MỞ ĐẦU Xoan ta (Melia azedazach L.) là loài cây đa tác dụng, có giá trị cao. Xoan ta mục đích chủ yếu là lấy gỗ dùng trong trang trí nội thất, xây dựng, điêu khắc. Lá xoan ta còn đƣợc dùng làm phân xanh, thuốc trừ sâu, chữa trị các bệnh ngoài da nhƣ ghẻ, các vết bỏng; than củi xoan ta cho nhiệt lƣợng cao. Do đó, xoan ta đƣợc khuyến khích trồng và mở rộng diện tích.
Tuy nhiên, trong tự nhiên cây xoan ta có tốc độ sinh trƣởng khá chậm, sau 12 - 15 năm mới có thể khai thác gỗ. Vì vậy, nghiên cứu tạo ra các dòng xoan ta biến đổi gen sinh trƣởng nhanh đang là một hƣớng nghiên cứu mới và thiết thực đáp ứng nhu cầu sản xuất. Đến nay, có hai hƣớng chính đang đƣợc áp dụng: (i) chuyển các gen liên quan đến sinh tổng hợp chất điều hòa sinh trƣởng dạng hoạt động; (ii) chuyển các gen liên quan đến việc nâng cao hiệu quả sử dụng nitơ, phốt pho, … Trong đó chuyển gen liên quan đến quá trình đồng hóa nitơ đang đƣợc đánh giá cao với nhiều triển vọng. Gen cytosolic glutamine synthetase (GS1) mã hóa cho octamer protein/enzyme glutamine synthetase (GS; EC 6.2) là một enzyme chìa khóa tham gia vào quá trình sinh tổng hợp glutamine từ glutamic acid và NH3.
Đồng thời protein GS còn tham gia vào quá trình tái đồng hóa amoni giải phóng ra từ quá trình quang hô hấp và các quá trình trao đổi chất khác từ đó tăng cƣờng khả năng hấp thu và tái sử dụng hiệu quả nguồn nitơ. Chuyển gen GS1 vào cây trồng bƣớc đầu cũng đã thu đƣợc kết quả rất khả quan về cải thiện khả năng sinh trƣởng của cây trồng. Cho đến nay đã có nhiều công trình trong và ngoài nƣớc nghiên cứu về tái sinh cây xoan ta, tuy nhiên các nghiên cứu này mới chỉ tập trung vào việc tái sinh in vitro phục vụ nhân giống vô tính, chọn lọc biến dị. Chính bởi những lí do này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu kỹ thuật chuyển gen GS1 vào cây xoan ta (Melia azedarach) tam bội bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens” với mục tiêu cụ thể nhƣ sau: + Tạo đƣợc lƣợng mẫu mô sẹo đủ lớn để làm nghiên cứu tiếp theo.
+ Thử nghiệm chuyển gen GS1 vào Xoan ta tam bội từ vật liệu mô sẹo. 1 Vũ Thị Khánh Hòa - QH.CH LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com + Xác định đƣợc các dòng Xoan ta tam bội chuyển gen GS1 thông qua sàng lọc kháng sinh kanamycin và phân tích sự có mặt của gen bằng các kỹ thuật sinh học phân tử. 2 Vũ Thị Khánh Hòa - QH.CH LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Giới thiệu chung về cây xoan ta 1.
Nguồn gốc và phân bố của cây xoan ta Cây xoan ta (Melia azedarach. juss miêu tả đầu tiên năm 1830, có nguồn gốc ở Ấn Độ, miền nam Trung Quốc và Úc. Cây xoan ta thuộc loài M. azedarach, chi Melia, họ Meliaceae, bộ Bồ hòn (Sapindales), ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) [38].
Cây Xoan ta hay còn đƣợc gọi với các tên khác: xoan nhà, xoan trắng, sầu đông, … Họ Meliaceae có khoảng 50 chi và 550 loài, phân bố tại các khu vực nhiệt đới và bán nhiệt đới. Ở Việt Nam, xoan ta đƣợc trồng thành rừng hoặc phân tán ở hầu hết các tỉnh từ Bắc tới Nam, từ đồng bằng, trung du đến miền núi, mọc tự nhiên nhiều ở các vùng biên giới Việt Lào [39]. Đặc điểm hình thái của cây xoan ta Xoan ta là cây gỗ, chiều cao của cây trƣởng thành từ 20 đến 25 m. Cây xoan ta là cây thân thẳng có các đặc điểm: tán lá thƣa; vỏ ngoài màu nâu xám, nứt hoặc rạn dọc, lúc non thƣờng có đốm xếp vòng quanh thân; cành non có lông; lá kép lông chim lẻ 2 - 3 lần, mọc cách, lá nhỏ hình mũi mác, cuống lá có lông.
Cụm hoa xoan ta hình chùy mọc ở nách lá, hoa đều, lƣỡng tính, màu tím nhạt, có mùi thơm hắc, bầu nhụy có 5 - 6 ô. Quả xoan ta là dạng quả hạch dài 1 - 2 cm, chín vào mùa thu và sang mùa xuân quả mới rụng, khi chín quả có màu vàng, vỏ trong hóa gỗ cứng có 5 - 6 ô, mỗi ô chứa một hạt [21, 32][2]. Hạt xoan ta có hình thái và kích thƣớc giống nhƣ hạt lúa, phôi hạt có hai lá mầm và đƣợc bao bọc bởi hạt cứng màu đen. 3 Vũ Thị Khánh Hòa - QH.CH LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.
Hình thái cây xoan ta A. Đặc điểm sinh thái của cây xoan ta Cây xoan ta sống đƣợc trên nhiều loại đất khác nhau nhƣng cây thích hợp sống ở nơi có độ phì nhiêu, đất tơi xốp và độ ẩm cao nhƣ các loại đất đá vôi, đá kiềm, đất cát pha, đất phù sa ven sông, suối [33]. Cây xoan ta có thể chịu đƣợc trong điều kiện mặn, lƣợng muối trong đất từ 0,4 - 0,5%. Cây xoan ta không thích hợp những nơi đất bạc màu, khô hạn và ngập úng.
Trong điều kiện đất cằn cỗi, ngập nƣớc cây sinh trƣởng kém. Cây xoan ta ƣa khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng, ẩm có hai mùa rõ rệt và chịu đƣợc giá lạnh. Lƣợng mƣa càng nhiều thì cây mọc càng tốt, rụng lá mùa khô, khi có mƣa phùn thì cây bắt đầu nẩy lộc, ra hoa. Xoan ta là cây tiên phong, ƣa ánh sáng hoàn toàn, tái sinh rất mạnh trên đất bỏ hoá sau nƣơng rẫy; ở độ cao trên 1000 m so với mực nƣớc biển cây giảm khả năng sinh trƣởng [3].
Giá trị sử dụng của cây xoan ta Cây xoan ta trồng chủ yếu để lấy gỗ, gỗ xoan ta thuộc nhóm VI, có lõi màu hồng hoặc nâu nhạt, dác xám trắng, gỗ nhẹ và mềm. Loại gỗ này có đặc điểm chịu nhiệt, chịu nén, chịu lực tốt. Gỗ có khả năng chống đƣợc mối mọt và ít bị cong vênh hay bị nứt nẻ. Trong xây dựng hay thiết kế nội thất, gỗ xoan ta sau khi ngâm dƣới 4 Vũ Thị Khánh Hòa - QH.CH LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com nƣớc trong thời gian từ sáu đến mƣời hai tháng giảm khả năng bị mối mục và vỡ [4].
Do đó gỗ xoan ta có giá trị kinh tế cao và đang rất đƣợc ƣa chuộng trên thị trƣờng. Gỗ xoan ta đƣợc dùng đóng nhiều đồ dùng sinh hoạt trong gia đình nhƣ cửa gỗ, bàn ghế, tủ bếp. Hiện nay gỗ xoan ta còn đƣợc dùng làm ván lót sàn, kệ bếp, đồ nội thất cao cấp hay gỗ xoan đƣợc dùng làm cột, kèo trong xây dựng nhà gỗ. Ngoài mục đích chủ yếu là lấy gỗ, các bộ phận khác của cây xoan ta cũng đều có nhiều công dụng và ứng dụng trong đời sống thực tế.
Lá xoan ta đƣợc sử dụng làm phân xanh, thuốc trừ sâu. Lá non và vỏ cây có thể dùng để chiết xuất tinh dầu. Quả xoan ta độc nên đƣợc dùng làm thuốc sát trùng. Hiện nay lá và quả xoan ta còn đƣợc dùng làm nguyên liệu sản xuất thuốc trừ sâu sinh học.
Than của cây xoan ta đƣợc đƣợc dùng làm thuốc súng hay các hoạ sĩ thƣờng sử dụng để vẽ tranh. Đặc biệt, trong cây xoan ta chứa chất theraupic có tác dụng diệt côn trùng [24]. Một số hợp chất triterpenoid trong cây xoan ta đƣợc sử dụng trong sản xuất thuốc ức chế một số loại ung thƣ ở ngƣời [29, 45, 46]. Đặc biệt, cây xoan ta còn đƣợc tận dụng trồng trên đất trống, đồi trọc với mục đích cải tạo đất, góp phần hạn chế sự rửa trôi, xói mòn ở vùng đầu nguồn, tạo việc làm và góp phần xóa đói giảm nghèo cho ngƣời dân miền núi.
Đây là một trong những mục tiêu lớn trong chiến lƣợc phát triển lâm nghiệp ở nƣớc ta. Trong điều kiện hiện nay, trƣớc tình hình ngày càng xấu đi của môi trƣờng thì xoan ta là một loài rất có tiềm năng trồng trọt và khai thác trong tƣơng lai, đặc biệt với các giống xoan ta chuyển gen nâng cao tính chống chịu cũng nhƣ chất lƣợng gỗ. Các nghiên cứu cải tạo giống xoan ta Theo QĐ số 16/2005/QĐBNN ngày 15/5/2005 của Bộ trƣởng Bộ NN&PTNT, cây xoan ta đứng đầu trong danh mục cây trồng đƣợc ƣu tiên phát triển bởi nhiều ƣu điểm: cây xoan ta phân bố rộng từ Bắc đến Nam, là cây mọc nhanh,có tốc độ sinh trƣởng phát tốt trên các loại đất đồi có hàm lƣợng dinh dƣỡng thấp, là cây chịu hạn, tái sinh hạt hoặc phục hồi sau nƣơng rẫy, có nhiều tác dụng và giá trị kinh tế cao nên nhân dân ta thƣờng gây trồng phổ biến. Tuy nhiên ngày nay xã hội 5 Vũ Thị Khánh Hòa - QH.CH LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ngày càng phát triển dẫn đến diện tích đất thu hẹp, giảm số lƣợng cây xoan ta.
Bên cạnh đó, trong tự nhiên loài cây này sinh trƣởng chậm, từ mƣời hai đến mƣời lăm năm mới thu đƣợc gỗ. Vì vậy các nghiên cứu cải tạo giống xoan ta sinh trƣởng nhanh, rút ngắn thời gian thu lấy gỗ là việc làm vô cùng cần thiết. Các nghiên cứu về xoan ta trên thế giới Trong những năm gần đây, các nghiên cứu trên đối tƣợng xoan ta phần lớn tập trung vào nhân giống in vitro, chọn lọc cây trội nhằm phục vụ sản xuất cung cấp giống cây lâm nghiệp hay các nghiên cứu ứng dụng chiết xuất hoạt chất của xoan ta sản xuất các chế phẩm sinh học. Các nghiên cứu về tạo lập các dòng xoan ta mới cụ thể nhƣ dòng xoan ta chuyển gen (GS1, GA20, 4CL1…), dòng xoan ta tam bội không nhiều.
Một số nghiên cứu kể đến nhƣ: Sharry và cộng sự (2006) đã tiến hành nghiên cứu tái sinh in vitro xoan ta thông qua cảm ứng tạo phôi soma, tỉ lệ phôi tái sinh cao đạt 93% và tỉ lệ cây sống khi đƣa ra trồng ở nhà lƣới là 100% [40]. Indieka và cộng sự (2007) nghiên cứu tái sinh xoan ta thông qua phôi soma, sử dụng phôi hạt và mảnh lá mầm từ cây mầm in vitro để tái sinh cây, mẫu cấy đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng cơ bản MS có bổ sung BAP; NAA và 2,4-D. Sau 4 tuần nuôi cấy có trên 60% mẫu cây cảm ứng tạo phôi soma [25]. Mroginski và cộng sự (2013) đã nghiên cứu nhân giống cây xoan ta từ chồi nách.
Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra: chồi tái sinh tốt nhất trên môi trƣờng MS có bổ sung 0,5 mg/l BAP, 0,1 mg/l GA và ra rễ trên môi trƣờng 0,1 mg/l IBA [31].