILD: infralethal dose) còn gọi là liều dung nạp tối đa (MTD: maximum tolerated dose) được ký hiệu là LD0 là liều lớn nhất, nhưng không làm chết con vật nào. Liều MTD có thể gây độc nhẹ hoặc nặng cho con vật, nhưng không gây chết.
- Liều an toàn: là mức liều cao nhất mà không gây ra bất kỳ tai biến nào có thể quan sát được (NOAEL: no obsered adverse effect level). Những triệu chứng ngộ độc điển hình có thể quan sát được trên động vật và khả năng hồi phục (nếu có) [6]. Động vật thực nghiệm Động vật nghiên cứu: thử ít nhất trên 2 loài động vật có vú, trong đó có một loài không gặm nhấm. Tùy điều kiện, có thể chấp nhận thử độc tính cấp trên một loài động vật.
- Loài gặm nhấm thường sử dụng là chuột nhắt, chuột cống. - Loài không gặm nhấm có thể dùng là chó hoặc khỉ. Nên sử dụng số lượng động vật thí nghiệm nhỏ nhất, tùy theo mô hình áp dụng (thường là 3 đến 5 con/mức liều) [7]. Đường dùng Có thể dùng đường uống, tiêm bắp thịt, tiêm dưới da, tiêm phúc mạc, tiêm tĩnh mạch.
Tốt nhất là dùng đường dự định sẽ dùng cho người trên lâm sàng sau này. Cho uống bằng ống xông phải chú ý tránh cho thuốc vào khí quản vì chuột sẽ chết mà không phải do tác dụng độc của thuốc. Mức liều thử Tốt nhất là tính theo ml/kg cân nặng cho tất cả các lô. Nếu vậy, nồng độ thuốc dùng cho các lô khác nhau phải khác nhau.
Riêng với chuột nhắt trắng, nếu dùng uống thì thể tích dùng tốt nhất là 0,2-0,5 ml cho một con chuột nặng 20g. Trường hợp buộc phải dùng thể tích lớn hơn, có thể dùng đến thể tích 0,8-1 ml cho một con chuột 20g. Nếu muốn cho uống thể tích lớn hơn, nên chia ra làm 2-3 lần uống trong ngày. Cần 6 chú ý là khi dùng thể tích lớn (từ 1ml trở lên cho một con chuột 20g), nếu chuột không chết, ta có thể khẳng định là ở liều đó chuột không chết.
Nếu chuột chết thì có thể là do độc tính của thuốc, nhưng cũng có thể chết là do đã dùng một thể tích quá lớn làm dạ dày chuột căng quá mức hoặc vỡ bục ra. Qua đường tiêm, có thể tiêm tĩnh mạch, tiêm bắp thịt, tiêm phúc mạc, tiêm dưới da, tùy theo đường tiêm dự kiến trên người. Khi tiêm thể tích lớn, đặc biệt là tiêm tĩnh mạch, cầm làm ấm dung dịch tiêm lên khoảng 37°C trước khi tiêm để tránh cho con vật không lạnh khi bị tiêm thuốc. Phải đảm bảo tốc độ tiêm hoặc truyền theo đúng chỉ định, pH dịch tiêm phải giống như pH dự kiến dùng cho người, dụng cụ tiêm cần phải vô trùng.
Trong một số trường hợp cần tiêm thể tích lớn vào bắp thịt hoặc dưới da, có thể tiêm vào nhiều vị trí khác nhau. - Số lần dùng thuốc: Khi thử độc tính cấp, về nguyên tắc chỉ dùng thuốc một lần. Trong những trường hợp đặc biệt, có thể dùng vài lần trong ngày. - Dung môi hòa tan thuốc: Dung môi hòa tan thuốc tốt nhất là dùng nước cất.
Trường hợp thuốc không tan trong nước cất thì: Nếu dùng uống: phải nghiền thuốc thật mịn trong nước cất, tạo thành hỗn dịch đồng nhất. Nếu cần, thêm dịch gồm để hỗn dịch phân tán được đồng đều và lắng chậm. Nếu dùng tiêm: phải dùng loại dung môi dự kiến sẽ dùng chế thuốc để tiêm cho người sau này. Một số mô hình được dùng với số lượng động và số liều dùng ít nhất như: Mô hình liều cố định: thử với một số liều cố định 5, 50, 300, 2000, 5000mg/kg.
Dùng 5 con vật cho mỗi nhóm, thử lần lượt từng mức liều một. Lựa chọn liều khởi đầu là một trong số các liều cố định đã gợi ý, tùy theo kết quả đáp ứng của liều khởi đầu mà tiến hành thử tiếp những mức liều cao hơn hoặc thấp hơn. Thử nghiệm sẽ được tiếp tục cho đến khi xác định được một mức liều gây độc tính rõ ràng, hoặc liều gây chết không quá 1 con, hoặc liều cao nhất không gây ảnh hưởng gì hoặc mức liều thấp nhất gây chết động vật thí nghiệm [8], [9]. Mô hình phân loại độc: thử theo quy trình bậc thang, mỗi bước dùng 3 con cùng giới (uống một trong các mức liều đã được xác định).
Tùy theo động vật có chết hay không ở một bước thử mà xác định cho bước thử tiếp theo, như không cần thử 7 thêm nữa, hoặc thử thêm 3 con vật nữa với cùng mức liều đó hoặc thử thêm trên 3 con nữa ở mức liều cao hơn hoặc thấp hơn [10]. Mô hình thử Tăng - Giảm: thử lần lượt các liều đơn đã được định trước, mỗi liều ở một thời điểm, cách nhau tối thiểu là 48 giờ. Con vật đầu tiên uống ở mức liều thấp hơn gần nhất với liều ước tính LD50[10]. Nếu con vật đó sống thì liều cho con tiếp theo sẽ tăng 3,2 lần so với liều vừa thử trước đó, còn nếu bị chết thì giảm liều xuống 3,2 lần.
Quan sát cẩn thận tình trạng từng con vật trong suốt 48 giờ để quyết định nên cho con tiếp theo uống hay không và cho uống với liều bao nhiêu [11]. Mô hình theo Litchfield – Wilcoxon: Động vật thường dùng là chuột nhắt trắng, cả 2 giống, trọng lượng 20 ± 2g, được chia thành từng lô, mỗi lô 10 con. Cho từng lô chuột uống thuốc thử với các liều khác nhau từ liều cao nhất không gây chết tới liều thấp nhất gây chết 100% chuột. Chuột được uống thuốc bằng kim hơi cong có đầu tù với độ dài đưa vào đến dạ dày chuột.
Chuột được nhịn ăn 12 giờ trước khi uống thuốc, vẫn uống nước đầy đủ [12], [13].
