Luận văn thạc sĩ hus nghiên cứu tính đa dạng sinh học của nhóm nấm hyphomycetes phân lập từ lá cây mục litter fungi ở một số rừng quốc gia việt nam

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu hus nghiên cứu tính đa dạng sinh học của nhóm nấm hyphomycetes phân lập từ lá cây mục litter fungi, đánh giá hiện trạng, phân tích vấn đề, đề xuất biện

• Tác giả: Lê Thị Hoàng Yến
• Người hướng dẫn: PGS. Dương Văn Hợp
• Trường học: Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên
• Chuyên ngành: Vi Sinh Vật Học
• Đề tài: Nghiên cứu tính đa dạng sinh học của nhóm nấm Hyphomycetes phân lập từ lá cây mục (litter fungi) ở một số rừng quốc gia Việt Nam
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt
• Danh mục các bảng
• Danh mục các hình vẽ
• 1. Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ NẤM
• 1.1.1. Nấm và các đặc điểm chung của nấm
• 1.2. Các nghiên cứu về tiến hóa về nấm
• 1.3. Hệ thống phân loại nấm
• 1.4. Phân loại học của nấm bất toàn (Mitosporic fungi hay microsporidia fungi)
• 1.5. Nhóm nấm Hyphomycetes
• 1.5.1. Các tiêu chí sử dụng trong phân loại Hyphomycetes bằng đặc điểm hình thái
• 1.5.1.1. Các đặc điểm khuẩn lạc
• 1.5.1.2. Các đặc điểm của sợi nấm và vách ngăn của sợi nấm
• 1.5.1.3. Hình thái các cơ quan sinh bào tử của vi nấm Hyphomycetes
• 1.5.1.4. Các kiểu phát sinh bào tử trần của nấm
• 1.5.1.4.1. Phát sinh bào tử dạng nảy chồi hướng gốc (Basipeptal):
• 1.5.1.4.2. Nảy chồi chuỗi hướng ngọn (Acropetal)
• 1.5.1.4.3. Phát sinh bào tử dạng tản (Thallic)
• 1.5.1.5. Các phương thức bào tử rời khỏi cuống:
• 1.5.2. Các tiêu chí sử dụng trong phân loại Hyphomycetes bằng phân tích trình tự gen ADN riboxom
• 1.5.2.1. Cấu trúc ADN riboxom của nấm và vai trò của chúng trong phân loại sinh học phân tử
• 1.5.2.1.1. Cấu trúc ADN riboxom của nấm
• 1.5.2.1.2. Vai trò của các đoạn ADNr trong phân loại nấm sợi
• 1.5.2.2. Vùng ADN mã hóa trong phân loại nấm(ADN barcoding fungi)
• 1.5.2.3. Phân tích sự phát sinh chủng loại
• 1.5.2.4. Một số phương pháp khác dùng trong phân loại nấm dựa vào phântích sinh học phân tử
• 1.5.2.5. Nghiên cứu phân loại giới nấm dựa trên phân tích cây chủng loại phát sinh
• 1.5.2.6. Nghiên cứu phân loại nhóm nấm Hyphomycetes dựa trên phân tích cây chủng loại phát sinh
• 1.5.3. Các bước tiến hành trong phân loại vi nấm
• 1.5.3.1. Phân loại hình thái kết hợp với phân tích trình tự gen ADN riboxom
• 1.5.3.2. Phân loại một bậc phân loại nấm mới
• 1.5.3.3. Các nguyên lý cơ bản trong xác định danh pháp nấm (nomenclature)
• 1.5.5. Nấm tồn tại trên xác thực vật và các phương pháp phân lập chúng
• 1.5.5.1. Các dạng sinh thái của nấm
• 1.5.5.2. Nấm tồn tại trên xác thực vật
• 1.5.5.3. Các phương pháp phân lập nấm tồn tại trên xác thực vật
• 1.5.5.4. Một số kết quả nghiên cứu đa dạng vi nấm tồn tại trên xác thực vật ở một số nước trên thế giới
• 1.5.5.5. Ở một số Quốc gia khác
• 1.5.6. Nghiên cứu đa dạng nấm ở Việt Nam
• 1.5.7. Một số loài nấm hyphomycetes có khả năng sinh enzyme phân hủy xác thực vật
• 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Mẫu phân lập
• 2.2. Hóa chất và thiết bị
• 2.3. Môi trường
• 2.3.1. Môi trường phân lập, phân loại và giữ giống
• 2.3.2. Môi trường dùng cho nuôi cấy và thử hoạt tính enzyme của nấm
• 2.2. Phương pháp
• 2.2.1. Phương pháp phân lập nấm
• 2.2.1.1. Phân lập bằng phương pháp rửa bề mặt
• 2.2.1.2. Phân lập bằng phương pháp tách bào tử đơn độc
• 2.2.2. Phương pháp nuôi cấy bảo quản nấm sợi
• 2.2.3. Phân loại nấm sợi bằng quan sát hình thái
• 2.2.3.1. Quan sát khuẩn lạc và cấu trúc sinh bào tử dưới kính hiển vi thường
• 2.2.3.2. Quan sát hình thái cơ quan sinh bào tử của nấm dưới kính hiển vi điện tử quét
• 2.2.3.3. Quan sát số lượng nhân trong 1 tế bào của bào tử nấm dưới kính hiển vi huỳnh quang
• 2.2.3.4. Phân tích trình tự ADNr 18S hoặc 28S đoạn D1D2 của nấm
• 2.2.5. Phương pháp nghiên cứu đa dạng sinh học vi nấm
• 2.2.5.1. Tần suất xuất hiện (Frequency)
• 2.2.5.2. Chỉ số đa dạng sinh học loài H' (Shannon and Weiner's Index)
• 2.2.5.3. Chỉ số mức độ chiếm ưu thế hay còn gọi là chỉ số Simpson (Concentration of Dominance- Cd)
• 2.2.5.4. Chỉ số tương đồng (Index of similarity hay Sorensen’s Index- SI)
• 2.2.6. Sàng lọc enzyme phân giải CMC và xylan
• 2.2.7. Sàng lọc enzyme phân hủy lignin
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Sự đa dạng của vi nấm về số lượng chủng nấm
• 3.2. Kết quả về đa dạng vi nấm hyphomycetes phân lập được ở 4 vùng sinh thái khác nhau ở việt nam
• 3.2.1. Sự đa dạng vi nấm phân lập được ở Rừng Quốc gia Ba Bể
• 3.2.2. Sự đa dạng vi nấm phân lập được ở rừng Quốc gia Bạch Mã
• 3.2.3. Sự đa dạng vi nấm phân lập được ở Mã Đà
• 3.2.4. Sự đa dạng vi nấm Hyphomycetes phân lập được rừng Quốc gia Phú Quốc
• 3.1. Sự đa dạng vi nấm dựa vào chỉ số về mẫu và số lượng mẫu
• 3.2. Phát hiện sự đa dạng của vi nấm dựa vào phương pháp phân lập
• 3.3. Sự đa dạng thành phần loài vi nấm Hyphomycetes dựa vào các chỉ số sinh học
• 3.4. Sự đa dạng sinh học của vi nấm ở mức độ Lớp, Bộ, Họ
• 3.5. Sự đa dạng sinh học của vi nấm ở mức độ Chi, Loài
• 3.6. Sự đa dạng về mức độ tương đồng giữa các khu vực nghiên cứu
• 3.7. Mô tả hình thái của một số loài nấm mới ở Việt Nam
• 3.7.1. Polybatispora quinquecornuta Matsush
• 3.7.2. Isthmolongispora genculata Tubaki de Hoog & Hennebert (1983)
• 3.7.3. Isthmolongispora ampulisformis Tubaki de Hoog & Hennebert (1983)
• 3.7.4. Isthmolongispora minima Tubaki de Hoog & Hennebert (1983)
• 3.7.5. Ceratosporella ponapensis Matsush
• 3.7.6. Radiatispora yunaensis Matsush
• 3.7.7. Lateriramulispora ainflata Matsush
• 3.7.8. Scolecobasidium tricladiatum Matsush
• 3.7.9. Triglyphium alabamense Matsush
• 3.7.11. Triramulispora obclavata Matsush
• 3.3. Phát hiện một số chi, loài nấm mới
• 3.3.1. Hai chi nấm mới
• 3.3.2. Năm loài nấm mới
• 3.3.3. Trisulcosporium phuquocense sp. (VN11-F0028) và Trisulcosporium exiguum sp. Polylobatispora ambigua sp. Isthmolongispora phuquocensis sp.
• 3.4. Nghiên cứu đa dạng các chủng nấm sinh enzyme phân hủy lignocellulose
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu đa dạng sinh học nấm Hyphomycetes

Nghiên cứu về đa dạng sinh học của nhóm nấm Hyphomycetes từ lá cây mục ở các rừng quốc gia Việt Nam là một lĩnh vực quan trọng trong sinh học và bảo tồn. Nhóm nấm này đóng vai trò thiết yếu trong quá trình phân hủy chất hữu cơ, giúp duy trì hệ sinh thái rừng. Việc tìm hiểu về sự đa dạng của chúng không chỉ giúp nâng cao hiểu biết về sinh học mà còn có thể ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như nông nghiệp, công nghiệp chế biến thực phẩm và bảo vệ môi trường.

1.1. Đặc điểm và vai trò của nấm Hyphomycetes

Nấm Hyphomycetes là nhóm nấm không có thể quả, thường tồn tại dưới dạng sợi và sinh bào tử trần. Chúng có khả năng phân hủy các chất hữu cơ, đóng vai trò quan trọng trong chu trình dinh dưỡng của hệ sinh thái rừng. Các enzyme mà chúng sản sinh ra giúp phân hủy lignocellulose, từ đó tạo ra các chất dinh dưỡng cho cây cối.

1.2. Tình hình nghiên cứu nấm ở Việt Nam

Việt Nam có một hệ sinh thái phong phú với nhiều loại nấm khác nhau. Tuy nhiên, nghiên cứu về đa dạng sinh học của nấm, đặc biệt là nhóm Hyphomycetes, vẫn còn hạn chế. Chỉ khoảng 400 loài nấm đã được công bố, cho thấy tiềm năng lớn cho các nghiên cứu tiếp theo.

II. Thách thức trong nghiên cứu đa dạng sinh học nấm Hyphomycetes

Mặc dù có nhiều tiềm năng, nghiên cứu về nấm Hyphomycetes ở Việt Nam gặp phải nhiều thách thức. Các vấn đề như thiếu tài liệu, phương pháp nghiên cứu chưa đồng bộ và sự đa dạng sinh học cao trong các khu vực nghiên cứu là những khó khăn chính. Việc bảo tồn và nghiên cứu các loài nấm này là cần thiết để đảm bảo sự phát triển bền vững của hệ sinh thái rừng.

2.1. Thiếu tài liệu và thông tin

Nhiều loài nấm chưa được mô tả và phân loại, dẫn đến việc thiếu thông tin về sự phân bố và đặc điểm sinh học của chúng. Điều này gây khó khăn trong việc đánh giá đa dạng sinh học và xây dựng các chiến lược bảo tồn hiệu quả.

2.2. Khó khăn trong phương pháp nghiên cứu

Các phương pháp phân lập và phân loại nấm hiện tại còn nhiều hạn chế. Việc áp dụng các công nghệ mới như phân tích gen có thể giúp cải thiện chất lượng nghiên cứu, nhưng vẫn cần nhiều thời gian và nguồn lực.

III. Phương pháp nghiên cứu nấm Hyphomycetes hiệu quả

Để nghiên cứu đa dạng sinh học của nấm Hyphomycetes, cần áp dụng các phương pháp hiện đại và hiệu quả. Việc sử dụng các kỹ thuật phân lập mới và phân tích gen sẽ giúp phát hiện và phân loại các loài nấm một cách chính xác hơn. Các phương pháp này không chỉ giúp nâng cao chất lượng nghiên cứu mà còn tạo ra cơ sở dữ liệu quý giá cho các nghiên cứu sau này.

3.1. Phương pháp phân lập nấm từ lá cây mục

Phương pháp phân lập nấm từ lá cây mục bao gồm việc thu thập mẫu lá rụng và sử dụng các kỹ thuật nuôi cấy để tách biệt các chủng nấm. Việc này giúp phát hiện được nhiều loài nấm mới và chưa được mô tả.

3.2. Phân tích gen để xác định loài

Sử dụng phân tích gen, đặc biệt là trình tự ADN riboxom, giúp xác định chính xác các loài nấm. Phương pháp này cho phép phát hiện các loài nấm mới và cung cấp thông tin về mối quan hệ tiến hóa giữa các loài.

IV. Ứng dụng thực tiễn của nấm Hyphomycetes trong bảo vệ môi trường

Nấm Hyphomycetes không chỉ có giá trị trong nghiên cứu mà còn có nhiều ứng dụng thực tiễn. Chúng có thể được sử dụng trong xử lý rác thải, sản xuất enzyme và thậm chí trong y học. Việc khai thác và ứng dụng các loài nấm này có thể giúp cải thiện chất lượng môi trường và phát triển bền vững.

4.1. Ứng dụng trong xử lý rác thải

Nấm có khả năng phân hủy các chất hữu cơ trong rác thải, giúp giảm thiểu ô nhiễm môi trường. Việc sử dụng nấm trong xử lý rác thải có thể là một giải pháp hiệu quả và bền vững.

4.2. Sản xuất enzyme từ nấm

Nấm Hyphomycetes có khả năng sản xuất nhiều loại enzyme có giá trị, như cellulase và xylanase. Các enzyme này có thể được ứng dụng trong công nghiệp chế biến thực phẩm và sản xuất giấy.

V. Kết luận và triển vọng nghiên cứu nấm Hyphomycetes

Nghiên cứu về đa dạng sinh học của nấm Hyphomycetes từ lá cây mục ở các rừng quốc gia Việt Nam là một lĩnh vực đầy tiềm năng. Việc phát hiện và bảo tồn các loài nấm này không chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn có giá trị thực tiễn cao. Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc phát triển các phương pháp nghiên cứu mới và khai thác tiềm năng ứng dụng của nấm trong bảo vệ môi trường.

5.1. Tương lai của nghiên cứu nấm ở Việt Nam

Nghiên cứu về nấm ở Việt Nam cần được đẩy mạnh hơn nữa, đặc biệt là trong việc phát hiện các loài mới và ứng dụng chúng trong thực tiễn. Việc xây dựng cơ sở dữ liệu về nấm sẽ là nền tảng cho các nghiên cứu tiếp theo.

5.2. Đề xuất hướng nghiên cứu tiếp theo

Các nghiên cứu tiếp theo nên tập trung vào việc ứng dụng công nghệ sinh học trong nghiên cứu nấm, cũng như phát triển các sản phẩm từ nấm có giá trị kinh tế cao. Điều này không chỉ giúp bảo tồn đa dạng sinh học mà còn thúc đẩy phát triển kinh tế bền vững.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Vi nấm Hyphomycetes là nhóm nấm mang các cấu trúc sinh bào tử trần (cuống sinh bào tử, tế bào sinh bào tử và bào tử) trên môi trường nuôi cấy mà không hình thành thể quả. Trong hệ sinh thái rừng, nhóm vi nấm tồn tại trong lớp lá cây mục (litter fungi) giữ vai trò chủ đạo trong việc phân hủy sinh khối thực vật thông qua việc tiết ra các hệ enzyme ngoại bào như cellulase, xylanase, laccase, peroxidase, protease, amylase và lipase. Nhờ vào hoạt tính enzyme này, nấm lá mục đóng góp tới 90% quá trình hô hấp của vi sinh vật đất, tham gia trực tiếp vào chu trình tuần hoàn các nguyên tố carbon, nitơ, phospho và chuyển hóa chất hữu cơ trong đất rừng. Đồng thời, nhóm nấm này sở hữu tiềm năng ứng dụng lớn trong các ngành công nghiệp chế biến thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, sản xuất cồn sinh học, công nghiệp giấy, chất tẩy rửa, xử lý chất thải sinh hoạt - nông nghiệp, sản xuất dược phẩm (chất hạ cholesterol statins) và chế phẩm sinh học kiểm soát sâu bệnh hại.

Ước tính trên thế giới có từ 1,5 đến 1,5 triệu loài nấm, tuy nhiên đến năm 2008 mới chỉ có khoảng 100.000 loài được định tên khoa học. Nhiều quốc gia đã tiến hành các đợt điều tra diện rộng như Trung Quốc ghi nhận trên 40.000 loài, Nhật Bản ghi nhận trên 12.000 loài. Tại Việt Nam, với thảm thực vật phong phú trải dài trên nhiều vĩ độ và khí hậu nhiệt đới gió mùa ẩm, số loài nấm ước tính có thể lên đến 72.000 loài (gấp 6 lần số loài thực vật bậc cao), nhưng đến thời điểm nghiên cứu mới chỉ có khoảng 2.900 loài được lập danh lục, trong đó nhóm vi nấm có khoảng 400 chi và 450-650 loài được công bố. Điều này đồng nghĩa với việc hơn 90% nguồn tài nguyên vi nấm tại Việt Nam chưa được định danh. Trước đây, các nghiên cứu vi nấm ở Việt Nam chủ yếu tập trung vào mẫu đất, không khí môi trường khô hạn, thực phẩm hoặc hệ sinh thái rừng ngập mặn. Chưa có bất kỳ công trình nào nghiên cứu một cách hệ thống về tính đa dạng sinh học của nhóm nấm Hyphomycetes phân lập từ lá cây mục tại các hệ sinh thái rừng nhiệt đới của Việt Nam.

Câu hỏi và mục tiêu nghiên cứu

Để giải quyết khoảng trống nghiên cứu nêu trên, luận án đặt ra câu hỏi nghiên cứu cốt lõi: Sự khác nhau về đa dạng sinh học các loài vi nấm nằm trong lớp lá rụng giữa các vùng miền sinh thái tại Việt Nam biểu hiện như thế nào?

Trên cơ sở đó, luận án xác định 3 mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

1. Có được các dữ liệu về tính đa dạng sinh học của khu hệ nấm Hyphomycetes phân lập từ lá cây mục ở 4 rừng Quốc gia Việt Nam. Phát hiện các chi, loài mới lần đầu được ghi nhận ở Việt Nam và phát hiện các chi, loài mới cho khoa học.
2. Bảo tồn nguồn gen của khu hệ nấm Hyphomycetes phân lập từ lá cây mục thu thập ở các Rừng Quốc gia Việt Nam.
3. Đánh giá hoạt tính enzyme phân giải lignocellulose của các chủng lựa chọn bảo quản.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu: Các chủng vi nấm thuộc nhóm nấm Hyphomycetes (litter fungi) được phân lập từ các mẫu lá cây rụng mục nát trong thảm mục rừng.
• Phạm vi không gian: 4 Vườn/Rừng Quốc gia (RQG) đại diện cho các vùng địa lý sinh thái đặc trưng từ Bắc vào Nam của Việt Nam:
  • RQG Ba Bể (Bắc Kạn): Đại diện vùng núi đá vôi Đông Bắc Bộ.
  • RQG Bạch Mã (Thừa Thiên Huế): Đại diện vùng chuyển tiếp khí hậu Bắc - Nam tại miền Trung.
  • RQG Mã Đà (Đồng Nai): Đại diện vùng rừng nhiệt đới ẩm bán rụng lá Đông Nam Bộ.
  • RQG Phú Quốc (Kiên Giang): Đại diện hệ sinh thái rừng nhiệt đới hải đảo vùng Tây Nam.
• Phạm vi thời gian và mẫu vật: Tổng số 57 mẫu lá cây mục được thu thập thực địa qua các đợt khảo sát từ năm 2005 đến năm 2011 (Bạch Mã: tháng 11/2005; Ba Bể: tháng 10/2009; Mã Đà: tháng 11/2011; Phú Quốc: năm 2011). Các mẫu lá rụng sau khi thu thập được bảo quản ở nhiệt độ phòng và tiến hành xử lý phân lập trong vòng 10 ngày.

Thông số địa lý và môi trường	RQG Ba Bể	RQG Bạch Mã	RQG Mã Đà	RQG Phú Quốc
Diện tích (ha)	7.610	37.487	969.993	31.422
Tọa độ vĩ bắc	23°32′1″ – 25°05′	16°11′ – 16°15′	11°20′0″ – 11°20′0″	10°12′ – 10°27′
Tọa độ kinh đông	105°37′0,07″ – 105°37′55,8″	107°37′04,7″ – 107°52′11,1″	107°0′58″ – 107°1′18″	103°50′ – 104°04′
Nhiệt độ trung bình năm (°C)	22	25	28 – 30	25 – 27
Lượng mưa trung bình năm (mm)	1.378	3.440	2.300	3.000 – 4.000
Độ ẩm tương đối trung bình (%)	83,3	85	80 – 82	85 – 90
Số lượng mẫu lá thu thập	17	15	11	14

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước đây

Luận án đã tổng hợp hệ thống y văn quốc tế và trong nước trên các nhánh nghiên cứu chính:

1. Tiến hóa và phân loại học nấm: Berbee và Taylor (1994) sử dụng dữ liệu thời gian địa lý và mức độ thay thế nucleotit của gen ADNr 18S để ước tính các mốc phân nhánh tiến hóa (ngành Zygomycota, Ascomycota và Basidiomycota tách khỏi Chytridiomycota khoảng 550 triệu năm trước; Ascomycota và Basidiomycota phân tách khoảng 400 triệu năm trước). Hughes (1953) đặt nền móng phân loại nấm bất toàn dựa trên cơ chế phát sinh bào tử trần. Lutzoni và cộng sự (2004) tổng hợp 560 công trình, sử dụng 5 vùng gen phổ biến (18S, 28S, mitSSU, RPB2, ITS) để tái cấu trúc cây chủng loại phát sinh giới Nấm. Schoch và cộng sự (2009) phân tích đa gen chia nhóm nấm Hyphomycetes thành 8 lớp lớn thuộc ngành Ascomycota (Pezizomycetes, Orbiliomycetes, Arthoniomycetes, Dothideomycetes, Eurotiomycetes, Lecanoromycetes, Leotiomycetes, Sordariomycetes).
2. Phương pháp phân loại hình thái và chỉ thị phân tử: Seifert và cộng sự (2011) chuẩn hóa các tiêu chí hình thái học vi nấm. Khái niệm mã vạch ADN (ADN barcoding) được Hebert và cộng sự (2003) đề xuất; các tác giả Begerow (2010), Hibbett (2007), Kurtzman và Robnett (1997, 1998) khẳng định vai trò của đoạn D1/D2 trên gen 28S ADNr và vùng ITS trong định loại đến cấp độ loài ở nấm sợi và nấm men.
3. Nghiên cứu vi nấm hoại sinh trên xác thực vật:
   • Tại Trung Quốc: Zhou và Hyde (2002) nghiên cứu 1.320 mẫu lá tre mục tại Tai Po Kau ghi nhận 57 loài nấm (chi Anthostomella luôn hiện diện); Song và cộng sự (2004) tìm thấy 56 loài Hyphomycetes tại núi Zijin với ưu thế thuộc Alternaria và Trichoderma; Fan và cộng sự (2011) dùng kỹ thuật PCR-DGGE phát hiện 21 chủng trên lá thông; Hu (2013) tổng kết 969 loài nấm phân hủy xác thực vật tại Trung Quốc (gồm 416 loài Hyphomycetes nước ngọt).
   • Tại Ấn Độ: Maria và cộng sự (2002) phát hiện 78 loài từ 1.067 mẫu gỗ mục rừng đước; Kumar và cộng sự (2013) ghi nhận 45 loài thuộc 22 chi trên lá tre rụng, trong đó Aspergillus và Trichoderma chiếm ưu thế; Seephueak và cộng sự (2011) xác định 400 loài Hyphomycetes trên cành cao su mục.
   • Tại Thái Lan: Tổ chức BIOTEC Thái Lan (2012) công bố hơn 200 loài nấm lá rụng với 14 loài mới; Kodsueb và cộng sự (2008), Pinruan và cộng sự (2007) khảo sát sâu về nấm trên gỗ mục và lá rụng nhiệt đới.
   • Tại Nhật Bản: Tokumasu (2002) phân lập 122 loài từ 22 mẫu lá rụng qua 16 năm nghiên cứu bằng phương pháp rửa bề mặt; Osono và Takashi (2011) chứng minh thành phần vi nấm thay đổi rõ rệt tùy theo phương pháp phân lập (phương pháp rửa bề mặt thu được Beltraniella, Cylindrocladium, Gliocephalotrichum; phương pháp khử trùng bề mặt thu được Xylariaceae, Trichoderma, Penicillium).
   • Tại các quốc gia khác: Paulus và cộng sự (2006) tìm thấy 185 loài nấm nhỏ trên lá rụng rừng mưa nhiệt đới Úc; Przybył và cộng sự (2007) phân lập 55 loài vi nấm từ 2.330 mẫu lá vân sam (Picea abies) tại Ba Lan.
4. Nghiên cứu nấm sinh enzyme phân giải sinh khối: Các nghiên cứu của Wood (1988), Eriksson và cộng sự (1990), Sanchez (2009), Pointing (2001) chỉ ra các chi nấm sợi như Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Phanerochaete là nguồn sinh enzyme cellulase, xylanase và laccase chủ yếu phục vụ chuyển hóa lignocellulose.

Khoảng trống luận án lựa chọn giải quyết

Luận án giải quyết khoảng trống học thuật về sự thiếu vắng dữ liệu điều tra mang tính hệ thống đối với vi nấm Hyphomycetes trên lá rụng tại Việt Nam. Công trình áp dụng kết hợp phương pháp phân lập vi thao tác tách bào tử đơn độc và phương pháp rửa bề mặt, liên kết quan sát hình thái chi tiết với phân tích trình tự phân tử gen 18S và 28S D1/D2 ADNr, đồng thời đánh giá hoạt tính enzyme phân giải lignocellulose nhằm tạo nguồn giống chuẩn cho lưu trữ và ứng dụng.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

• Phân loại nấm: Giới Nấm thật (Eumycota) gồm 5 ngành: Chytridiomycota, Zygomycota, Glomeromycota, Ascomycota, Basidiomycota và nhóm Nấm bất toàn (Mitosporic fungi / Deuteromycota gồm Blastomycetes, Coelomycetes, Hyphomycetes). Nhóm Hyphomycetes gồm các nấm sợi sinh bào tử trần trực tiếp từ cuống sinh bào tử mà không có thể quả.
• Tiêu chuẩn hình thái học: Phân tích đặc điểm khuẩn lạc (dạng mặt, màu sắc, gờ mép, sắc tố, giọt tiết, bó sợi/synnemata, đệm nấm/stroma, hạch nấm/sclerotia); Cấu trúc vách ngăn sợi nấm (vách ngăn đơn kèm thể Woronin ở Ascomycota; vách ngăn Dolipore kèm màng phồng Parenthesome ở Basidiomycota); Kiểu cuống sinh bào tử (6 kiểu chính); Hình dạng bào tử (10 nhóm: Ameroconidia, Didymoconidia, Phragmoconidia, Dictyoconidia, Bulbils, Clathrate, bào tử xoắn, Stauroconidia, Cheiroid conidia, Scolecoconidia); Cơ chế phát sinh bào tử (ontogeny: nảy chồi hướng gốc basipetal dạng thể bình phialidic, annellidic, retrogressive; nảy chồi hướng ngọn acropetal tạo ramoconidia; kiểu tản thallic); Cơ chế giải phóng bào tử (schizolytic và rhexolytic).
• Phân loại sinh học phân tử: Cấu trúc đơn vị phiên mã ADNr gồm các gen bảo thủ 18S rRNA (SSU), 5.8S rRNA, 28S rRNA (LSU đoạn D1/D2) xen kẽ vùng không mã hóa ITS1, ITS2, IGS/ETS. Định danh và xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên ma trận khoảng cách nucleotit, phần mềm BLAST search trên NCBI GenBank, CBS và Mycobank với ngưỡng tương đồng loài 98%.

Phương pháp nghiên cứu thực tế

• Phương pháp phân lập:
  1. Phương pháp rửa bề mặt (washing method): Mảnh lá cây mục được rửa bằng nước cất vô trùng kết hợp chất hoạt động bề mặt Aerosol OT (di-iso-octyl sodium sulfosuccinate) và cồn 70°, để khô tự nhiên rồi đặt lên môi trường thạch dinh dưỡng thấp (LCA, CMA, PCA, OA, MEA, PDA).
  2. Phương pháp tách bào tử đơn độc (single spore isolation): Sử dụng bộ vi thao tác Skarmen (Skarmen micromanipulator) lắp trên kính hiển vi quang học, dùng kim nhọn thủy tinh gắp trực tiếp từng bào tử riêng lẻ có hình thái đặc thù từ bề mặt lá đặt sang đĩa thạch tinh khiết.
• Phương pháp quan sát hình thái:
  • Quan sát khuẩn lạc và cấu trúc sinh sản dưới kính hiển vi quang học phản pha Normarski.
  • Quan sát siêu cấu trúc bề mặt cơ quan sinh bào tử dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM).
  • Nhuộm huỳnh quang xác định số lượng nhân trong từng tế bào bào tử dưới kính hiển vi huỳnh quang.
• Phương pháp sinh học phân tử:
  • Tách chiết ADN tổng số từ sinh khối nấm nuôi cấy 7-14 ngày.
  • Khuếch đại PCR các vùng gen ADNr 18S hoặc 28S đoạn D1/D2 bằng cặp mồi chuyên biệt.
  • Giải trình tự sản phẩm PCR, xử lý dữ liệu và xây dựng cây chủng loại phát sinh (Phylogram) bằng thuật toán Neighbor-Joining hoặc Maximum Parsimony với giá trị Bootstrap kiểm định.
• Phương pháp phân tích chỉ số sinh thái học:
  • Tần suất xuất hiện (TSXH %): $TSXH = \frac{\text{Số mẫu xuất hiện loài}}{\text{Tổng số mẫu nghiên cứu}} \times 100$
  • Chỉ số đa dạng sinh học Shannon-Wiener ($H'$): $H' = -\sum (P_i \ln P_i)$ (với $P_i$ là tỷ lệ cá thể của loài $i$).
  • Chỉ số mức độ chiếm ưu thế Simpson ($Cd$): $Cd = \sum (P_i)^2$
  • Chỉ số tương đồng Sorensen ($SI$): $SI = \frac{2C}{A + B} \times 100%$ (với $A, B$ là số loài của từng khu vực; $C$ là số loài chung).
• Phương pháp sàng lọc hoạt tính enzyme:
  • Enzyme phân giải cellulose (CMC) và xylan: Nuôi cấy trên môi trường thạch chứa Carboxymethyl cellulose 1% hoặc xylan 1%, đánh giá đường kính vòng phân giải hoặc định lượng hàm lượng đường khử giải phóng bằng thuốc thử axit 3,5-dinitrosalicylic (DNS).
  • Enzyme phân giải lignin: Thử nghiệm định tính hoạt tính enzyme laccase ngoại bào bằng phản ứng oxy hóa đổi màu đặc hiệu với cơ chất Syringaldazine (SGZ); phát hiện Mangan peroxidase (MnP) và Lignin peroxidase (LiP).

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Tổng quan tài liệu

Chương này tổng kết toàn diện cơ sở lý luận về phân loại học nấm học và vi nấm Hyphomycetes. Tác giả hệ thống hóa các tiêu chí hình thái học từ cấu trúc sợi nấm, vách ngăn có thể Woronin hay cấu trúc Dolipore, 6 kiểu cuống sinh bào tử và 10 dạng bào tử cơ bản. Chương 1 phân tích sâu về cơ chế phát sinh bào tử trần (nảy chồi hướng gốc basipetal, hướng ngọn acropetal, dạng tản thallic) và phương thức tách rời bào tử (schizolytic tạo rốn hilum, rhexolytic làm vỡ vách ngăn).

Chương 1 cũng làm rõ cơ sở sinh học phân tử trong nấm học, nhấn mạnh vai trò của các vùng chỉ thị ADNr 18S, 28S D1/D2 và ITS trong mã vạch ADN (ADN barcoding). Hệ thống phân loại phát sinh chủng loại đa gen của Schoch và cộng sự (2009) được trình bày chi tiết với cấu trúc 8 lớp của Hyphomycetes. Tác giả điểm luận các công trình nghiên cứu vi nấm trên xác thực vật tại châu Á (Trung Quốc, Ấn Độ, Thái Lan, Nhật Bản) và các khu vực khác (Úc, Ba Lan, Costa Rica, Mexico), đồng thời tổng hợp các kết quả nghiên cứu nấm tại Việt Nam để chỉ ra khoảng trống về nhóm nấm lá cây mục. Cuối cùng, chương 1 tổng hợp đặc tính hóa sinh của các hệ enzyme phân giải lignocellulose từ nấm sợi (cellulase, xylanase bền trong dải pH 4,0-9,0 và nhiệt độ 50-60°C; laccase oxy hóa vòng thơm).

Chương 2. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết vật liệu nghiên cứu gồm 57 mẫu lá cây rụng thu thập tại 4 rừng Quốc gia (Ba Bể: 17 mẫu, Bạch Mã: 15 mẫu, Mã Đà: 11 mẫu, Phú Quốc: 14 mẫu). Tác giả cung cấp bảng danh mục chi tiết từng mẫu lá kèm theo tọa độ GPS chính xác (kinh độ, vĩ độ), độ cao địa hình, nhiệt độ và độ ẩm không khí đo tại thời điểm thu mẫu.

Chương 2 trình bày chi tiết quy trình thao tác kỹ thuật:

• Chuẩn bị các môi trường dinh dưỡng thấp để ức chế khuẩn lạc phát triển quá nhanh và kích thích sinh bào tử (LCA, PCA, CMA, OA, MEA, PDA).
• Quy trình phân lập kép bằng phương pháp rửa bề mặt với chất khử trùng Aerosol OT và kỹ thuật tách bào tử đơn độc bằng bộ vi thao tác Skarmen dưới kính hiển vi.
• Quy trình quan sát hình thái chi tiết qua kính hiển vi quang học phân pha Normarski, kính hiển vi huỳnh quang và kính hiển vi điện tử quét SEM.
• Quy trình chuẩn tách chiết ADN, phản ứng PCR nhân đoạn gen ADNr 18S và 28S D1/D2, giải trình tự Sanger và phương pháp đối chiếu Blast Search, dựng cây phả hệ với phần mềm phân tích sinh học phân tử.
• Các công thức toán học tính toán chỉ số tần suất xuất hiện (TSXH), chỉ số đa dạng Shannon-Wiener ($H'$), chỉ số ưu thế Simpson ($Cd$) và chỉ số tương đồng Sorensen ($SI$).
• Quy trình thử nghiệm hoạt tính enzyme phân giải CMC, xylan bằng phương pháp đo quang với thuốc thử DNS và phản ứng sinh màu với cơ chất Syringaldazine để phát hiện laccase.

Chương 3. Kết quả và thảo luận

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được từ 57 mẫu lá mục thu thập:

1. Số lượng và cơ cấu thành phần loài vi nấm: Từ 57 mẫu lá cây mục của 4 RQG, tác giả đã phân lập và lưu giữ thành công 243 chủng vi nấm. Cấu trúc phân loại học của toàn bộ khu hệ gồm 5 Lớp, 13 Bộ, 26 Họ, 79 Chi và 176 Loài vi nấm.
2. Đa dạng vi nấm tại 4 vùng sinh thái:
   • RQG Ba Bể (17 mẫu): Phân lập được các loài thích nghi vùng núi cao phía Bắc, có sự hiện diện phong phú của các chi hoại sinh điển hình.
   • RQG Bạch Mã (15 mẫu): Nằm ở dải chuyển tiếp khí hậu miền Trung với lượng mưa rất lớn (3.440 mm/năm), ghi nhận độ đa dạng loài cao và nhiều dạng hình thái bào tử phức tạp.
   • RQG Mã Đà (11 mẫu): Đặc trưng cho rừng nhiệt đới ẩm Đông Nam Bộ, ghi nhận mật độ phân lập cao của các chủng nấm sợi sinh enzyme mạnh.
   • RQG Phú Quốc (14 mẫu): Hệ sinh thái rừng nhiệt đới hải đảo biệt lập mang tính đặc hữu cao, là nơi phát hiện phần lớn các taxon mới cho khoa học.
3. Hiệu quả của các phương pháp phân lập: Phương pháp rửa bề mặt giúp thu thập các chủng vi nấm hoại sinh phát triển nhanh và phổ biến; trong khi phương pháp tách bào tử đơn độc bằng bộ vi thao tác Skarmen phát huy hiệu quả cao trong việc thu bắt các loài nấm hiếm, có cấu trúc bào tử phân nhánh đặc biệt (stauroconidia, cheiroid conidia) khó mọc khi cấy gạt thông thường.
4. Phân tích các chỉ số sinh thái và mức độ tương đồng: Đánh giá định lượng qua chỉ số Shannon-Wiener ($H'$), chỉ số Simpson ($Cd$) và chỉ số Sorensen ($SI$) phản ánh sự phân hóa loài rõ rệt giữa các khu vực địa lý. Các chi chiếm ưu thế chung tại cả 4 RQG gồm Aspergillus, Penicillium, Trichoderma và Fusarium.

Phân loại bậc cao / Nhóm	Số lượng ghi nhận trong luận án
Tổng số chủng phân lập	243 chủng
Lớp (Class)	5 Lớp
Bộ (Order)	13 Bộ
Họ (Family)	26 Họ
Chi (Genus)	79 Chi
Loài (Species)	176 Loài
Taxon mới cho khoa học	2 Chi mới, 8 Loài mới

5. Mô tả hình thái các loài nấm ghi nhận lần đầu tại Việt Nam: Luận án tiến hành mô tả đặc điểm hình thái và vi học chi tiết cho 10 loài nấm Hyphomycetes lần đầu phân lập tại Việt Nam:
   • Polylobatispora quinquecornuta Matsush.
   • Isthmolongispora geniculata Tubaki, de Hoog & Hennebert (1983)
   • Isthmolongispora ampulliformis Tubaki, de Hoog & Hennebert (1983)
   • Isthmolongispora minima Tubaki, de Hoog & Hennebert (1983)
   • Ceratosporella ponapensis Matsush.
   • Radiatispora yunaensis Matsush.
   • Lateriramulispora ainflata Matsush.
   • Scolecobasidium tricladiatum Matsush.
   • Triglyphium alabamense Matsush.
   • Triramulispora obclavata Matsush.
6. Phát hiện các taxon mới cho khoa học:
   • Xác định 2 chi nấm mới, trong đó mô tả chi mới Hamatispora (loài điển hình Hamatispora phuquocensis - chủng VN11-F0045 phân lập tại Phú Quốc).
   • Mô tả chi tiết các loài nấm mới cho khoa học dựa trên hình thái bào tử kết hợp phân tích cây phát sinh chủng loại trình tự gen ADNr 28S đoạn D1/D2 và 18S:
     • Condylospora vietnamensis sp. nov. (chủng VN05-F0030)
     • Trisulcosporium phuquocense sp. nov. (chủng VN11-F0028)
     • Trisulcosporium exiguum sp. nov. (chủng VN11-F0029)
     • Polylobatispora ambigua sp. nov. (chủng VN05-F0031)
     • Isthmolongispora phuquocensis sp. nov.
     • Cùng các chủng mới khác như VN11-F0004 và VN11-F0025 thuộc phân ngành Pucciniomycotina.
7. Khả năng sinh enzyme phân giải lignocellulose:
   • Hoạt tính phân giải cellulose và xylan: Tác giả xác định phần lớn các chủng thuộc các chi Trichoderma, Aspergillus, Penicillium và Fusarium có khả năng sinh enzyme thủy phân carboxymethyl cellulose (CMC) và xylan mạnh, tạo vòng phân giải lớn trên môi trường thử nghiệm.
   • Hoạt tính phân giải lignin: Phản ứng oxy hóa cơ chất Syringaldazine xác định nhiều chủng nấm có hoạt tính laccase cao, cho thấy tiềm năng ứng dụng trực tiếp trong xử lý phế phẩm chứa lignin.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt lý luận và khoa học

• Nghiên cứu hệ thống đầu tiên: Đây là công trình đầu tiên tại Việt Nam điều tra một cách có hệ thống về tính đa dạng sinh học của nhóm nấm Hyphomycetes phân lập từ lá cây mục ở 4 Vườn/Rừng Quốc gia đại diện cho các vùng sinh thái (Ba Bể, Bạch Mã, Mã Đà, Phú Quốc).
• Áp dụng kỹ thuật phân lập chuyên biệt: Lần đầu tiên đưa vào áp dụng thành công hai kỹ thuật phân lập chuyên sâu trong nghiên cứu đa dạng vi nấm tại Việt Nam: phương pháp rửa bề mặt bằng chất hoạt động bề mặt Aerosol OT và phương pháp tách bào tử đơn độc bằng bộ vi thao tác Skarmen.
• Xây dựng bức tranh phân loại học hoàn chỉnh: Luận án đã xác lập danh mục phân loại chi tiết gồm 243 chủng vi nấm thuộc 5 Lớp, 13 Bộ, 26 Họ, 79 Chi và 176 Loài.
• Bổ sung các taxon mới cho khoa học và danh lục quốc gia: Phát hiện và mô tả 2 chi mới cùng 8 loài mới cho khoa học; bổ sung nhiều loài nấm Hyphomycetes lần đầu tiên được ghi nhận có mặt trong khu hệ vi nấm Việt Nam.

Đóng góp mới về mặt thực tiễn và ứng dụng

• Bảo tồn nguồn gen vi sinh vật: Toàn bộ 243 chủng vi nấm phân lập được lưu giữ, bảo quản nguyên vẹn tại Bảo tàng Giống chuẩn Vi sinh vật (VTCC) – Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội. Nguồn gen này cung cấp các chủng chuẩn, chủng tham chiếu phục vụ nghiên cứu nấm học trong nước và quốc tế.
• Cơ sở dữ liệu sàng lọc enzyme: Kết quả đánh giá hoạt tính enzyme phân giải CMC, xylan và lignin cung cấp bộ số liệu thực nghiệm quan trọng, định hướng việc khai thác các chủng nấm sợi thuộc chi Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Fusarium vào công nghệ xử lý sinh khối thực vật, sản xuất cồn sinh học và xử lý ô nhiễm môi trường.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

• Tiếp tục mở rộng phạm vi thu thập mẫu lá mục tại các vườn quốc gia và khu bảo tồn thiên nhiên khác thuộc các đới sinh thái đặc thù như Tây Bắc, Tây Nguyên và Đồng bằng sông Cửu Long.
• Đẩy mạnh nghiên cứu sâu về các chủng nấm thuộc taxon mới bằng kỹ thuật phân tích trình tự đa gen (multilocus sequence analysis) nhằm làm sáng tỏ vị trí tiến hóa chính xác.
• Triển khai nghiên cứu tinh sạch, tối ưu hóa điều kiện lên men và phân tích đặc tính hóa sinh của các enzyme cellulase, xylanase và laccase từ các chủng nấm triển vọng đã được định danh.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của đề tài

• Số lượng mẫu và địa điểm khảo sát: Khảo sát được thực hiện trên 57 mẫu lá rụng tại 4 Rừng Quốc gia; quy mô này còn khiêm tốn so với độ che phủ và tính đa dạng phong phú của các hệ sinh thái rừng trên toàn lãnh thổ Việt Nam.
• Thời điểm lấy mẫu: Các đợt thu mẫu tiến hành theo từng thời điểm riêng biệt (năm 2005, 2009, 2011), chưa theo dõi biến động thành phần loài vi nấm theo chu kỳ các mùa trong năm tại cùng một địa điểm.
• Mức độ đánh giá enzyme: Hoạt tính phân giải lignocellulose mới dừng lại ở bước sàng lọc định tính và bán định lượng trên môi trường nuôi cấy thạch đĩa, chưa tiến hành tinh sạch enzyme và xác định cấu trúc phân tử của protein.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

• Thiết lập các nghiên cứu theo dõi định kỳ diễn thế quần xã vi nấm trong các giai đoạn phân hủy khác nhau của lá cây mục.
• Ứng dụng công nghệ giải trình tự thế hệ mới (Metagenomics) trực tiếp từ thảm mục rừng để phát hiện các loài vi nấm chưa thể nuôi cấy nhân tạo.
• Khai thác tiềm năng tổng hợp các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học (chất kháng sinh, chất ức chế sinh học) từ các chủng nấm thuộc chi và loài mới phát hiện.

---

Giá trị tham khảo

Đối tượng thụ hưởng và giá trị học thuật

• Nghiên cứu sinh và học viên chuyên ngành Vi sinh vật học, Sinh thái học, Nấm học: Bản luận án là tài liệu tham khảo giá trị về phương pháp luận nghiên cứu phân loại nấm sợi, cung cấp các mô tả hình thái học chi tiết, ảnh chụp kính hiển vi quang học, kính hiển vi điện tử quét SEM và sơ đồ phân tích cây chủng loại phát sinh phân tử.
• Giảng viên và nhà nghiên cứu công nghệ sinh học: Cung cấp quy trình chuẩn trong việc phân lập vi thao tác Skarmen, kỹ thuật giữ giống nấm sợi và phương pháp đánh giá hoạt tính enzyme ngoại bào phân giải polysaccharide thực vật.
• Cơ quan quản lý tài nguyên và bảo tồn sinh học: Cung cấp dữ liệu khoa học tin cậy về đa dạng sinh học vi sinh vật rừng, phục vụ công tác xây dựng báo cáo đa dạng sinh học quốc gia và lưu trữ nguồn gen tại các bảo tàng giống chuẩn.

Các nội dung đáng tham khảo nhất

• Chương 2 với quy trình chi tiết về kỹ thuật tách bào tử đơn độc bằng bộ vi thao tác Skarmen.
• Chương 3 với hệ thống khóa định loại hình thái, hình vẽ, ảnh chụp hiển vi điện tử và các phân tích so sánh trình tự gen 18S, 28S D1/D2 của các loài mới (Hamatispora phuquocensis, Condylospora vietnamensis, Trisulcosporium phuquocense, Polylobatispora ambigua).
• Bảng tổng hợp số liệu về khả năng sinh enzyme phân giải cellulose, xylan và lignin của các chủng nấm sợi phục vụ sàng lọc ứng dụng.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án đã thu thập bao nhiêu mẫu lá và phân lập được tổng cộng bao nhiêu chủng vi nấm?

Luận án đã thu thập 57 mẫu lá cây mục từ 4 Rừng Quốc gia (Ba Bể: 17 mẫu, Bạch Mã: 15 mẫu, Mã Đà: 11 mẫu, Phú Quốc: 14 mẫu). Từ 57 mẫu lá này, tác giả đã phân lập và bảo quản thành công 243 chủng vi nấm, phân loại vào 5 Lớp, 13 Bộ, 26 Họ, 79 Chi và 176 Loài.

2. Kỹ thuật phân lập nào đã giúp luận án phát hiện được các loài vi nấm hiếm và bào tử có cấu trúc đặc biệt?

Luận án sử dụng kết hợp hai kỹ thuật phân lập: phương pháp rửa bề mặt lá bằng chất hoạt động bề mặt Aerosol OT (loại bỏ nấm đất tạp nhiễm) và phương pháp tách bào tử đơn độc bằng bộ vi thao tác Skarmen (Skarmen micromanipulator). Kỹ thuật vi thao tác cho phép dùng kim nhọn thủy tinh gắp trực tiếp từng bào tử riêng lẻ có hình thái phân nhánh phức tạp (dạng sao, dạng ngón tay) dưới kính hiển vi để cấy thuần khiết.

3. Những đơn vị phân loại mới nào cho khoa học đã được phát hiện trong luận án?

Luận án phát hiện 2 chi mới (gồm chi Hamatispora với loài điển hình Hamatispora phuquocensis) và 8 loài mới cho khoa học (trong đó mô tả chi tiết các loài: Condylospora vietnamensis, Trisulcosporium phuquocense, Trisulcosporium exiguum, Polylobatispora ambigua, Isthmolongispora phuquocensis và các chủng mới thuộc phân ngành Pucciniomycotina).

4. Những đoạn gen nào trong vùng ADN riboxom được sử dụng để định danh và phân tích phát sinh chủng loại?

Luận án sử dụng đoạn gen 18S ADNr (SSU) để phân tích quan hệ họ hàng ở các bậc phân loại cao (cấp lớp, bộ, ngành phụ) và đoạn D1/D2 của gen 28S ADNr (LSU - chiều dài khoảng 600 bp) để so sánh, xác định mối quan hệ phát sinh chủng loại ở cấp độ chi và loài.

5. Các nhóm nấm nào chiếm ưu thế và thể hiện hoạt tính sinh enzyme phân giải lignocellulose cao nhất?

Bốn chi nấm chiếm ưu thế phổ biến tại cả 4 khu vực nghiên cứu là Aspergillus, Penicillium, Trichoderma và Fusarium. Đây cũng là những nhóm nấm thể hiện hoạt tính sinh enzyme ngoại bào phân giải CMC (carboxymethyl cellulose), xylan và oxy hóa cơ chất Syringaldazine (laccase phân giải lignin) cao nhất.

---

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Lê Thị Hoàng Yến là công trình nghiên cứu hệ thống về tính đa dạng sinh học của nhóm nấm Hyphomycetes phân lập từ lá cây mục tại 4 Rừng Quốc gia đặc trưng của Việt Nam. Bằng việc kết hợp phương pháp phân lập vi thao tác với định loại hình thái hiển vi điện tử và phân tích trình tự gen ADNr (18S, 28S D1/D2), luận án đã xác lập danh mục 243 chủng vi nấm thuộc 176 loài, phát hiện 2 chi mới và 8 loài mới cho khoa học. Toàn bộ các chủng phân lập đã được lưu trữ bảo tồn nguồn gen tại Bảo tàng Giống chuẩn Vi sinh vật (VTCC) và sàng lọc hoạt tính enzyme phân giải lignocellulose, tạo cơ sở dữ liệu học thuật vững chắc cho các nghiên cứu nấm học và phát triển ứng dụng công nghệ sinh học xử lý sinh khối thực vật.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Vi nấm Hyphomycetes là nhóm nấm mang các cấu trúc sinh bào tử trần (cuống sinh bào tử, tế bào sinh bào tử và bào tử) trên môi trường nuôi cấy, mà không sinh thể quả. Chúng có thể tồn tại trong mọi hệ sinh thái: đất, nước, khí, phân, trong các vật chất hữu cơ và các loại mô thực vật,. Vi nấm tồn tại trong lớp lá rụng trong rừng đóng vai trò quan trọng trong quá trình phân hủy sinh khối thực vật, nhờ vào khả năng sinh ra các enzyme ngoại bào của chúng [49,71,113]. Vì vậy, các loài nấm này có khả năng ứng dụng cao trong các ngành chế biến thực phẩm và thức ăn chăn nuôi, trong xử lý nước thải, rác thải nông nghiệp, rác thải sinh hoạt, trong công nghiệp sản xuất cồn sinh học, sản xuất giấy và trong chất tẩy rửa vì chúng có thể sinh ra một số lượng lớn các enzyme như amylase, celullase, xylanse, protease, phytase, lipase.

Các enzyme này phần lớn được sản xuất bởi các chủng nấm sợi như: Aspergillus,Trichoderma, Penicilium,. Một số loài vi nấm còn được sử dụng trong sản xuất thuốc kháng sinh [46], sản xuất dược phẩm, chẳng hạn sản xuất statins- chất có khả năng làm giảm cholesterol từ nấm sợi [107] và trong kiểm soát sinh học (sản xuất độc tố mycotoxin Beauvericin từ nấm Beauveria bassiana) [49],.Ngoàira, vinấmcòncóvaitròthamgiavàovòngtuầnhoànvậtchấtnhư C,N, P vàkiểmsoát ô nhiễmmôitrường [45, 58, 63].Do thấyvaitròvàứngdụngnhiềumặtcủanấmđốivớiđờisống, cácnhàkhoahọcngàycàngquantâmđếnnghiêncứuđadạngnấmvớimụctiêutìmkiếmpháth iệncáchoạtchấtmớicógiátrịtừcác taxon mới. Người ta cho rằng trong tự nhiên có khoảng 1.000 loài nấm [38; 68], nhưng đến năm 2008 mới định tên được khoảng 10.000 loài, trong đóAscomycota có khoảng 6.500 loài; Basidiomycota có khoảng 31.500 loài; Blastocladiomycota: 180 loài; Chytridiomycota: 710 loài; Glomeromycota: 170 loài; Microsporidia: trên 1.300 loài; Neocallimastigomycota: 20 loài [90]. Trung Quốc đã điều tra được 40.

Ở Nhật Bản đã tìm được 12. Nghiên cứu về đa dạng nấm ở Việt Nam chưa được coi trọng, đến nay 11 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] theo ước tính có khoảng 2.900 loài nấm ở Việt Nam đã được lập danh lục [8; 11], trong đó vi nấm có khoảng 400 chi, 450 loài được công bố [8; 9; 11; 12], con số này cũng còn khá khiêm tốn so với sự đa dạng vi nấm ở Việt Nam. Việt Nam là một nước có khí hậu nóng ẩm, vị trí địa lý kéo dài từ Bắc vào Nam, với sự đa dạng lớn về các vùng sinh thái đặc hữu, có nhiều rừng núi, nằm rải rác từ Bắc tới Nam ( từ 8°27′ - 23°23′ vĩ tuyến bắc) với các kiểu rừng khác nhau do sự khác nhau về địa lý và thành phần thực vật. Rừng Quốc gia Ba Bể (22o22’ vĩ bắc và 105o36’ kinh đông), BạchMã (16o05’ vĩ bắc và 107o50’ kinh đông) và Mã Đà (11o13’ vĩ bắc và 107o5’ kinh đông) là 3 khu hệ sinh thái đặc trưng cho 3 vùng miền của đất nước.

Rừng Quốc gia Phú Quốc (10o12’- 10o27’vĩ bắc và 103o50’- 104o04’kinh đông) nằm trên đảo Phú Quốc, cách xa khỏi đất liền, nằm cách thị trấn Rạch Giá 120 Km và thị xã Hà Tiên 45 Km về phía Tây Nam, nhưng chỉ cách Campuchia có 3km. Các nghiên cứu về động, thực vật, côn trùng,. cho thấy cả 4 rừng này đều cóđặc điểm chung là đa dạng sinh học cao, nhiều loài động, thực vật sinh sống, có nhiều loài đặc hữu, quí hiếm và được ghi vào Sách Đỏ Việt Nam. Tuy nhiên cho đến nay chưa có một nghiên cứu nào được tiến hành mang tính hệ thống về đa dạng vi nấm tồn tại trong các khu hệ sinh thái rừng Việt Nam.

Sự khác nhau về đa dạng sinh học các loài vi nấm nằm trong lớp lá rụng giữa các vùng miền có gì khác nhau? Để trả lời được các câu hỏi trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài "Nghiên cứu tính đa dạng sinh học của nhóm nấm Hyphomycetes phân lập từ lá cây mục (litter fungi) ở các rừng Quốc gia Việt Nam " với các mục tiêu sau: - Có được các dữ liệu về tính đa dạng sinh học của khu hệ nấm Hyphomycetesphân lập từ lá cây mục ở 4 rừng Quốc gia Việt Nam. Phát hiện các chi, loài mới lần đầu được ghi nhận ở Việt Nam và phát hiện các chi, loài mới cho khoa học. - Bảo tồn nguồn gen của khu hệ nấm Hyphomycetesphân lập từ lá cây mục thu thập ở các Rừng Quốc gia Việt Nam. - Đánh giá hoạt tính enzyme phân giải lignocellulose của các chủng lựa chọn bảo quản.

12 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Đóng góp mới của luận án: - Đây là nghiên cứu đầu tiên có hệ thống về đa dạng vi nấm Hyphomycetes phân lập từ lá cây rụng ở 4 vườn Quốc gia Việt Nam(Ba Bể, Bạch Mã, Mã Đà và Phú Quốc), sử dụng hai kỹ thuật phân lập mới (phân lập nấm bằng phương pháp rửa bề mặt và phân lập nấm bằng phương pháp tách bào tử đơn độc) trong nghiên cứu đa dạng vi nấm tại Việt Nam. - Nghiên cứu đã đưa ra một bức tranh đa dạng về nhóm nấm Hyphomycetes ở Việt Nam, gồm 5 Lớp, 13 Bộ, 26 Họ, 79 Chi, 176 Loài vi nấm. - Đã phát hiện được một số taxon mới trong hệ thống phân loại nấm học: 2 chi mới và 8 loài mới. - Nghiên cứu đã chỉ ra rằng các chi: Aspergillus, Fusarium, Penicilliumvà Trichoderma vừa có tần suất xuất hiện cao lại vừa có khả năng sinh enzyme thủy phân thành phần lignocelluloza cao.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn: - Kết quả nghiên cứu của luận án đã làm giàu thêm đa dạng nguồn gen vi nấm cho Bảo tàng Giống chuẩn Vi sinh vật- Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học với 243 chủng vi nấm thuộc 5 Lớp, 13 Bộ, 26 Họ, 79 Chi, 176 Loài , trong đó có 02 chi mới, 08 loài mới cho khoa học. - Việc phân loại của 243 chủng vi nấm sẽ là cơ sở dữ liệu quan trọng định hướng cho các nghiên cứu khai thác nguồn gen vi nấm liên quan đến các chủng này. - Các chủng vi nấm thuộc taxa mới sẽ được cung cấp cho các cơ sở nghiên cứu khoa học (trong và ngoài nước) làm chủng chuẩn, chủng tham chiếu cho các nghiên cứu liên quan. - Các kết quả nghiên cứu enzym phân giải lignocelluloza có ý nghĩa định hướng cho các nghiên cứu tiếp theo về hoạt tính enzyme và khả năng ứng dụng các chủng này.

13 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Chương1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ NẤM 1.1 Nấm và các đặc điểm chung của nấm Nấm là nhóm vi sinh vật nhân thật, dị dưỡng, có khả năng hấp phụ chất dinh dưỡng, vách tế bào có chứa chitin và ß-glucan (trong quá trình tiến hóa một số nấm mất chitin, thậm chí là vách trong). Nấm thường là vi sinh vật hiếu khí, nhờ các ty thể. Nấm thiếu các lạp thể, tế bào nấm có nhiều dạng, từ dạng tế bào đơn lẻ, chỉ gồm một tế bào đến cấu tạo dạng sợi, phát triển kéo dài sợi, tạo khuẩn lạc [52].

Với sự đa dạng về hình dạng như vậy đã khiến cho số lượng các loài nấm ước lượng khoảng 1,5 tới 15 triệu loài, trong khi đó chỉ có khoảng 100.000 loài đã được mô tả [38; 68]. Nấm được xếp vào một giới riêng, với những đặc điểm riêng như vách tế bào chứa chitin và glucan; chúng sinh sản theo kiểu nảy chồi hoặc hình thành dạng sợi; chúng không có hệ thống cần thiết để vận chuyển nước và chất dinh dưỡng (xylem, pholem) như đối với thực vật. Tuy nấm được xếp vào một giới riêng như vậy, nhưng chúng cũng có một số điểm chung so với các giới khác: - So với sinh vật nhân thật: tế bào nấm cũng có màng bao quanh lấy nhân, với các chromosome chứa đựng các ADN với các vùng không mã hóa gọi là các intron và các vùng mã hóa gọi là các exon. Riboxom của nấm là loại 80S [51].

- So với thực vật: Nấm không chứa lục lạp và là sinh vật dị dưỡng, đòi hỏi phải có các hợp chất hữu cơ là nguồn năng lượng [51]. - Giống như thực vật, nấm có vách tế bào, tuy nhiên thành phần vách tế bào của nấm chủ yếu là chitin, không phải cellulose như tế bào thực vật. Thêm vào đó, một số loài nấm tiêu biểu có nhân đơn bội haploid, giống như tảo [51]. - So với vi khuẩn, nấm bậc cao và một số loài vi khuẩn có khả năng sản sinh axit amin L-lysine trong quá trình sinh tổng hợp đặc hiệu, gọi là con đường aminoadipate [51].

14 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] ứu về tiến hóa về nấm 1.2 Các nghiên cứu Có rất ít thông tin về sự tiến hóa của nấm do nấm có sự đa dạng ng phong phú, nhưng lại có hình thái đơn gi giản và thiếu các dữ liệu hóa thạch cần thiếết để phân tích [33]. Nghiên cứu tiếnn hóa nnấm dựa vào quan sát các đặc điểm m hình thái, thành phần ph vách tế bào [28], thử nghi ghiệm tế bào học [167], nghiên cứu u siêu cấu c trúc [70], chuyển hóa tế bào [102] và các m mẫu hóa thạch [67]. Nhiều phân hân tích phát sinh loài phần của bức xạ đầu cuối củaa nhóm sinh vật cho thấy giới nấm là mộtt ph v nhân thật (Hình 1.1 Cây phát sinh chủng ng lo loại của sinh vật nhân thật dựa vào trình tự ADNr 18S [167] [1994]đã sử dụng thời gian địa lý để tính toán sự Berbee và Taylor [1994]đ s xuất hiện một cây tiến hóa và đưa ra giảả thuyết về tất của các bậc phân loạii khác nhau trong m ớp đến họ đã liên tục xuất hiện giữa kỷ Cambri tới kỷ cả các bậc phân loại từ lớ Tertiary. Trình tự nucleotit bbị thay thế, biến đổi tỉ lệ thuận với thờii gian, vì vậy v dựa ng nucleotit thay đđổi theo thời gian có thể ước lượng thờii gian tiến vào số lượng ti hóa của nấm [35].

Dựa vào cơ sở này và việc sử dụng thêm các điểm tham chiếu khác, chẳng ch hạn như sự xuất hiện của các mấấu lồi của sợi nấm của nấm hóa thạch, thờii gian tuyệt tuy đối về nguồn gốc củaa nhóm nnấm đã được ước tính [33]. Ba ngành nấm n chính, Zygomycota, Ascomycota và Basidiomycota đư được cho là đãã tách ra từ t 15 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Chytridiomycota khoảng 550 triệu năm trước. Sự phân chia Ascomycota- Basidiomycota xảy ra khoảng 400 triệu năm trước, sau khi thực vật xâm chiếm đất. Nhiều Ascomycetes đã tiến hóa cùng thời đại xuất hiện thực vật hạt kín khoảng 200 triệu năm về trước[34].3 Hệ thống phân loại nấm Có 2 nhóm nấm chính: nấm giả và nấm thật.

Nhóm nấm giả (Chromista) bao gồm: nấm nước (Water moulds), nấm gây bệnh nấm lá thuộc ngành Oomycota.