Đặt vấn đề Polisaccarit là hợp chất hydrate carbon cao phân tử do nhiều gốc monosaccharide kết hợp với nhau. Nhiều polisaccarit khác nhau trong thực vật đã được các tác giả trên thế giới nghiên cứu chứng minh tác dụng trong Y học: kháng viêm, phân hủy fibrin, làm lành vết thương. Các polisaccarit như: Beta-glucans (Vetvicka, 2008), pectin (Puhlann, 1992; Lim, 2003), chất nhày (nhóm galactomannan) (Santander, 2011; Hussein, 1998) có tác dụng tăng cường miễn dịch, kháng viêm cao. Các pectin từ thực vật có tác dụng kháng viêm, giảm các cytokine tiền viêm ở chuột khi tiêm LPS (Ovodova, 2009; Sherry, 2010).
Fucans, một polisaccarit từ tảo Lobophora variegate có khả năng kháng viêm, giảm sự giải phóng các TNFα (Almino, 2011). Tại Việt Nam, các bệnh về viêm, điều trị các vết thương thường sử dụng các thuốc hóa học tổng hợp, cần phải điều trị dài ngày và thường gây hiệu quả phụ cho sức khỏe người bệnh. Vì vậy, hướng nghiên cứu và sử dụng các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên trong Y, Dược đang thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới và Việt Nam bởi việc sử dụng các thuốc có nguồn gốc thảo dược sẽ giảm tác dụng phụ và chi phí điều trị. Các nghiên cứu trước đây của chúng tôi cho thấy trong lá cây Xuân Hoa Pseuderanthemum palatiferum chứa hàm lượng cao polisaccarit.
Cây Xuân Hoa P. palatiferum (Nees) Radlk thuộc họ Ôrô Acanthaceae được dùng trong dân gian Việt Nam để chữa nhiều bệnh. Trong khoảng 15 năm gần đây, nhiều nhà khoa học Việt Nam và thế giới đã xác minh được một số tác dụng sinh học của lá cây thuốc này như: kháng khuẩn, kháng nấm, tác dụng chống oxi hóa, giảm huyết áp, hạ đường huyết. Tuy nhiên việc nghiên cứu cấu trúc, đặc tính và tác dụng dược lý chỉ tập trung vào nhóm các chất như: flavonoids, phytol, 1 Luận Văn Thạc Sĩ Trần Thị Vân Anh triterponoid saponin, stigmasterol, salicylic acid… Cho đến nay chưa có công bố nào nghiên cứu về các đặc tính sinh hóa và tác dụng dược lý của polisaccarit từ cây thuốc Xuân Hoa P.
Trong khóa luận này, chúng tôi sẽ nghiên cứu các điều kiện tách chiết, tinh sạch và xác định các tính chất sinh hóa và một số tác dụng dược lý (kháng viêm, điều hòa miễn dịch và làm lành vết thương của polisaccarit từ cây thuốc này). Các kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ góp phần bổ sung những thông tin khoa học mới về cây thuốc quý của Việt Nam, đồng thời có thể đáp ứng được nhu cầu sử dụng nguồn dược liệu trong nước với giá thành rẻ để phục vụ nhân dân. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài • Chiết rút và tinh sạch được polisaccarit từ lá cây thuốc Xuân Hoa P. palatiferum (Nees) Radlk có độ sạch đạt trên 90%.
• Xác định được một số đặc tính sinh hóa như: độ sạch, độ nhớt, trọng lượng phân tử của polisaccarit, ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến chất lượng của chế phẩm polisaccarit tinh sạch. • Điều tra một số tác dụng dược lý (tác dụng kháng viêm, tăng cường miễn dịch và làm lành vết thương) của polisaccarit từ cây thuốc này. 2 Luận Văn Thạc Sĩ Trần Thị Vân Anh PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Polisaccarit Polisaccarit là các saccarit bao gồm từ hai đến nhiều gốc đường đơn kết hợp với nhau.
Polysaccarit được chia thành 2 phân nhóm oligosaccarit và polisaccarit. - Oligosaccarit Bao gồm không quá 10 gốc monosaccarit kết hợp với nhau bằng liên kết O-glucozit. Oligosaccarit phổ biến nhất là nhóm disaccarit bao gồm các đường kép điển hình. Ngoài disaccarit còn có trisaccarit, tetrasaccarit… Các disaccarit phổ biến là mantoz, lactoz và saccatoz.
Ví dụ : + Mantoz (còn gọi là đường mạch nha), được cấu tạo từ 2 phân tử α-D- glucoz. Liên kết glucozit được tạo thành giữa một OH-glucozit với OH ở C4 của gốc glucoz thứ hai. Do đó phân tử manozo vẫn còn chứa một nhóm OH- glucozit tự do, nên vẫn giữ được tính khử nhưng chỉ bằng một nửa của glucoz. + Saccaroz (đường mía) được cấu tạo từ α-D-glucoz và β-D-glucoz.
Hai monosaccarit này kết hợp với nhau qua liên kết glucozit được tạo thành giữa hai nhóm OH-glucozit của chúng. Vì vậy sacaroz không có tính khử, sacaroz hòa tan tốt trong nước. + Trisaccarit phổ biến và được biết rõ hơn cả là rafinoz. Rafinoz được cấu tạo chủ yếu từ 3 monosaccarit là glucoz và fructoz.
+ Tetrasaccarit phổ biến được biết đến là stakioz cấu tạo từ 4 gốc monosaccarit, trong đó có 2 gốc α-D-galactoz, một gốc α-D-glucoz và một gốc β-D-glucoz. + Stakioz và ranfinoz không có tính khử vì tất cả các nhóm OH-glucozit đều tham gia tạo thành liên kết glucozit (Phạm Thị Trân Châu, 1997). 3 Luận Văn Thạc Sĩ Trần Thị Vân Anh - Polisaccarit Polisaccarit do nhiều gốc monosaccarit kết hợp với nhau có khối lượng phân tử lớn. Các monosaccarit trong phân tử polisaccarit có thể thuộc một hay nhiều loại khác nhau.
Trong một số trường hợp các gốc monosaccarit có chứa các nhóm thế glucozit trong phân tử polisaccarit có thể là α- hoặc β-glucozit. Tên gọi polisaccarit phân theo tên của monosaccarit cấu tạo nên nó nhưng đổi đuôi ‘oz’ thành đuôi ‘an’. Ví dụ : D-glucan, D-Fructan, D-galactan, D- galactoglucan. Những monosaccarit thường gặp trong phân tử polisaccarit là hexoz (glucoz, galactoz, mantozo) hoặc pentozo (arabinoz, xiloz,…).
So với aldoz thì xetoz ít tham gia tạo thành phần polisaccarit hơn. Những polisaccarit chứa hơn 5-6 loại monosaccarit khác nhau rất ít gặp. Tùy theo nguồn gốc tự nhiên, polisaccarit chia thành 3 nhóm lớn: Polisaccarit vi sinh vật, polisaccarit động vật và polisaccarit thực vật. Polisaccarit vi sinh vật điển hình (Phạm Thị Trân Châu,1997) Nhóm polisaccarit này được tích tụ một lượng đáng kể trong dịch nuôi cấy của vi sinh vật do đó có thể tách ra một cách cụ thể dễ dàng.
Ví dụ : + Nigeran là polysaccarit được tách ra từ dịch nuôi cấy của aspergilus niger, nigenran do các gốc D-glucopiranoz kết hợp với nhau bằng liên kết α- 1→3 và α-1→4 glucozit luân phiên nhau. + Dextran là glucan do một số vi khuẩn giống Leuconostoc Streptococus tổng hợp khi nuôi cấy trên dung dịch có chứa xacaroz. Trong đó các vi khuẩn này có enzyme dextran-sucraza xúc tác quá trình biến sacaroz thành dextran. Dextran được dùng làm chất thay thế huyết thanh của máu và nó cũng là nguyên liệu ban đầu sản xuất sephadex là những rây phân tử có nhiều ứng dụng thực tế trong phòng thí nghiệm.
4 Luận Văn Thạc Sĩ Trần Thị Vân Anh * Polisaccarit động vật điển hình (Phạm Thị Trân Châu, 1997). Polisaccarit ở động vật có hàm lượng nhỏ hơn so với polisaccarit ở thực vật nhưng polisaccarit ở động vật giữ vai trò quan trọng trong cơ thể động vật. Polisaccarit ở động vật chia thành các loại như glicogen, kitin, heparin,… + Glicogen cũng thuộc glucan, là polysaccarit dự trữ ở động vật và người. trong đó, glicogen có cấu tạo phân nhánh tương tự amilopectin của tinh bột nhưng có độ phân nhánh nhiều hơn.
Phần lớn các gốc glucoz trong phân tử kết hợp với nhau tạo liên kết α-1→4-glucozit, liên kết α-1→6-glucozit ở chỗ phân nhánh của phân tử. Glicogen có thể bị thủy phân dưới tác dụng của enzymee hoặc axit, khi thủy phân hoàn toàn nhận được α-D-glucoz. Glicogen hòa tan trong nước nóng, và có màu đỏ tím hoặc đỏ nâu với Iot. Ở động vật glicogen tập trung chủ yếu ở gan và cơ (Trần Thị Áng, 1997) + Kitin do các gốc N-axetil β-glucozamin kết hợp với nhau bằng liên kết β- 1→4-glucozit.
Kitin là hợp phần chính của bộ khung bên ngoài của ngành chân khớp và một số động vật không xương sống khác. Về số lượng kitin chiếm vị trí thứ 2 trong xenluloz, trong các hợp chất hữu cơ có trên quả đất. Nếu xử lý kitin bằng kiềm đặc kết hợp với nung nóng 1 phần nhóm N-axetil sẽ bị tách và tạo thành chitozan. Chitozan đang được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực khác nhau: thực phẩm, dược phẩm, công nông nghiệp… + Heparin là một mucopolysaccarit có tính chất sinh học quan trọng, là chất chống đông máu.
Heparin có trong nhiều tổ chức của cơ thể, nhưng chủ yếu là ở gan , phổi và cơ. Thường heparin được liên kết với protein. Các polisaccarit thực vật điển hình (Phạm Thị Trân Châu, 1997) Trong tự nhiên polisaccarit thực vật có tầm quan trọng đặc biệt đối với cuộc sống và có nhiều hoạt tính sinh học có giá trị. 5 Luận Văn Thạc Sĩ Trần Thị Vân Anh + Axit anginic là hợp phần chính của thành tế bào rong nâu.
Axit anginic của các rong khác nhau về thành phần đơn phân, chúng đều chứa axit D-manuronic và L-gluronic với tỉ lệ xê dịch trong khoảng 0,5-3. Các monosaccarit trong axit anginic kết hợp với nhau bằng liên kết 1→4-glucozit và tạo thành mạch thẳng. + Thạch (agar) là một sunfat của polisaccarit tích tự nhiều ở trong loại rong đỏ gồm 2 dạng polisaccarit : agaroz và agaropectin. Agaroz do D-galactopiranoz và 3,6 anhidro L-galactopiranoz tạo nên bằng liên kết 1→4 và liên kết 1→3- glucozit.
Agaropectin khác với agaroz về hàm lượng nhóm sunfat. Cấu tạo chi tiết của agaropectin chưa được sáng tỏ. Thạch cũng như axit anginic có nhiều ứng dụng trong công nghiệp dệt, công nghiệp thực phẩm và một số ngành sản xuất khác. + Inulin là polisaccarit dự trữ của nhiều loại thực vật do D-fructoz tạo nên và inulin chứa một polisaccarit có tên là fructan gồm các D-fructo furanoz kết hợp với nhau bằng liên kết (2→1)-glucozit và tận cùng bằng một xacaroz không khử.
Inulin có nhiều nhất trong củ mẫu đơn (12%) rễ cải đắng (10%) cũng như trong cây họ nhà hòa thảo. Người và động vật đồng hóa inulin dễ dàng. Inulin dễ hòa tan trong nước nóng, để lạnh lắng xuống thành kết tủa. Khối lượng phân tử của inulin tương đối thấp (5000-6000) Da.
+ Tinh bột là polisaccarit dự trữ chủ yếu trong thế giới thực vật. Tinh bột có nhiều trong quả, hạt (trong hạt thóc, ngô, lúa mì tinh bột chiếm 70%), củ và trái cây. Tinh bột cũng có một ít trong lá. Tinh bột gồm 2 cấu tử là amiloz và amilopectin đều do các đơn vị glucoz tạo nên.
Trong amiloz các gốc glucoz kết hợp với nhau bằng liên kết α-1→4-glucozit tạo thành mạch thẳng. Amilopectin có cấu tạo nhánh, ở điểm phân nhánh các gốc glucoz kết hợp với nhau bằng liên kết α-1→4-glucozit và liên kết phụ α-1→6-glucozit. Amiloz hòa tan dễ dàng trong nước ấm và trong dung dịch có độ nhớt không cao. Amilopectin chỉ 6 Luận Văn Thạc Sĩ Trần Thị Vân Anh hòa tan trong nước nóng khi có áp suất và trong dung dịch có độ nhớt rất cao.
Amiloz có phân tử lượng 10.000 Da, còn phân tử lượng của amilopectin lại xê dịch 50. Hóa tính đặc trưng nhất của tinh bột là phản ứng màu với iot. Tinh bột tương tác với iot tạo màu xanh và đôi khi thấy màu đỏ.