Nghiên cứu chuyển gen liên quan đến tích lũy asen vào cây thuốc lá

• Tác giả: Nguyễn Thị Thu Dung
• Người hướng dẫn: TS. Lê Thị Bích Thủy
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên cứu chuyển gen liên quan đến tích lũy asen vào cây thuốc lá
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Hà Nội

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tình hình nghiên cứu ô nhiễm kim loại nặng ở trong và ngoài nƣớc
• 1.2. Tình hình ô nhiễm Asen
• 1.3. Sơ lược về Asen
• 1.4. Tình hình ô nhiễm Asen ở Việt Nam
• 1.5. Ảnh hưởng của Asen đến sức khỏe của con người
• 1.6. Xử lý ô nhiễm Asen trong đất
• 1.6.1. Phương pháp xử lý truyền thống
• 1.6.2. Phương pháp sinh học
• 1.7. Cơ sở khoa học của chuyển gen ở thực vật
• 1.7.1. Khái niệm chuyển gen
• 1.7.2. Các phương pháp chuyển gen ở thực vật
• 1.7.2.1. Các phương pháp chuyển gen trực tiếp
• 1.7.2.2. Phương pháp chuyển gen gián tiếp
• 1.7.3. Các hệ thống vector chuyển gen thực vật
• 1.7.3.1. Giới thiệu về vector pCAMBIA1301
• 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu nghiên cứu
• 2.1.1. Chủng vi khuẩn sử dụng trong thí nghiệm
• 2.1.2. Vật liệu sinh học phân tử
• 2.1.3. Vật liệu thực vật
• 2.1.4. Môi trường nuôi cấy
• 2.1.5. Máy móc và thiết bị
• 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Thiết kế vector pCambia1301 mang gen arsC
• 2.2.2. Nuôi cấy và lưu giữ chủng
• 2.2.3. Tách chiết plasmid tái tổ hợp từ tế bào vi khuẩn E.
• 2.2.4. Phương pháp nhân gen đích bằng kỹ thuật PCR
• 2.2.5. Phương pháp điện di trên gel agarose
• 2.2.6. Phương pháp tinh sạch từ bản gel agarose bằng bộ kit của hãng Fermentas (Mỹ)
• 2.2.7. Phương pháp xử lý với enzyme giới hạn
• 2.2.8. Phản ứng ghép nối gen arsC với vector pCAMBIA1301
• 2.2.9. Biến nạp sản phẩm ghép nối gen vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt
• 2.2.10. Kiểm tra chủng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp bằng PCR
• 2.2.11. Kiểm tra chủng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp bằng cắt enzyme giới hạn
• 2.2.12. Phương pháp chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào A. tumefaciens bằng xung điện
• 2.2.13. Phương pháp chuyển gen vào cây thuốc lá thông qua A.
• 2.2.14. Tạo dịch huyền phù vi khuẩn A.
• 2.2.15. Nhiễm khuẩn và đồng nuôi cấy
• 2.2.16. Sàng lọc chồi thuốc lá chuyển gen trên môi trường có kháng sinh chọn lọc
• 2.2.17. Tái sinh cây hoàn chỉnh
• 2.2.18. Ra cây trên môi trường đất : trấu : cát
• 2.2.19. Phương pháp phân tích cây chuyển gen
• 2.2.20. Phương pháp kiểm tra cây chuyển gen bằng PCR
• 2.2.21. Lai Southern blot
• 2.2.22. Thiết kế vector chuyển nạp mang gen arsC
• 2.2.23. Sơ đồ vector pCAMBIA1301-arsC dự định thiết kế
• 2.2.24. Gắn gen arsC vào vector biểu hiện pCAMBIA 1301
• 2.2.25. Biến nạp pCAMBIA1301-arsC vào tế bào khả biến E. coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt
• 3. Kết quả kiểm tra vector pCAMBIA1301 – arsC
• 3.1. Kết quả kiểm tra vector pCAMBIA1301-arsC bằng phản ứng PCR – colony
• 3.2. Kết quả kiểm tra vector pCAMBIA1301-arsC bằng enzyme giới hạn NcoI và Eco72I
• 3.3. Biến nạp vector pCAMBIA1301 – arsC vào vi khuẩn
• 3.4. Tạo cây thuốc lá chuyển gen arsC
• 4. Kiểm tra cây thuốc lá chuyển gen đƣợc trồng ngoài tự nhiên
• 4.1. Kiểm tra cây thuốc lá chuyển gen bằng kỹ thuật PCR
• 4.2. Kết quả kiểm tra cây thuốc lá chuyển gen bằng Southern Blot
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

I. Tổng quan về nghiên cứu chuyển gen tích lũy asen vào cây thuốc lá

Nghiên cứu chuyển gen tích lũy asen vào cây thuốc lá đang trở thành một lĩnh vực quan trọng trong công nghệ sinh học. Cây thuốc lá không chỉ là một mô hình lý tưởng cho nghiên cứu gen mà còn có khả năng phát triển nhanh chóng. Việc chuyển gen arsC từ các loài thực vật có khả năng hấp thụ asen vào cây thuốc lá có thể mở ra hướng đi mới trong việc xử lý ô nhiễm kim loại nặng, đặc biệt là asen. Nghiên cứu này không chỉ giúp cải thiện sức khỏe môi trường mà còn có thể tạo ra các giống cây trồng mới có khả năng chống chịu với ô nhiễm.

1.1. Tình hình ô nhiễm asen và ảnh hưởng đến sức khỏe

Ô nhiễm asen đang trở thành một vấn đề nghiêm trọng ở nhiều quốc gia, trong đó có Việt Nam. Asen có thể gây ra nhiều bệnh tật nghiêm trọng cho con người, bao gồm ung thư và các bệnh về da. Nghiên cứu cho thấy rằng nồng độ asen trong nước và đất ở một số khu vực vượt quá mức an toàn, ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng. Việc tìm kiếm các phương pháp xử lý ô nhiễm asen là rất cần thiết.

1.2. Vai trò của cây thuốc lá trong nghiên cứu chuyển gen

Cây thuốc lá được chọn làm mô hình nghiên cứu vì tính dễ trồng và khả năng phát triển nhanh. Việc chuyển gen arsC vào cây thuốc lá có thể giúp tạo ra các giống cây có khả năng tích lũy asen cao hơn. Điều này không chỉ giúp cải thiện khả năng hấp thụ asen mà còn mở ra cơ hội cho việc ứng dụng trong xử lý ô nhiễm môi trường.

II. Thách thức trong nghiên cứu chuyển gen tích lũy asen

Mặc dù nghiên cứu chuyển gen tích lũy asen vào cây thuốc lá có nhiều tiềm năng, nhưng cũng gặp phải không ít thách thức. Các vấn đề như khả năng chuyển gen thành công, sự ổn định của gen trong cây trồng, và khả năng tích lũy asen trong cây là những yếu tố cần được xem xét kỹ lưỡng. Ngoài ra, việc đảm bảo rằng cây thuốc lá không gây ra tác động tiêu cực đến môi trường cũng là một thách thức lớn.

2.1. Khó khăn trong việc chuyển gen thành công

Quá trình chuyển gen vào cây thuốc lá thường gặp khó khăn trong việc đảm bảo rằng gen được chuyển vào đúng vị trí và hoạt động hiệu quả. Các phương pháp chuyển gen như sốc nhiệt hay điện sinh học đều có những hạn chế riêng. Việc tối ưu hóa các phương pháp này là cần thiết để đạt được kết quả tốt nhất.

2.2. Ảnh hưởng của asen đến sự phát triển của cây

Asen có thể gây độc cho cây, ảnh hưởng đến sự phát triển và sinh trưởng của chúng. Việc nghiên cứu các biện pháp giúp cây thuốc lá phát triển khỏe mạnh trong môi trường có nồng độ asen cao là rất quan trọng. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng một số gen có thể giúp cây chống chịu tốt hơn với asen.

III. Phương pháp chuyển gen vào cây thuốc lá

Để thực hiện nghiên cứu chuyển gen tích lũy asen vào cây thuốc lá, cần áp dụng các phương pháp chuyển gen hiệu quả. Các phương pháp này bao gồm chuyển gen trực tiếp và gián tiếp, sử dụng các vector chuyển gen như pCAMBIA1301. Việc tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy và môi trường cũng rất quan trọng để đảm bảo sự thành công của quá trình chuyển gen.

3.1. Các phương pháp chuyển gen trực tiếp

Phương pháp chuyển gen trực tiếp bao gồm các kỹ thuật như bắn gen và điện sinh học. Những phương pháp này cho phép chuyển gen vào tế bào thực vật một cách nhanh chóng và hiệu quả. Tuy nhiên, tỷ lệ thành công của các phương pháp này thường không cao và cần được cải thiện.

3.2. Phương pháp chuyển gen gián tiếp qua A. tumefaciens

Phương pháp chuyển gen gián tiếp sử dụng vi khuẩn A. tumefaciens để chuyển gen vào cây thuốc lá. Đây là một trong những phương pháp phổ biến và hiệu quả nhất trong nghiên cứu chuyển gen. Việc tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy và thời gian nhiễm khuẩn là rất quan trọng để đạt được kết quả tốt.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu chuyển gen tích lũy asen vào cây thuốc lá đã cho thấy nhiều triển vọng. Các dòng cây thuốc lá mang gen arsC đã được tạo ra và cho thấy khả năng tích lũy asen cao hơn so với cây đối chứng. Những kết quả này không chỉ có ý nghĩa trong nghiên cứu mà còn có thể ứng dụng trong thực tiễn để xử lý ô nhiễm asen trong môi trường.

4.1. Đánh giá khả năng tích lũy asen của cây thuốc lá

Các thí nghiệm đã chỉ ra rằng cây thuốc lá mang gen arsC có khả năng tích lũy asen cao hơn so với cây không mang gen. Điều này cho thấy rằng việc chuyển gen có thể cải thiện khả năng hấp thụ asen của cây, mở ra hướng đi mới trong việc xử lý ô nhiễm.

4.2. Ứng dụng trong xử lý ô nhiễm môi trường

Cây thuốc lá chuyển gen có thể được sử dụng để xử lý ô nhiễm asen trong đất và nước. Việc áp dụng công nghệ này không chỉ giúp cải thiện chất lượng môi trường mà còn có thể tạo ra các giống cây trồng mới có giá trị kinh tế cao.

V. Kết luận và triển vọng tương lai

Nghiên cứu chuyển gen tích lũy asen vào cây thuốc lá đã mở ra nhiều cơ hội mới trong việc xử lý ô nhiễm môi trường. Mặc dù còn nhiều thách thức cần vượt qua, nhưng những kết quả đạt được cho thấy tiềm năng lớn của công nghệ sinh học trong việc cải thiện chất lượng môi trường. Trong tương lai, việc phát triển các giống cây trồng mới có khả năng hấp thụ asen sẽ là một hướng đi quan trọng.

5.1. Tiềm năng phát triển công nghệ sinh học

Công nghệ sinh học có thể giúp tạo ra các giống cây trồng mới có khả năng hấp thụ asen hiệu quả hơn. Việc nghiên cứu và phát triển các phương pháp chuyển gen mới sẽ là chìa khóa để đạt được mục tiêu này.

5.2. Hướng đi mới trong xử lý ô nhiễm

Việc sử dụng cây thuốc lá chuyển gen để xử lý ô nhiễm asen có thể mở ra hướng đi mới trong bảo vệ môi trường. Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình và đánh giá tác động của cây chuyển gen đến hệ sinh thái.