MỞ ĐẦU 1. Đặt vấ đ Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) thuộc họ đậu (Fabaceae), là cây công nghiệp ngắn ngày, có giá trị kinh tế và hàm lượng dinh dưỡng cao, lại dễ trồng. Ngoài ra trồng cây đậu tương còn có tác dụng cải tạo đất nhằm tăng năng suất của các giống cây trồng khác. Ở Việt Nam, cây đậu tương được trồng cả 7 vùng nông nghiệp trên cả nước, trong đó 65% ở miền Bắc và 35% ở miền Nam.
Hiện nay năng suất và sản lượng đậu tương vẫn còn thấp và còn phải nhập khẩu từ các nước khác để đáp ứng nhu cầu tiêu dùng và làm thức ăn cho gia súc [53]. Bên cạnh những yếu tố như hạn hán, kĩ thuật canh tác thì nguyên nhân bệnh do côn trùng, do vi khuẩn và virus gây ra cũng ảnh hưởng không nhỏ đến năng suất, chất lượng đậu tương. Hiện nay người ta đã xác định được khoảng 30 loại bệnh hại ở cây đậu tương, trong đó có các bệnh do nhiễm virus gây tổn thất lớn cho ngành sản xuất đậu tương [13]. Bệnh khảm lá đậu tương là bệnh hại xuất hiện phổ biến ở cây đậu tương do Soybean mosaic virus (SMV) thuộc nhóm Potyvirus gây ra.
Đậu tương bị nhiễm SMV ở thời điểm trước khi ra hoa năng suất có thể giảm tới 40% và 91% hạt đậu thu được có vết lốm đốm, chất lượng kém [35]. SMV có thể lan truyền trong quần thể đậu tương do rệp, hoặc do cơ học. Hiện nay, những biện pháp thường sử dụng để ngăn chặn sự lan truyền của SMV chỉ có tính chất phòng bệnh mà không thể chống lại triệt để. Tuy nhiên, nhờ ứng dụng kỹ thuật RNA interference (RNAi) người ta đã tạo ra cây trồng có khả năng kháng lại bệnh do virus bằng cách đưa ch nh gen của virus gây bệnh vào hệ gen của cây chủ.
Theo hướng nghiên cứu này, nhiều giống cây trồng chuyển gen kháng được các loại bệnh virus khác nhau đã được tạo ra, như cây đậu chuyển gen kháng virus BGMV (bean golden mosaic virus), cây thuốc lá chuyển gen kháng virus khảm dưa chuột (CMV), kháng virus khảm thuốc lá (TMV). Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 4 Xuất phát từ những l do trên, chúng tôi đã lựa chọn đề tài “Nghiên cứu chuyển cấu trúc RNAi vào giống đậu tương DT84 phục vụ tạo dòng cây chuyển gen kháng Soybean mosaic virus”. ục t êu ê c u Tạo được dòng cây chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi của SMV ở giống đậu tương DT84. Nộ du ê c u Nghiên cứu lây nhiễm A.
tumefaciens mang cấu trúc RNAi vào mô nách lá mầm hạt chín của giống đậu tương DT84. Tái sinh in vitro, chọn lọc và tạo dòng cây đậu tương chuyển gen mang cấu trúc RNAi; Phân tích sự có mặt của gen chuyển trong các dòng cây chuyển gen bằng kỹ thuật PCR. Xác định hiệu suất chuyển gen. Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 5 ươ 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.
iá tr dinh dư ng c a đậu tương Hạt đậu tương có thành phần dinh dưỡng cao, hàm lượng protein trung bình khoảng 38-40%, lipid từ 18-20%, giàu vitamin và muối khoáng. Đậu tương là loại hạt duy nhất mà giá trị của nó được đánh giá đồng thời cả protein và lipid. Protein của đậu tương có phẩm chất tốt nhất trong các loại protein thực vật. Hàm lượng protein cao hơn cả ở cá, thịt và cao gấp hai lần hàm lượng protein có trong các loại đậu đỗ khác [14].
Hàm lượng các axit amin có chứa lưu huỳnh như methionin, sistein,… của đậu tương rất gần với hàm lượng của các chất này của trứng. Hàm lượng của cazein, đặc biệt là của lizin rất cao, gần gấp rưỡi trứng. Vì thế mà khi nói giá trị của protein ở đậu tương cao là nói hàm lượng lớn của nó cả sự đầy đủ và cân đối của các loại axit amin cần thiết. Protein của đậu tương dễ tiêu hóa hơn thịt và không có các thành phần tạo nên cholesteron.
Không có các dạng axit uric… Ngày nay, người ta mới biết thêm nó có chứa chất lexithin, có tác dụng làm cho cơ thể trẻ lâu, sung sức, làm tăng thêm tr nhớ và tái sinh các mô, làm cứng xương và tăng sức đề kháng của cơ thể. Hạt đậu tương có chứa hàm lượng dầu béo cao hơn các loại đậu đỗ khác nên được coi đây là cây cung cấp dầu thực vật. Hiện nay các nước có mức sống cao người ta lại ưa chuộng dầu thực vật hơn mỡ động vật. Lipid của đậu tương chứa một tỷ lệ cao các axit béo chưa no có hệ số đồng hóa cao, mùi vị thơm ngon.
Dùng dầu đậu tương thay mỡ động vật có thể tránh được xơ vữa động mạch [14]. Trong đậu tương còn có khá nhiều loại vitamin, đặc biệt là hàm lượng vitamin B1 và B2, ngoài ra còn có các loại vitamin PP, A, E, K, D, C… và Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 6 các loại muối khoáng khác [14]. Do đó mà từ hạt đậu tương người ta đã chế biến ra được trên 600 sản phẩm khác nhau, trong đó có hơn 300 loại thức ăn bằng các phương pháp cổ truyền, thủ công và hiện đại dưới các dạng tươi, khô, lên men… như làm giá, sữa đậu nành, xì dầu… cho đến các sản phẩm cao cấp như đậu tương, socola- đậu tương, bánh kẹo, pate, thịt nhân tạo… ngay như ở nước ta, từ hàng ngàn năm nay đậu tương đã được cung cấp như một phần nhu cầu chất đạm cho người và gia súc, thông qua các món ăn cổ truyền được chế biến từ đậu tương, phần nào tạo ra được sự cân bằng dinh dưỡng trong khẩu phẩn thức ăn cho người dân. Đậu tương có thể chế biến thành giò, chả cho người ăn chay.
Đậu tương còn là vị thuốc để chữa bệnh, đặc biệt là hạt đậu tương đen, có tác dụng tốt cho tim mạch, gan, thận, dạ dày và ruột, làm thức ăn tốt cho người bị bệnh đái tháo đường, thấp khớp, mới ốm dậy hoặc do lao động quá sức. Các chất lexithin và cazein có trong đậu tương có thể dùng riêng hoặc phối hợp để làm thuốc bổ dưỡng. Bột đậu tương sau khi đã ép lấy dầu, bã dùng làm nguyên liệu chế biến thức ăn tinh hỗn hợp giàu đạm để nuôi gia súc, gia cầm theo hướng công nghiệp. Thân lá cây đậu tương có thể dùng làm thức ăn gia súc gia cầm rất tốt.
Ở nhiều nước phát triển người ta còn dùng đậu tương vào các ngành công nghiệp khác như chế biến cao su nhân tạo, sơn, mực in, xà phòng, chất dẻo, tơ nhân tạo, chất đốt lỏng, dầu bôi trơn trong ngành hàng không. Đậu tương còn có khả năng t ch lũy chất đạm của khí trời để tự túc và làm giàu đạm cho đất nhờ sự cộng sinh giữa vi khuẩn nốt sần ở bộ rễ. Trong điều kiện thuận lợi, các vi khuẩn nốt sần này có thể t ch lũy được một lượng đạm tương đương từ 20- 25 kg ure/ha. Do vậy có thể nói mỗi nốt sần như một “nhà máy đạm tý hon”, bởi vậy nên trồng đậu tương không những tốn t phân đạm mà còn làm cho đất tốt lên, có tác dụng tích cực trong việc cải tạo bồi dưỡng đất [14].
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Đặc đ sinh học Cây đậu tương (Glycine max (L) Merrill) thuộc họ Đậu (Fabaceae), có nguồn gốc từ cây đậu tương hoang dại (Glycine ussuriensis) dạng thân leo, sống hàng năm được phát hiện ở Trung Quốc, Nhật Bản, và Triều Tiên. Chúng có rất nhiều chủng khác nhau, thích nghi với điều kiện khí hậu từ ôn đới đến nhiệt đới [14]. Rễ cây đậu tương khác với rễ cây hoà thảo là có rễ chính và rễ phụ.
Rễ chính có thể ăn sâu 30-50cm và có thể trên 1m. Trên rễ chính mọc ra nhiều rễ phụ, rễ phụ cấp 2, cấp 3 tập trung nhiều ở tầng đất 7-8 cm rộng 30-40 cm2. Trên rễ chính và rễ phụ có nhiều nốt sần. Bộ rễ phân bố nông sâu, rộng hẹp, số lượng nốt sần ít hay nhiều phụ thuộc vào giống, đất đai, kh hậu và kỹ thuật trồng [14].
Trong điều kiện đất chua quá hoặc kiềm quá nốt sần hình thành kém. pH thích hợp cho sự hình thành của nốt sần là 6-7, vì vậy việc lựa chọn đất trồng đậu tương th ch hợp rất quan trọng. Điều kiện dinh dưỡng cũng ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của nốt sần. Nhìn chung bón đầy đủ NPK thì nốt sần phát triển mạnh, bón P2O5 có tác dụng thúc đẩy sự phát triển của nốt sần, còn hiệu quả kali không rõ lắm.
Bón đạm không thích hợp ức chế sự hình thành và phát triển của nốt sần. Nốt sần ở rễ đậu tương thường tập trung ở tầng đất 0-20cm, từ 20-30cm nốt sần ít dần và nếu sâu hơn nữa thì có ít hoặc không có. Nốt sần đóng vai trò chính trong quá trình cố định đạm khí trời cung cấp cho cây. Lượng đạm cung cấp cho cây khá lớn khoảng 30-60 kg/ha.
Nốt sần có thể dài l cm, đường kính 5 - 6 mm, mới hình thành có màu trắng sữa, khi tốt nhất có màu hồng. Quan hệ giữa vi sinh vật nốt sần với cây đậu tương là mối quan hệ cộng sinh: cây cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn hoạt động, ngược lại vi khuẩn lại tổng hợp nitơ tự do của không khí chuyển sang dạng đạm hữu cơ cây có thể sử dụng được [14]. Thân cây đậu tương thuộc thân thảo, có hình tròn, trên thân có nhiều lông nhỏ. Thân khi còn non có màu xanh hoặc màu tím khi về già chuyển sang màu Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 8 nâu nhạt, màu sắc của thân khi còn non có liên quan chặt chẽ với màu sắc của hoa sau này.
Nếu thân lúc còn non màu xanh thì hoa màu trắng và nếu khi còn non thân có màu t m thì hoa có màu t m đỏ. Thân có trung bình 14-15 lóng, các lóng ở ph a dưới thường ngắn, các lóng ở ph a trên thường dài (vì những lóng phía trên phát triển từ ngày 35-40 trở đi vào lúc cây đang sinh trưởng nhanh nên lóng thường dài). Tuỳ theo giống và thời vụ gieo mà chiều dài lóng có sự khác nhau thường biến động từ 3 - 10 cm. Cây đậu tương trong vụ hè thường có lóng dài hơn vụ xuân và vụ đông.
Chiều dài của lóng góp phần quyết định chiều cao của thân. Thân cây đậu tương thường cao từ 0,3 m - 1,0 m.