Nghiên cứu chuyển cấu trúc RNAi vào giống đậu tương DT84 để kháng Soybean Mosaic Virus

Nghiên cứu chuyển cấu trúc RNAi vào giống đậu tương DT84 nhằm tạo dòng cây kháng virus đậu tương mosaic, góp phần nâng cao năng suất cây trồng.

• Người hướng dẫn: GS. Chu Hoàng Mậu
• Trường học: Trường Đại Học Khoa Học - Đại Học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Nghiên cứu chuyển cấu trúc RNAi vào giống đậu tương DT84 phục vụ tạo dòng cây chuyển gen kháng Soybean mosaic virus
• Loại tài liệu: Luận Văn Thạc Sĩ
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Giá trị dinh dưỡng của đậu tương
• 1.2. Đặc điểm sinh học
• 1.3. Tình hình đậu tương Việt Nam

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu chuyển gen kháng virus khảm lá đậu tương DT84

Nghiên cứu chuyển gen kháng virus khảm lá đậu tương DT84 bằng RNAi là một bước tiến quan trọng trong nông nghiệp hiện đại. Đậu tương (Glycine max) là cây trồng có giá trị kinh tế cao, nhưng thường bị ảnh hưởng bởi các loại virus như Soybean mosaic virus (SMV). Việc áp dụng công nghệ RNAi giúp tạo ra giống đậu tương DT84 có khả năng kháng lại virus, từ đó nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm.

1.1. Đậu tương DT84 và vai trò trong nông nghiệp

Giống đậu tương DT84 được trồng rộng rãi tại Việt Nam, có khả năng thích nghi tốt với điều kiện khí hậu. Đậu tương không chỉ cung cấp thực phẩm mà còn cải tạo đất, giúp tăng năng suất cho các cây trồng khác.

1.2. Tình hình bệnh khảm lá đậu tương

Bệnh khảm lá do virus SMV gây ra, ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất đậu tương. Nghiên cứu cho thấy, nếu cây bị nhiễm virus trước khi ra hoa, năng suất có thể giảm tới 40%.

II. Thách thức trong việc kháng virus khảm lá đậu tương

Việc kháng lại virus khảm lá đậu tương gặp nhiều thách thức. Các biện pháp phòng ngừa hiện tại chủ yếu mang tính chất tạm thời và không hiệu quả. Virus SMV có khả năng lây lan nhanh chóng qua côn trùng và các phương pháp canh tác truyền thống không thể kiểm soát triệt để.

2.1. Nguyên nhân gây bệnh và tác động đến năng suất

Virus SMV lây lan qua rệp và các phương pháp cơ học, gây tổn thất lớn cho nông dân. Nghiên cứu chỉ ra rằng, bệnh khảm lá có thể làm giảm chất lượng hạt đậu, ảnh hưởng đến giá trị kinh tế.

2.2. Giới hạn của các biện pháp phòng ngừa hiện tại

Các biện pháp phòng ngừa như phun thuốc trừ sâu chỉ có tác dụng tạm thời. Cần có giải pháp bền vững hơn để bảo vệ cây trồng khỏi virus.

III. Phương pháp nghiên cứu chuyển gen kháng virus khảm lá

Nghiên cứu sử dụng công nghệ RNA interference (RNAi) để tạo ra giống đậu tương DT84 kháng virus. Phương pháp này cho phép đưa đoạn gen của virus vào hệ gen của cây, giúp cây có khả năng tự bảo vệ trước sự tấn công của virus.

3.1. Công nghệ RNAi và ứng dụng trong nông nghiệp

RNAi là một công nghệ tiên tiến giúp điều chỉnh hoạt động gen. Việc áp dụng RNAi trong nông nghiệp đã mở ra hướng đi mới cho việc tạo giống cây trồng kháng bệnh.

3.2. Quy trình chuyển gen vào giống đậu tương DT84

Quy trình bao gồm lây nhiễm A. tumefaciens mang cấu trúc RNAi vào mô nách lá mầm hạt chín của giống đậu tương DT84, sau đó tái sinh in vitro và chọn lọc các dòng cây chuyển gen.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy giống đậu tương DT84 chuyển gen kháng virus có khả năng chống lại virus SMV hiệu quả. Các dòng cây chuyển gen đã được phân tích và xác định sự có mặt của gen chuyển bằng kỹ thuật PCR.

4.1. Hiệu suất chuyển gen và khả năng kháng virus

Nghiên cứu đã xác định được hiệu suất chuyển gen cao, cho phép cây trồng phát triển khỏe mạnh và kháng lại virus. Điều này mở ra cơ hội cho việc sản xuất đậu tương bền vững hơn.

4.2. Ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Giống đậu tương DT84 kháng virus có thể được áp dụng rộng rãi trong sản xuất nông nghiệp, giúp nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm, đồng thời giảm thiểu thiệt hại do bệnh tật.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu chuyển gen kháng virus khảm lá đậu tương DT84 bằng RNAi không chỉ giải quyết vấn đề bệnh tật mà còn mở ra hướng đi mới cho nông nghiệp bền vững. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều lợi ích cho ngành nông nghiệp Việt Nam.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu trong nông nghiệp

Nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển giống cây trồng kháng bệnh, góp phần nâng cao năng suất và chất lượng nông sản.

5.2. Hướng đi mới cho nghiên cứu và phát triển

Cần tiếp tục nghiên cứu và phát triển các giống cây trồng kháng bệnh khác, từ đó tạo ra một nền nông nghiệp bền vững và hiệu quả hơn.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Đậu tương (Glycine max) giữ vai trò chiến lược trong cơ cấu cây công nghiệp ngắn ngày tại Việt Nam nhờ giá trị dinh dưỡng vượt trội với hàm lượng protein đạt từ 38% đến 40% và lipid chiếm 18% đến 20%. Hiện nay, diện tích canh tác đậu tương phân bố tại 7 vùng sinh thái nông nghiệp, trong đó 65% tập trung ở miền Bắc và 35% ở miền Nam. Mặc dù đóng vai trò quan trọng trong việc cải tạo đất thông qua khả năng cố định từ 20 đến 25 kg ure/ha, năng suất đậu tương nội địa vẫn chưa đáp ứng nhu cầu tiêu thụ và nguyên liệu chế biến thức ăn chăn nuôi. Một trong những rào cản sinh học nguy hiểm nhất là bệnh khảm lá do Soybean mosaic virus (SMV) thuộc chi Potyvirus gây ra. Khi cây bị nhiễm virus trước giai đoạn ra hoa, năng suất hạt sụt giảm từ 40% đến 94%, đồng thời làm cho 91% số hạt thu hoạch bị lốm đốm, suy giảm nghiêm trọng chất lượng thương phẩm.

Các biện pháp canh tác truyền thống và hóa chất trừ môi giới truyền bệnh như rệp chỉ mang tính phòng ngừa cục bộ, không thể tiêu diệt virus triệt để. Trước thực trạng đó, công nghệ can thiệp RNA (RNA interference - RNAi) nổi lên như một giải pháp đột phá, cho phép tạo tính kháng chủ động bằng cách đưa cấu trúc gen ức chế của chính virus vào hệ gen cây chủ. Đề tài tập trung nghiên cứu chuyển cấu trúc RNAi mang đoạn gen CPi của virus SMV vào mô nách lá mầm hạt chín của giống đậu tương DT84 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Nghiên cứu được triển khai thực nghiệm tại Khoa Sinh - Kỹ thuật Nông nghiệp thuộc Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên phối hợp cùng Phòng Công nghệ ADN ứng dụng thuộc Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam trong giai đoạn 2013-2015. Kết quả đạt được xác lập nền tảng công nghệ quan trọng, tạo nguồn vật liệu di truyền sạch bệnh phục vụ mục tiêu đạt 350 nghìn ha diện tích cây có dầu theo quy hoạch nông nghiệp quốc gia.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên hai trụ cột lý thuyết sinh học phân tử hiện đại: cơ chế can thiệp RNA (RNAi) và kỹ thuật chuyển gen gián tiếp qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Cơ chế RNAi được khám phá bởi Andrew Fire và Craig Mello vào năm 1998, chứng minh hiện tượng các phân tử RNA sợi đôi (dsRNA) kích hoạt hệ thống phân hủy RNA thông tin (mRNA) đặc hiệu trình tự đích. Trong tế bào thực vật, enzyme Dicer cắt phân tử dsRNA ngoại lai thành các đoạn nhỏ siRNA có kích thước từ 21 đến 25 nucleotide. Chuỗi đơn siRNA sau đó liên kết với phức hệ ức chế phiên mã RISC (RNA-induced silencing complex) và enzyme Argonaute, dẫn đường để cắt đứt chính xác mRNA của virus SMV khi chúng xâm nhiễm, ngăn chặn quá trình dịch mã protein vỏ.

Hệ thống chuyển gen ứng dụng vector nhị thể (binary vector) pK7GW-CPi-SMV tái tổ hợp từ Ti-plasmid của Agrobacterium tumefaciens. Cấu trúc vector mang promoter kép CaMV 35S điều khiển biểu hiện đoạn gen CPi kích thước 294 nucleotide ở dạng kẹp tóc (hairpin RNA), cùng gen chỉ thị chọn lọc kháng kháng sinh Kanamycin và Chloramphenicol. Ba khái niệm cốt lõi chi phối toàn bộ quá trình bao gồm: vùng Poty-coat của gen protein vỏ CP (dài 807 nucleotide mã hóa 267 amino acid), hiện tượng bất hoạt gen sau phiên mã (PTGS), và quá trình phát sinh hình thái đa chồi in vitro từ mô phân sinh nách lá mầm.

Phương pháp nghiên cứu

Vật liệu nghiên cứu chính là giống đậu tương thuần DT84 (nguồn gốc từ tổ hợp lai DT-80/ĐH4 kết hợp chiếu xạ đột biến gamma Co60 trên dòng F3-D333) do Viện Di truyền Nông nghiệp cung cấp, có đặc tính hạt to tròn, năng suất cao nhưng mẫn cảm với bệnh virus. Cỡ mẫu nghiên cứu được thiết kế với tổng số 285 mẫu nách lá mầm biến nạp qua 3 lần lặp lại độc lập, cùng hai lô đối chứng: đối chứng 1 (ĐC1 với 35 mẫu cấy trên môi trường có kháng sinh) và đối chứng 2 (ĐC2 với 82 mẫu cấy trên môi trường không có kháng sinh). Phương pháp chọn mẫu ngẫu nhiên hoàn toàn được áp dụng để đảm bảo độ tin cậy sinh học.

Quy trình thực nghiệm trải qua các mốc thời gian chặt chẽ:

• Hạt chín được khử trùng bằng khí clo trong tủ hút kín suốt 16 giờ liên tục, sau đó nảy mầm từ 4 đến 5 ngày trên môi trường GM chuẩn (3,052 g/l muối B5 bổ sung 20 g/l sucrose và 1 mg/l vitamin B5).
• Tách đôi lá mầm, loại bỏ đỉnh sinh trưởng và gây tổn thương cơ học từ 7 đến 8 lần tại nách lá mầm bằng mũi dao vi phẫu.
• Lây nhiễm mẫu trong dịch huyền phù vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (mật độ quang học OD600 đạt 0,6 đến 1,0) trong 30 đến 40 phút.
• Đồng nuôi cấy trong điều kiện tối ở nhiệt độ 25 độ C trong thời gian 5 ngày trên môi trường CCM bổ sung 0,2 mM acetosyringone, 400 mg/l L-cysteine và 154 mg/l DTT.
• Chọn lọc và cảm ứng tạo chồi qua hai giai đoạn trên môi trường SIM bổ sung 2 mg/l BAP, 500 mg/l Cefotaxim cùng Kanamycin nồng độ tăng dần từ 50 mg/l lên 75 mg/l trong 4 tuần.
• Kéo dài chồi trên môi trường SEM (bổ sung 0,5 mg/l GA3 và 0,1 mg/l IAA) và kích thích ra rễ trên môi trường RM chứa 0,1 mg/l IBA trong 14 đến 20 ngày.
• Phân tích sinh học phân tử bằng phương pháp tách chiết DNA tổng số CTAB (Saghai-Maroof 1984), điện di gel agarose 0,8%, và phản ứng PCR 35 chu kỳ với cặp mồi đặc hiệu SMV-CPi-Fi/SMV-CPi-Ri ở nhiệt độ gắn mồi 57 độ C nhằm xác định sự hiện diện của đoạn gen 294 bp.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình chuyển gen và tái sinh in vitro trên giống đậu tương DT84 đã ghi nhận những chỉ số thực nghiệm rõ ràng qua từng giai đoạn chọn lọc:

• Khả năng cảm ứng tạo đa chồi và kéo dài chồi: Trong tổng số 285 mẫu nách lá mầm được biến nạp với vi khuẩn qua 3 đợt lặp lại, có 144 mẫu cảm ứng tạo cụm chồi thành công (đạt tỷ lệ 50,53%) và 91 mẫu kéo dài chồi trên môi trường chọn lọc kháng sinh Kanamycin (đạt tỷ lệ 31,93%). Ở lô đối chứng ĐC1 (35 mẫu không chuyển gen cấy trên môi trường kháng sinh), 100% mẫu mô bị chết trắng và không tái sinh được chồi nào. Ở lô đối chứng ĐC2 (82 mẫu không kháng sinh), 33 mẫu tạo chồi (40,24%) và 27 mẫu kéo dài bình thường.
• Hiệu quả ra rễ và thích nghi nhà lưới: Từ các chồi sống sót qua hai vòng chọn lọc nghiêm ngặt, có 45 chồi tạo bộ rễ hoàn chỉnh trên môi trường RM (đạt tỷ lệ tạo rễ 49,45% so với số chồi kéo dài). Sau khi đưa 45 cây ra giá thể hỗn hợp trấu hun và cát vàng (tỷ lệ 1:1) trong điều kiện nhà lưới, có 5 dòng cây T0 sinh trưởng phát triển khỏe mạnh, đạt tỷ lệ cây sống sót tự nhiên 1,75% trên tổng số mẫu biến nạp ban đầu.
• Xác thực phân tử bằng PCR: Kết quả điện di sản phẩm PCR từ DNA tổng số của 5 dòng cây T0 cho thấy có 4 trên 5 dòng xuất hiện phân đoạn DNA đặc hiệu kích thước 294 bp tương đồng với đối chứng dương mang plasmid pK7GW-CPi-SMV. Tỷ lệ dòng dương tính đạt 80%, được định danh gồm các dòng: T84-01, T84-02, T84-04 và T84-05.
• Xác định hiệu suất chuyển gen: Hiệu suất biến nạp gen CPi vào giống đậu tương DT84 ở thế hệ T0 được xác định chính xác là 1,40%.

Thảo luận kết quả

Hiệu suất chuyển gen 1,40% ở giống DT84 phản ánh sự tương thích cao của phương pháp sử dụng mô nách lá mầm hạt chín kết hợp lây nhiễm Agrobacterium tumefaciens. So với phương pháp phát sinh phôi soma truyền thống vốn đòi hỏi thời gian nuôi cấy kéo dài tới 8 tháng và nguồn mẫu phụ thuộc nghiêm ngặt vào mùa vụ ra hoa, phương pháp tạo đa chồi từ nách lá mầm rút ngắn chu kỳ tái sinh chỉ còn 3 tháng, đồng thời tăng tính chủ động về nguồn mô cấy quanh năm.

Khi đặt trong tương quan so sánh với các nghiên cứu chuyển gen trên các giống đậu tương trong nước, hiệu suất 1,40% của đề tài tương đương với kết quả chuyển cấu trúc tương tự trên giống ĐT12 (đạt 1,35%), cao hơn rõ rệt so với hiệu suất chuyển gen GmEXP1 chịu hạn (đạt 0,53%), dù thấp hơn dòng DT2008 (đạt 2,24%) hoặc chuyển gen chỉ thị GUS (đạt 4,3% trên DT84). Sự dao động này phụ thuộc chặt chẽ vào cấu trúc phân tử của vector biểu hiện và mức độ mẫn cảm riêng biệt của kiểu gen DT84 đối với chủng vi khuẩn lây nhiễm.

Dữ liệu thực nghiệm của nghiên cứu có thể được trực quan hóa tối ưu thông qua biểu đồ hình cột phân tầng thể hiện tỷ lệ sống sót của mô qua từng bước chọn lọc Kanamycin (từ 50,53% tạo chồi, giảm xuống 31,93% kéo dài, 15,79% ra rễ và 1,75% sống ngoài tự nhiên), kết hợp với bảng đối chiếu hiệu suất chuyển gen giữa các giống đậu tương Việt Nam và ảnh chụp bản gel điện di sản phẩm PCR 294 bp rõ nét. Kết quả này chứng minh cấu trúc hairpin RNAi đã tích hợp thành công vào hệ gen đậu tương, tạo tiền đề vững chắc cho việc biểu hiện cơ chế làm câm lặng gen virus ở các thế hệ sau.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các kết quả đạt được, luận văn đưa ra 4 khuyến nghị then chốt mang tính hành động nhằm hiện thực hóa ứng dụng giống đậu tương kháng virus trong sản xuất nông nghiệp:

• Tối ưu hóa điều kiện lây nhiễm và tái sinh in vitro: Nhóm nghiên cứu thuộc Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên cần tiếp tục khảo sát bổ sung nồng độ chất hoạt hóa vir-gene như acetosyringone (từ 0,2 mM lên 0,4 mM) và các chất chống oxy hóa (L-cysteine, DTT) nhằm giảm thiểu hiện tượng hóa nâu mô nách lá mầm, đặt mục tiêu nâng cao hiệu suất chuyển gen từ 1,40% lên mức 3,0% đến 4,5% trong thời gian 12 tháng.
• Đánh giá khả năng di truyền và tính kháng virus ở các thế hệ tiếp theo: Bộ môn Di truyền - Viện Công nghệ sinh học cần tiến hành thu hạt tự thụ phấn từ 4 dòng T0 dương tính (T84-01, T84-02, T84-04, T84-05) để tạo thế hệ T1, T2; thực hiện lây nhiễm nhân tạo với các chủng virus SMV phổ biến tại Việt Nam nhằm xác định mức độ ức chế bệnh đạt trên 90% trong giai đoạn 18 đến 24 tháng.
• Mở rộng thiết kế vector RNAi kháng đa chủng và đa virus: Các nhà khoa học tại Viện Di truyền Nông nghiệp nên tích hợp các đoạn gen bảo thủ CPi của SMV cùng với Bean yellow mosaic virus (BYMV) trên cùng một vector nhị thể chuyển đổi, tạo ra dòng đậu tương mang tính kháng kép với phổ tác động rộng trong thời hạn 3 năm.
• Hoàn thiện hồ sơ khảo nghiệm an toàn sinh học và phát triển giống: Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn cùng các trung tâm khảo kiểm nghiệm giống cây trồng quốc gia cần sớm ban hành quy chuẩn khảo nghiệm đồng ruộng cách ly đối với cây đậu tương biến đổi gen RNAi, đảm bảo hoàn tất đánh giá rủi ro sinh thái và giá trị canh tác trong vòng 3 đến 5 năm tới.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Công trình nghiên cứu mang giá trị học thuật và thực tiễn cao, đặc biệt phù hợp cho các nhóm đối tượng chuyên ngành:

• Nghiên cứu sinh và học viên cao học chuyên ngành Công nghệ sinh học, Di truyền học thực vật: Tài liệu cung cấp quy trình chuẩn hóa chi tiết từ khâu xử lý mô nách lá mầm, thiết lập môi trường nuôi cấy in vitro đa thành phần đến kỹ thuật phân tích PCR kiểm tra gen chuyển.
• Cán bộ nghiên cứu và chuyên gia chọn tạo giống cây trồng tại các Viện nghiên cứu nông nghiệp: Cung cấp phương pháp luận và dữ liệu thực chứng trong việc ứng dụng công nghệ can thiệp RNA để cải tạo giống cây trồng bản địa có năng suất cao nhưng kháng bệnh kém.
• Giảng viên và sinh viên các trường đại học khối Nông - Lâm - Sinh - Dược: Tài liệu học tập chuyên sâu minh họa sinh động cho học phần Công nghệ tế bào thực vật, Kỹ thuật chuyển gen và Bệnh học phân tử thực vật.
• Doanh nghiệp nông nghiệp công nghệ cao và nhà sản xuất hạt giống: Nguồn tư liệu tham khảo chiến lược trong việc định hướng đầu tư phát triển các dòng giống đậu tương chuyển gen có khả năng chống chịu stress sinh học, hướng tới thương mại hóa sản phẩm sạch.

Câu hỏi thường gặp

• Tại sao giống đậu tương DT84 lại được lựa chọn làm đối tượng biến nạp gen trong nghiên cứu này? Giống DT84 là giống đậu tương thuần nông nghiệp nổi tiếng tại Việt Nam, sở hữu nhiều ưu điểm vượt trội như khả năng sinh trưởng khỏe, chống đổ ngã tốt, hạt to đẹp và cho năng suất cao. Tuy nhiên, giống này lại rất mẫn cảm với bệnh khảm lá do virus SMV, do đó việc chuyển gen kháng bệnh vào DT84 giúp nâng cao trực tiếp giá trị thương phẩm mà vẫn duy trì được các đặc tính nông học quý.

• Đoạn gen CPi được thiết kế trong vector chuyển gen có đặc điểm và kích thước như thế nào? Đoạn gen CPi được thiết kế từ vùng 3' có tính bảo thủ cao thuộc gen mã hóa protein vỏ (CP) của virus SMV. Phân đoạn này có kích thước 294 nucleotide, khi phiên mã trong cây chủ sẽ tạo cấu trúc RNA sợi đôi dạng kẹp tóc, kích hoạt phức hệ RISC phân hủy chính xác RNA của virus gây bệnh khi xâm nhiễm vào mô cây.

• Phương pháp chuyển gen qua nách lá mầm hạt chín có ưu thế gì so với chuyển gen qua phôi soma? Phương pháp nách lá mầm hạt chín có hệ số nhân chồi rất cao, giúp rút ngắn thời gian tạo cây hoàn chỉnh xuống còn 3 tháng thay vì 8 tháng như phôi soma. Đồng thời, nguồn hạt chín luôn chủ động quanh năm, quy trình khử trùng bằng khí clo đơn giản và giảm thiểu tối đa hiện tượng biến dị soma không mong muốn.

• Tại sao phải áp dụng quy trình chọn lọc Kanamycin qua hai giai đoạn với nồng độ tăng dần? Việc sử dụng Kanamycin ở nồng độ 50 mg/l trong vòng 1 giúp loại bỏ các mô không tiếp nhận T-DNA mà không gây ức chế sốc cho tế bào tái sinh. Sau đó nâng lên 75 mg/l ở vòng 2 nhằm sàng lọc triệt để các chồi chuyển gen giả mạo, đảm bảo chỉ những cụm chồi có gen kháng biểu hiện ổn định mới tiếp tục kéo dài và tạo cây hoàn chỉnh.

• Hiệu suất chuyển gen 1,40% ở thế hệ T0 có ý nghĩa như thế nào đối với công tác chọn tạo giống? Hiệu suất 1,40% với 4 dòng dương tính PCR trên tổng số 285 mẫu biến nạp là kết quả thành công và mang tính quy chuẩn đối với cây họ đậu vốn là đối tượng rất khó biến nạp và tái sinh in vitro. Tỷ lệ 80% cây sống sót ngoài tự nhiên mang gen chuyển chứng minh quy trình thao tác có tính ổn định cao, tạo tiền đề vững chắc cho việc nhân dòng thế hệ sau.

Kết luận

• Luận văn đã hoàn thiện thành công quy trình chuyển cấu trúc can thiệp RNA (pK7GW-CPi-SMV) vào mô nách lá mầm hạt chín của giống đậu tương DT84 nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
• Tạo ra 5 dòng cây đậu tương chuyển gen ở thế hệ T0 sinh trưởng thích nghi tốt trong điều kiện tự nhiên tại nhà lưới.
• Kiểm tra phân tử bằng kỹ thuật PCR xác nhận 4 trên 5 dòng mang đoạn gen CPi-SMV đặc hiệu kích thước 294 bp, đạt tỷ lệ dương tính 80% ở các dòng T84-01, T84-02, T84-04 và T84-05.
• Xác định hiệu suất chuyển gen thế hệ T0 đạt 1,40%, khẳng định tiềm năng ứng dụng vượt trội của kỹ thuật phát sinh đa chồi in vitro trong thời gian ngắn 3 tháng.
• Lộ trình nghiên cứu tiếp theo cần tập trung nhân dòng vô tính, phân tích mức độ biểu hiện gen kháng ở thế hệ T1-T2 và tiến hành lây nhiễm nhân tạo trong giai đoạn 12 đến 24 tháng tới.

Công trình là bước đột phá kỹ thuật mở đường cho chiến lược làm chủ công nghệ sinh học nông nghiệp hiện đại. Các viện nghiên cứu, trường đại học và doanh nghiệp giống cây trồng hãy đẩy mạnh hợp tác khảo nghiệm, ứng dụng kết quả này vào thực tiễn sản xuất nhằm tạo ra nguồn giống đậu tương sạch bệnh, nâng cao năng suất và bảo đảm an ninh lương thực quốc gia.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU 1. Đặt vấ đ Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) thuộc họ đậu (Fabaceae), là cây công nghiệp ngắn ngày, có giá trị kinh tế và hàm lượng dinh dưỡng cao, lại dễ trồng. Ngoài ra trồng cây đậu tương còn có tác dụng cải tạo đất nhằm tăng năng suất của các giống cây trồng khác. Ở Việt Nam, cây đậu tương được trồng cả 7 vùng nông nghiệp trên cả nước, trong đó 65% ở miền Bắc và 35% ở miền Nam.

Hiện nay năng suất và sản lượng đậu tương vẫn còn thấp và còn phải nhập khẩu từ các nước khác để đáp ứng nhu cầu tiêu dùng và làm thức ăn cho gia súc [53]. Bên cạnh những yếu tố như hạn hán, kĩ thuật canh tác thì nguyên nhân bệnh do côn trùng, do vi khuẩn và virus gây ra cũng ảnh hưởng không nhỏ đến năng suất, chất lượng đậu tương. Hiện nay người ta đã xác định được khoảng 30 loại bệnh hại ở cây đậu tương, trong đó có các bệnh do nhiễm virus gây tổn thất lớn cho ngành sản xuất đậu tương [13]. Bệnh khảm lá đậu tương là bệnh hại xuất hiện phổ biến ở cây đậu tương do Soybean mosaic virus (SMV) thuộc nhóm Potyvirus gây ra.

Đậu tương bị nhiễm SMV ở thời điểm trước khi ra hoa năng suất có thể giảm tới 40% và 91% hạt đậu thu được có vết lốm đốm, chất lượng kém [35]. SMV có thể lan truyền trong quần thể đậu tương do rệp, hoặc do cơ học. Hiện nay, những biện pháp thường sử dụng để ngăn chặn sự lan truyền của SMV chỉ có tính chất phòng bệnh mà không thể chống lại triệt để. Tuy nhiên, nhờ ứng dụng kỹ thuật RNA interference (RNAi) người ta đã tạo ra cây trồng có khả năng kháng lại bệnh do virus bằng cách đưa ch nh gen của virus gây bệnh vào hệ gen của cây chủ.

Theo hướng nghiên cứu này, nhiều giống cây trồng chuyển gen kháng được các loại bệnh virus khác nhau đã được tạo ra, như cây đậu chuyển gen kháng virus BGMV (bean golden mosaic virus), cây thuốc lá chuyển gen kháng virus khảm dưa chuột (CMV), kháng virus khảm thuốc lá (TMV). Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 4 Xuất phát từ những l do trên, chúng tôi đã lựa chọn đề tài “Nghiên cứu chuyển cấu trúc RNAi vào giống đậu tương DT84 phục vụ tạo dòng cây chuyển gen kháng Soybean mosaic virus”. ục t êu ê c u Tạo được dòng cây chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi của SMV ở giống đậu tương DT84. Nộ du ê c u Nghiên cứu lây nhiễm A.

tumefaciens mang cấu trúc RNAi vào mô nách lá mầm hạt chín của giống đậu tương DT84. Tái sinh in vitro, chọn lọc và tạo dòng cây đậu tương chuyển gen mang cấu trúc RNAi; Phân tích sự có mặt của gen chuyển trong các dòng cây chuyển gen bằng kỹ thuật PCR. Xác định hiệu suất chuyển gen. Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 5 ươ 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.

iá tr dinh dư ng c a đậu tương Hạt đậu tương có thành phần dinh dưỡng cao, hàm lượng protein trung bình khoảng 38-40%, lipid từ 18-20%, giàu vitamin và muối khoáng. Đậu tương là loại hạt duy nhất mà giá trị của nó được đánh giá đồng thời cả protein và lipid. Protein của đậu tương có phẩm chất tốt nhất trong các loại protein thực vật. Hàm lượng protein cao hơn cả ở cá, thịt và cao gấp hai lần hàm lượng protein có trong các loại đậu đỗ khác [14].

Hàm lượng các axit amin có chứa lưu huỳnh như methionin, sistein,… của đậu tương rất gần với hàm lượng của các chất này của trứng. Hàm lượng của cazein, đặc biệt là của lizin rất cao, gần gấp rưỡi trứng. Vì thế mà khi nói giá trị của protein ở đậu tương cao là nói hàm lượng lớn của nó cả sự đầy đủ và cân đối của các loại axit amin cần thiết. Protein của đậu tương dễ tiêu hóa hơn thịt và không có các thành phần tạo nên cholesteron.

Không có các dạng axit uric… Ngày nay, người ta mới biết thêm nó có chứa chất lexithin, có tác dụng làm cho cơ thể trẻ lâu, sung sức, làm tăng thêm tr nhớ và tái sinh các mô, làm cứng xương và tăng sức đề kháng của cơ thể. Hạt đậu tương có chứa hàm lượng dầu béo cao hơn các loại đậu đỗ khác nên được coi đây là cây cung cấp dầu thực vật. Hiện nay các nước có mức sống cao người ta lại ưa chuộng dầu thực vật hơn mỡ động vật. Lipid của đậu tương chứa một tỷ lệ cao các axit béo chưa no có hệ số đồng hóa cao, mùi vị thơm ngon.

Dùng dầu đậu tương thay mỡ động vật có thể tránh được xơ vữa động mạch [14]. Trong đậu tương còn có khá nhiều loại vitamin, đặc biệt là hàm lượng vitamin B1 và B2, ngoài ra còn có các loại vitamin PP, A, E, K, D, C… và Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 6 các loại muối khoáng khác [14]. Do đó mà từ hạt đậu tương người ta đã chế biến ra được trên 600 sản phẩm khác nhau, trong đó có hơn 300 loại thức ăn bằng các phương pháp cổ truyền, thủ công và hiện đại dưới các dạng tươi, khô, lên men… như làm giá, sữa đậu nành, xì dầu… cho đến các sản phẩm cao cấp như đậu tương, socola- đậu tương, bánh kẹo, pate, thịt nhân tạo… ngay như ở nước ta, từ hàng ngàn năm nay đậu tương đã được cung cấp như một phần nhu cầu chất đạm cho người và gia súc, thông qua các món ăn cổ truyền được chế biến từ đậu tương, phần nào tạo ra được sự cân bằng dinh dưỡng trong khẩu phẩn thức ăn cho người dân. Đậu tương có thể chế biến thành giò, chả cho người ăn chay.

Đậu tương còn là vị thuốc để chữa bệnh, đặc biệt là hạt đậu tương đen, có tác dụng tốt cho tim mạch, gan, thận, dạ dày và ruột, làm thức ăn tốt cho người bị bệnh đái tháo đường, thấp khớp, mới ốm dậy hoặc do lao động quá sức. Các chất lexithin và cazein có trong đậu tương có thể dùng riêng hoặc phối hợp để làm thuốc bổ dưỡng. Bột đậu tương sau khi đã ép lấy dầu, bã dùng làm nguyên liệu chế biến thức ăn tinh hỗn hợp giàu đạm để nuôi gia súc, gia cầm theo hướng công nghiệp. Thân lá cây đậu tương có thể dùng làm thức ăn gia súc gia cầm rất tốt.

Ở nhiều nước phát triển người ta còn dùng đậu tương vào các ngành công nghiệp khác như chế biến cao su nhân tạo, sơn, mực in, xà phòng, chất dẻo, tơ nhân tạo, chất đốt lỏng, dầu bôi trơn trong ngành hàng không. Đậu tương còn có khả năng t ch lũy chất đạm của khí trời để tự túc và làm giàu đạm cho đất nhờ sự cộng sinh giữa vi khuẩn nốt sần ở bộ rễ. Trong điều kiện thuận lợi, các vi khuẩn nốt sần này có thể t ch lũy được một lượng đạm tương đương từ 20- 25 kg ure/ha. Do vậy có thể nói mỗi nốt sần như một “nhà máy đạm tý hon”, bởi vậy nên trồng đậu tương không những tốn t phân đạm mà còn làm cho đất tốt lên, có tác dụng tích cực trong việc cải tạo bồi dưỡng đất [14].

Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Đặc đ sinh học Cây đậu tương (Glycine max (L) Merrill) thuộc họ Đậu (Fabaceae), có nguồn gốc từ cây đậu tương hoang dại (Glycine ussuriensis) dạng thân leo, sống hàng năm được phát hiện ở Trung Quốc, Nhật Bản, và Triều Tiên. Chúng có rất nhiều chủng khác nhau, thích nghi với điều kiện khí hậu từ ôn đới đến nhiệt đới [14]. Rễ cây đậu tương khác với rễ cây hoà thảo là có rễ chính và rễ phụ.

Rễ chính có thể ăn sâu 30-50cm và có thể trên 1m. Trên rễ chính mọc ra nhiều rễ phụ, rễ phụ cấp 2, cấp 3 tập trung nhiều ở tầng đất 7-8 cm rộng 30-40 cm2. Trên rễ chính và rễ phụ có nhiều nốt sần. Bộ rễ phân bố nông sâu, rộng hẹp, số lượng nốt sần ít hay nhiều phụ thuộc vào giống, đất đai, kh hậu và kỹ thuật trồng [14].

Trong điều kiện đất chua quá hoặc kiềm quá nốt sần hình thành kém. pH thích hợp cho sự hình thành của nốt sần là 6-7, vì vậy việc lựa chọn đất trồng đậu tương th ch hợp rất quan trọng. Điều kiện dinh dưỡng cũng ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của nốt sần. Nhìn chung bón đầy đủ NPK thì nốt sần phát triển mạnh, bón P2O5 có tác dụng thúc đẩy sự phát triển của nốt sần, còn hiệu quả kali không rõ lắm.

Bón đạm không thích hợp ức chế sự hình thành và phát triển của nốt sần. Nốt sần ở rễ đậu tương thường tập trung ở tầng đất 0-20cm, từ 20-30cm nốt sần ít dần và nếu sâu hơn nữa thì có ít hoặc không có. Nốt sần đóng vai trò chính trong quá trình cố định đạm khí trời cung cấp cho cây. Lượng đạm cung cấp cho cây khá lớn khoảng 30-60 kg/ha.

Nốt sần có thể dài l cm, đường kính 5 - 6 mm, mới hình thành có màu trắng sữa, khi tốt nhất có màu hồng. Quan hệ giữa vi sinh vật nốt sần với cây đậu tương là mối quan hệ cộng sinh: cây cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn hoạt động, ngược lại vi khuẩn lại tổng hợp nitơ tự do của không khí chuyển sang dạng đạm hữu cơ cây có thể sử dụng được [14]. Thân cây đậu tương thuộc thân thảo, có hình tròn, trên thân có nhiều lông nhỏ. Thân khi còn non có màu xanh hoặc màu tím khi về già chuyển sang màu Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 8 nâu nhạt, màu sắc của thân khi còn non có liên quan chặt chẽ với màu sắc của hoa sau này.

Nếu thân lúc còn non màu xanh thì hoa màu trắng và nếu khi còn non thân có màu t m thì hoa có màu t m đỏ. Thân có trung bình 14-15 lóng, các lóng ở ph a dưới thường ngắn, các lóng ở ph a trên thường dài (vì những lóng phía trên phát triển từ ngày 35-40 trở đi vào lúc cây đang sinh trưởng nhanh nên lóng thường dài). Tuỳ theo giống và thời vụ gieo mà chiều dài lóng có sự khác nhau thường biến động từ 3 - 10 cm. Cây đậu tương trong vụ hè thường có lóng dài hơn vụ xuân và vụ đông.

Chiều dài của lóng góp phần quyết định chiều cao của thân. Thân cây đậu tương thường cao từ 0,3 m - 1,0 m.