Đặt vấn đề Các vấn đề về ô nhiễm môi trường gây ra bởi các hoạt động công nghiệp và phi công nghiệp của con người mà các quốc gia trên thế giới phải đối mặt đang là một thách thức lớn. Hằng ngày các chất thải của các khu công nghiệp, chất thải sinh hoạt của con người được đưa ra môi trường. Các chất gây ô nhiễm này có thể là kim loại nặng (KLN), các hợp chất dễ cháy, rác thải,… Trong đó, KLN là chất gây ô nhiễm hàng đầu bởi chúng không dễ dàng bị sinh vật phân giải. Một số KLN như Fe, Zn, Cu, Mn, Mo, B,… rất cần cho sinh trưởng và phát triển của thực vật, những KLN này là các nguyên tố dinh dưỡng vi lượng cần thiết không thế thiếu trong quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật.
Tuy nhiên khi những KLN này ở nồng độ quá cao hoặc quá thấp đều bất lợi cho cơ thể sinh vật. Ô nhiễm môi trường bởi các KLN đang là vấn đề cấp thiết hiện nay trên thế giới. Những năm đầu 1970 ở một huyện của Nhật Bản, hàng loạt người bị bệnh “Itai Itai” gây ra đau xương, biến dạng xương và dẫn đến chết do ăn phải gạo có chứa Cd ở mức 0,5-1 mg. Nguyên nhân là do nguồn nước bị nhiễm Cd lại được dùng để tưới tiêu đồng ruộng.
KLN có thể thâm nhập vào môi trường bằng nhiều con đường khác nhau, trong đó chủ yếu là do các hoạt động của con người. Khi thâm nhập vào môi trường chúng có thể gây ô nhiễm nguồn nước và ô nhiễm đất trồng. Những KLN này có khả năng tích tụ ở trong đất, trong động, thực vật, chúng rất khó bị phân giải hay đào thải. Điều đó ảnh hưởng đến sức khỏe của con người khi sử dụng nguồn thức ăn, nước uống ở những vùng bị ô nhiễm.
Ở Việt Nam, việc phát triển kinh tế và mức độ đô thị hóa cao cũng là nguyên nhân dẫn đến sự xuống cấp nghiêm trọng của hệ sinh thái. Ô nhiễm môi trường nhất là KLN ở nước ta đang là một vấn đề đáng lo ngại. KLN xuất phát từ rất nhiều nguồn khác nhau như: các khu công nghiệp, mỏ khai thác kim loại, bãi rác, làng nghề, hoạt động sản xuất nông nghiệp. Hầu hết các kim loại nặng như As, Cd, Zn, 12 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Cu, Pb, Hg.
đều tìm thấy trong các chất thải. Trong đó As và Cd là phổ biến. Ở Hà Nội 40% giếng khoan có hàm lượng Asen lớn hơn mức an toàn nhiều lần. Hiện nay có rất nhiều phương pháp xử lý KLN trong đất như: cơ học, vật lý, hóa học, sinh học,… Tùy thuộc vào đặc điểm tính chất của từng loại đất mà chọn phương pháp cho phù hợp.
Trong đó xử lý đất chứa KLN bằng biện pháp sinh học đang trở thành một hướng đi đầy triển vọng. Làm sạch đất là một quá trình đòi hỏi công nghệ phức tạp và vốn đầu tư cao. Hầu hết các phương pháp hóa học hay vật lý đều rất tốn kém về kinh phí, bị giới hạn về kỹ thuật và hạn chế về diện tích… Những năm gần đây người ta quan tâm rất nhiều đến công nghệ sử dụng thực vật để xử lý môi trường. Việc phát hiện ra một số loại cây có khả năng hấp thụ, tích lũy và chuyển hóa các KLN đã mở ra khả năng sử dụng thực vật để cải tạo ô nhiễm KLN.
Hiện tại có trên 450 loài thực vật có khả năng hấp thụ cao kim loại đã được công bố. Trong đó có các cây như: Cỏ Mần Trầu (Eleusine indica L), cỏ Vetiver (Vetiveria zizanioides L) và dương xỉ (Pteris vittata L), Cải xanh (Brassica juncea), Nghé nước (Polygonum hydropiper),…[2], [3], [59]. Việc nghiên cứu phát triển một số loài thực vật hấp thụ kim loại nặng phải đáp ứng được yêu cầu là giống dễ trồng, có khả năng vận chuyển KLN từ đất lên nhanh, chịu được nồng độ ô nhiễm cao, phát triển nhanh. Nhưng trong thực tế, cây tích lũy KLN thường phát triển chậm, những loài phát triển nhanh lại mẫn cảm với hàm lượng KLN cao.
Một vấn đề khác là nếu dùng cây xuất xứ nơi khác với các cây nơi cải tạo đất sẽ làm ảnh hưởng đến đa dạng sinh học của các cây địa phương. Vì vậy, cách tốt nhất là tạo các cây địa phương có khả năng cải tạo đất để hạn chế nguy cơ bị ảnh hưởng. Để thực hiện được điều này, cần có các hiểu biết sâu hơn về các tương tác hóa sinh học cùng với các thay đổi của thực vật hấp thụ KLN bản địa và phát triển các công trình nghiên cứu cơ bản có thể cung cấp được các giải pháp xử lý đất một cách thân thiện với môi trường. Để góp phần giải quyết vấn đề trên, trong đề tài này chúng tôi tập trung vào sử dụng gen arsC tách được từ một số cây hoang dại sống ở các vùng ô nhiễm cụ thể là cây dương xỉ để chuyển vào cây thuốc lá là cây mô hình rất tốt để nghiên cứu gen hấp thụ Asen.
Việc 13 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com chuyển gen được thực hiện trên cây thuốc lá là đối tượng dễ thao tác, các môi trường tạo mô sẹo và tái sinh cây đã được tối ưu hóa, cây phát triển nhanh thuận tiện cho nghiên cứu. Nếu thành công, cây thuốc lá có thể là đối tượng dùng để xử lý vùng nhiễm KLN. Hoặc có thể ứng dụng quy trình này để tạo các loại cây chuyển gen phù hợp, có khả năng tích lũy loại KLN với từng vùng bị ô nhiễm cụ thể. Trong các công trình đã công bố trong nước chưa thấy có nghiên cứu nào về tách dòng và chuyển gen hấp thụ Asen từ thực vật sống tại vùng ô nhiễm, đây là điểm mới của đề tài.
Để đạt được mục tiêu đề ra ở trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu chuyển gen liên quan đến tích lũy Asen vào cây thuốc lá”. Đây là một hướng nghiên cứu có ý nghĩa khoa học và thực tiễn lớn với mục đích cải tạo môi trường bằng thực vật. Mục tiêu nghiên cứu Tạo cây thuốc lá chuyển gen mang gen arsC có khả năng tích lũy asen. Bước đầu kiểm tra và đánh giá các dòng cây thuốc lá mang gen arsC.
Nội dung nghiên cứu - Biến nạp plasmid tái tổ hợp pCAMBIA1301-arsC vàovi khuẩnA. tumefaciensC58 - Bước đầu tạo cây thuốc lá chuyển gen mang gen arsC. - Đánh giá, kiểm tra các dòng thuốc lá chuyển gen. 14 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHƢƠNG 1.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tình hình nghiên cứu ô nhiễm kim loại nặng ở trong và ngoài nƣớc Nước ngoài Việc nghiên cứu cơ chế chịu KLN ở thực vật bao gồm các quá trình hấp thụ, tích lũy và vận chuyển đã đạt nhiều tiến bộ trên thế giới. Đã có nhiều nghiên cứu về gen liên quan đến hấp thụ và vận chuyển KLN như các gen ZIP 1, ZIP 2, IRT1 (ion-regulated transporter), AtNramp, AtNramp 3 (metal transpoter gene family), liên quan đến cácphytochelatin (PC) – CAD1, GmPCS1 (phytochelatin synthase) [47]và metallotionein (MT) – MT1, MT2 các gen này được thông báo có liên quan đến tích lũy KLN và khá phổ biến ở thực vật. Các gen CAX 1 và CAX 2 (Cation exchanger) ở Arabidopsis cũng đã được nghiên cứu và được xác định tham gia vào vận chuyển KLN [49].
Hiện nay, tại Hàn quốc đã chuyển được nhiều gen có khả năng hấp thụ KLN tập trung vào một dòng cây Dương (Poplar) có khả năng sinh trưởng nhanh, sinh khối lớn. Dòng Dương này không có hoa và hiện đang trong quá trình thử nghiệm trong nhà kính và trên đồng ruộng [66]. Đối với As, gen arsC mã hóa cho enzyme arsenate reductase tham gia vào chuyển hóa As ở dạng arsenate thành arsenit đã được tách từ dòngArabidopsis đột biến. Việc chuyển gen arsC với gen khởi động rubisco từ đậu tương (SRS1p) và gen γ-ECSvới gen khởi động actin của nấm men (ACT2p) vào Arabidopsis đã tạo được cây chuyển gen kháng As hơn cây đối chứng [39].
Một gen cho arsenate reductase khác là PvACR2 đã tách được từ cây dương xỉ Pteris vittata, đây là cây có khả năng siêu tích lũy [41]. Mới đây, một nghiên cứu của chương trình Sinh học tế bào và Phân tử thực vật tại đại học Florida, Gainesville-Mỹ khi chuyển gen PvGRX5 của cây dương xỉ Trung quốc Pteris vittata siêu tích lũy As trong lá vào hai dòng Arabidopsis. Tuy nhiên so sánh cho thấy các dòng Arabidopsis chuyển gen có khả năng chống chịu As cao hơn đáng kể so với với các dòng đối chứng trong môi trường thử nghiệm, nhưng cho thấy một nghịch lý là sự tích lũy As giảm kể cả ở mầm, rễ và toàn bộ cây. Kết quả chỉ ra rằng có thể sử dụng gen PvGRX5 của cây 15 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com dương xỉ Pteris vittata trong giải pháp công nghệ sinh học hiện đại để làm giảm lượng As ở cây trồng [56].
Nghiên cứu về các loài thực vật tích lũy KLN cho thấy, loài dương xỉ Pteris vittata và Dennstaedtia scabra, không những có khả năng tích lũy cao As mà còn có khả năng hấp thu đồng thời các kim loại khác như Mn, Cu, Fe, Zn và Pb. Khi trong đất bị ô nhiễm có hàm lượng As là 3528 mg/kg, thì hàm lượng As trong rễ và thân D. scabra tương ứng là 965.47 mg/kg và 2241. Loài dương xỉ Pteris vittata có khả năng tích luỹ 14.500 ppm As mà chưa có triệu chứng tổn thương.
Loài này sinh trưởng nhanh, có sức chống chịu cao với As trong đất (As > 1500 ppm) và chỉ bị độc ở nồng độ 22.630 ppm qua 6 tuần [54]. Theo các nhà khoa học Mỹ, loài Pteris vittata có thể chứa tới 22 g As/kg lá. Họ cũng đã chứng minh rằng trong vòng 24 giờ, loài dương xỉ này giảm mức As trong nước từ 200 g/l xuống gần 100 lần, dưới mức cho phép của Mỹ (10 g/l) [50], [60].Một công bố mới nhất về thực vật tích lũy As là ở cây dưa chuột (Cucumis sativus) của khoa Kỹ thuật và Khoa học môi trường thuộc trường đại học Ewha Woman - Hàn quốc. Khi so sánh với các cây ngô, lúa mỳ và lúa miến, dưa chuột cho thấy khả năng tích lũy As cao hơn nhiều lần so với 3 loài còn lại [62].
Từ những công trình nêu trên cho thấy, các nhà khoa học trên thế giới đã nghiên cứu về sự tích lũy KLN ở thực vật và sử dụng chúng cho cải tạo môi trường từ những năm cuối thập niên 80. Công nghệ xử lý môi trường nhờ thực vật này được gọi là phytoremediation [53], [65].Cho đến nay, Phytoremediation đã phát triển thành một hướng cải tạo môi trường hiệu quả, an toàn và tiết kiệm.